宮頸癌及癌前病變患者高危型HPV16感染與HLA—Ⅰ表達的關系

鐵煒煒　葛芬芬

[摘要] 目的 探討宮頸癌及癌前病變患者高危型人乳頭狀瘤病毒16（HPV16）感染與人類白細胞抗原Ⅰ（HLA-Ⅰ）表達的關系。 方法 選取2014年4月～2016年4月我院行手術切除術或婦科檢查的123例宮頸病變患者為研究對象，利用聚合酶鏈式反應（PCR）檢測患者HPV陽性檢出率，采用免疫組織化學S-P方法檢測組織中HLA-Ⅰ蛋白表達水平，分析HLA-Ⅰ與宮頸癌及癌前病變患者高危型HPV16感染之間的關系。 結果 宮頸炎組織中HPV16陽性檢出率為8.33%，明顯低于宮頸內上皮瘤變（CIN）組織中HPV16陽性檢出率（31.25%），差異有統計學意義（P<0.05），CIN組織中HPV16陽性檢出率為31.25%，明顯低于宮頸鱗癌（CSCC）組織中陽性檢出率（79.10%）（P<0.05）；宮頸炎組織中HLA-Ⅰ蛋白陽性表達率為95.83%，明顯高于CIN組織陽性表達率（40.63%）（P<0.05），CIN組織中HLA-Ⅰ蛋白陽性表達率為40.63%，明顯高于CSCC組織中陽性表達率（19.40%）（P<0.05）；宮頸癌組織中HLA-Ⅰ蛋白陽性表達率與宮頸癌組織分化、臨床分期以及淋巴結轉移密切相關（P<0.05）；相關性分析結果顯示，HPV16感染與HLA-Ⅰ蛋白表達呈顯著負相關（r=-0.748，P<0.05）。 結論 HLA-Ⅰ表達及高危型HPV16感染與宮頸病變進展為宮頸癌密切相關，且HLA-Ⅰ蛋白表達與HPV16感染呈明顯負相關。

[關鍵詞] 宮頸癌；癌前病變；人乳頭狀瘤病毒16；人類白細胞抗原Ⅰ

[中圖分類號] R737.34 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2017）12-0066-04

[Abstract] Objective To investigate the relationship between high-risk human papillomavirus 16（HPV16） infection and human leukocyte antigen Ⅰ（HLA-Ⅰ） expression in patients with cervical cancer and precancerous lesions. Methods A total of 123 patients with cervical lesions who underwent surgical resection or gynecological examination in our hospital from April 2014 to April 2016 were selected. The positive detection rate of HPV in patients was detected by polymerase chain reaction（PCR）. Immunohistochemistry S-P method was used to detect the expression of HLA-Ⅰprotein in tissues. And the relationship between HLA-Ⅰand HPV16 infection in patients with cervical cancer and precancerous lesions was analyzed. Results The positive detection rate of HPV16 in cervicitis tissues was 8.33%， which was significantly lower than that in cervical intraepithelial neoplasia（31.25%）， and the difference was statistically significant（P<0.05）. The positive rate of HPV16 in CIN tissues（31.25%） was significantly lower than that in cervical squamous cell carcinoma（CSCC） tissues（79.10%） （P<0.05）. The positive expression rate of HLA-Ⅰprotein in cervicitis tissue was 95.83%， which was significantly higher than that in CIN tissue （40.63%）（P<0.05）. The positive expression rate of HLA-Ⅰprotein in CIN tissues （40.63%） was significantly higher than that in CSCC tissues（19.40%）（P<0.05）. The positive expression rate of HLA-Ⅰprotein in cervical cancer was closely related to the differentiation， clinical stage and lymph node metastasis of cervical cancer tissues（P<0.05）. Correlation analysis showed that HPV16 infection was significantly negatively correlated with HLA-Ⅰprotein expression（r=-0.748， P<0.05）. Conclusion HLA-Ⅰ expression and high-risk HPV16 infection are closely related to the progression of cervical lesions to cervical cancer， and HLA-Ⅰprotein expression is negatively correlated with HPV16 infection.

[Key words] Cervical cancer； Precancerous lesions； Human papillomavirus 16； Human leukocyte antigenⅠ

宮頸癌是臨床上女性最為常見的惡性腫瘤之一[1]，是全球范圍內僅次于乳腺癌的女性第二大惡性腫瘤[2]。近年來，我國女性宮頸癌發病率呈現明顯增長趨勢，嚴重威脅了我國女性的身體健康及生命安全[3]。早期診斷并及時采取治療措施對臨床治療宮頸癌具有重要意義，但目前由于宮頸癌發病機制尚未完全清楚，臨床仍缺乏特效性診斷及治療藥物[4]。本研究旨在探討宮頸癌及癌前病變患者高危型人乳頭狀瘤病毒16（human papillomavirus 16，HPV16）感染與人類白細胞抗原Ⅰ（human leukocyte antigen Ⅰ， HLA-Ⅰ）表達的關系，試圖為宮頸癌早期診斷及闡明宮頸癌發病機制提供一定理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2014年4月～2016年4月我院行手術切除術或婦科檢查的123例宮頸病變患者為研究對象，所有患者臨床資料齊全，且術前均未接受任何放化療及激素治療，未合并其他惡性腫瘤性疾病，年齡30～64歲，平均（41.57±5.32）歲，經病理學診斷，宮頸炎24例，宮頸內上皮瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）32例，宮頸鱗癌（cervical squamous cell carcinoma，CSCC）67例。本研究經本院倫理委員會批準進行，標本采集符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》。

1.2主要試劑

氯仿、異丙醇、異戊醇、DNA純化試劑盒、PCR試劑盒，均購于上海生工公司；S-P試劑盒、DAB顯色試劑盒，均購于北京中杉金橋技術公司；鼠抗人HLA-Ⅰ單克隆抗體、廣譜型二抗，購于美國Cruz公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取及HPV16陽性擴增 采用酚/氯仿抽提法提取新鮮標本組織總DNA，利用DNA純化試劑盒進行DNA純化。采用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR），以β-actin擴增陽性的DNA為模板進行HPV16片段擴增，所有引物由上海生工合成。具體操作嚴格按照PCR擴增試劑盒進行。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測HPV16陽性情況，以452bp處出現擴增產物為HPV陽性，表示組織受HPV感染，若無則為陰性，表示無HPV感染。引物序列見表1。

1.3.2 免疫組化方法檢測HLA-Ⅰ蛋白表達 所取標本經10%甲醛固定，石蠟包埋，制作厚度為4 μm的石蠟切片；采用免疫組化S-P（streptavidin-perosidase）方法，二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，采用S-P試劑盒檢測石蠟切片中HLA-Ⅰ表達，用已知陽性切片作為陽性對照，PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，具體操作嚴格按照試劑盒使用說明進行。

1.4 S-P結果判定

以胞膜/胞醬染色呈現棕黃色顆粒為陽性表達。高倍鏡下觀察，以細胞染色強度與陽性細胞所占百分比評分乘積進行統計學分析，評分標準見表2[5]。以0～2分為陰性，標記為（-）；≥3分為陽性，標記為（+）。

1.5 統計學分析

采用統計學軟件SPSS 19.0進行數據統計分析，計數資料采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman秩相關檢驗，檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HPV16在不同宮頸病變組織中檢出情況比較

宮頸炎組織中HPV16陽性檢出率為8.33%，明顯低于CIN組織中HPV陽性檢出率（31.25%），差異有統計學意義（P<0.05），CIN組織中HPV陽性檢出率為31.25%，明顯低于CSCC組織中陽性檢出率（79.10%）（P<0.05）。見表3。

2.2 HLA-Ⅰ蛋白在不同宮頸病變中的表達情況比較

宮頸炎組織中HLA-Ⅰ蛋白陽性表達率為95.83%，明顯高于CIN組織陽性表達率（40.63%）（P<0.05），CIN組織中HLA-Ⅰ蛋白陽性表達率為40.63%，明顯高于CSCC組織中陽性表達率（19.40%）（P<0.05）。見表4。

2.3 HLA-Ⅰ蛋白表達與宮頸癌臨床病理特征之間的關系

宮頸癌組織中HLA-Ⅰ蛋白表達與患者年齡無相關性（P>0.05），宮頸癌低分化組織中HLA-Ⅰ蛋白陽性表達率為27.91%，明顯高于高分化組織陽性表達率（4.17%）（P<0.05）；宮頸癌臨床分期Ⅰ期組織中HLA-Ⅰ蛋白陽性表達率為40.00%，明顯高于臨床分期Ⅱ期、Ⅲ期陽性表達率（12.50%、6.67%）（P<0.05），臨床分期Ⅱ期、Ⅲ期組織中HLA-Ⅰ蛋白陽性表達率比較，差異無統計學意義（P>0.05）；宮頸癌無淋巴結轉移組織中HLA-Ⅰ蛋白陽性表達率為23.53%，明顯高于有淋巴結轉移組織陽性表達率（3.85%）（P<0.05）。見表5。

2.4 HPV16與HLA-Ⅰ的相關性

采用Spearman秩相關性分析結果可見，HPV16感染與HLA-Ⅰ蛋白表達呈顯著負相關（r=-0.748，P<0.05），隨HPV感染率升高，HLA-Ⅰ蛋白陽性表達率呈明顯下降趨勢（P<0.05）。見圖1。

3 討論

宮頸癌在我國發病率位居女性生殖道惡性腫瘤之首。據世界衛生組織統計[6]，全球范圍內，每年新增宮頸癌發病病例約50萬例，而我國發病病例可達14萬。我國宮頸癌發病年齡多見于35歲之后，以45～50歲為高發。臨床研究證實[7]，早期宮頸癌患者治愈率明顯高于晚期者，但由于現有診斷技術主要依賴于宮頸癌明顯癥狀，大部分患者特征性臨床癥狀出現較晚，嚴重影響了宮頸癌的早期預警及有效診斷，導致許多患者失去治療最佳時機。目前，尋找新型早期診斷腫瘤標志物是宮頸癌治療亟待解決的關鍵問題[8]。

目前，宮頸癌發病機制尚未完全清楚，普遍認為其發病取決于病毒、宿主以及環境協同等三方面因素，其中HPV持續性感染是宮頸癌發病最為重要的因素之一[9]。研究表明[10]，HPV持續性感染與宮頸疾病惡化密切相關，是反映宮頸病變嚴重程度的預測指標之一。HPV16是高危型HPV，可影響宿主細胞內基因表達以及正常蛋白質功能，從而改變細胞凋亡、DNA損傷修復以及抗原呈遞等一系列重要機制，促進細胞增長繁殖，誘導細胞逃避免疫監視并誘發腫瘤[11]。大量研究表明[12-13]，高危型HPV16感染與宮頸癌發生發展密切相關。HLA-Ⅰ是由β2-MG輕鏈與糖蛋白重鏈組成的抗原分子，主要功能是將內源性抗原肽呈遞到細胞表面[14]。當機體蛋白酶復合物降解細胞內病毒或者異常蛋白并且產生內源性抗原肽后，HLA-Ⅰ可以在抗原呈遞元件協助下完成抗原肽組裝負載以及提呈，實現CD8+CTL對病毒抗原或自身異常蛋白的識別以及免疫監視，從而起到調節適應性以及天然免疫應答的作用。研究表明[15]，HLA-Ⅰ類基因表達缺失與宮頸癌發病及發展密切相關，與宮頸癌患者生存率下降同樣存在密切關系。因此，本研究旨在探討宮頸癌及癌前病變患者高危型HPV16感染與HLA-Ⅰ表達的關系，為宮頸癌早期診斷及闡明宮頸癌發病機制提供一定理論依據。

本研究結果表明，宮頸炎組織中HPV16陽性檢出率為8.33%，明顯低于CIN組織中HPV16陽性檢出率（31.25%），CIN組織中HPV16陽性檢出率（31.25%）明顯低于CSCC組織中陽性檢出率（79.10%），說明隨宮頸病變程度加深，HPV16感染率呈明顯升高趨勢，CSCC組織中感染率最高，HPV16感染是一個較長的過程，CIN發展成為CSCC期間，HPV16可協助腫瘤細胞影響機體基因表達，幫助腫瘤細胞逃避機體免疫監視以及清除，從而導致腫瘤擴散最終致癌；宮頸炎組織中HLA-Ⅰ蛋白陽性表達率為95.83%，明顯高于CIN組織陽性表達率（40.63%），CIN組織中HLA-Ⅰ蛋白陽性表達率（40.63%）明顯高于CSCC組織中陽性表達率（19.40%），說明隨著宮頸疾病惡性程度加深，HLA-Ⅰ蛋白陽性表達率逐漸減少，嚴重宮頸疾病中存在HLA-Ⅰ表達缺陷，提示HLA-Ⅰ表達缺陷與宮頸癌發生有關，可作為宮頸癌前病變進展成為宮頸癌的腫瘤標記物。宮頸癌組織中HLA-Ⅰ蛋白表達與患者年齡無相關性，但隨宮頸癌組織分化、臨床分期以及淋巴結轉移呈現明顯下降趨勢，說明隨著宮頸癌病情加重，HLA-Ⅰ表達缺陷越為嚴重，HLA-Ⅰ表達缺陷導致腫瘤細胞更易于逃避免疫監視及清除，從而導致疾病進展及轉移。相關性分析結果可見，HPV16感染與HLA-Ⅰ蛋白表達呈顯著負相關，隨HPV16感染率升高，HLA-Ⅰ蛋白陽性表達率呈明顯下降趨勢，即HLA-Ⅰ表達缺陷率明顯升高，推測在宮頸疾病進展中，HPV16可整合到HLA-Ⅰ內，導致HLA-Ⅰ基因發生突變、缺失，導致腫瘤免疫逃逸并最終致癌，其具體作用機制值得進一步深入研究[16-20]，HLA-Ⅰ蛋白表達與宮頸癌臨床病理特征關系方面，本研究結果顯示HLA-Ⅰ蛋白表達與組織分化、臨床分期以及淋巴結轉移等因素存在顯著相關性（P<0.05），這些因素是宮頸癌病變的高危因素，需要引起醫務人員的高度重視。

本研究結果表明，HLA-Ⅰ表達及高危型HPV感染與宮頸病變進展為宮頸癌密切相關，推測HLA-Ⅰ表達缺陷可作為宮頸癌前病變進展為宮頸癌的重要預警標志，HLA-Ⅰ蛋白表達與HPV感染呈明顯負相關，為闡明宮頸癌發病機制提供了一定依據，其具體相互作用機制，有待于進一步深入研究。

[參考文獻]

[1] 趙同香，鄧小虹，韓歷麗. 宮頸癌篩查狀況及評價指標研究進展[J]. 中華疾病控制雜志，2013，17（8）：715-717.

[2] Singh GK，Azuine RE，Siahpush M. Global inequalities in cervical cancer incidence and mortality are linked to deprivation，low socioeconomic status，and human development[J]. International Journal of MCH and AIDS（IJMA），2015，（1）：17-30.

[3] 王臨虹，邱琇，鄭睿敏，等. 我國宮頸癌流行病學狀況及防治策略的回顧與展望[J]. 中國婦幼衛生雜志，2010， （3）：146-149.

[4] 甘露，魏明，尋倩，等. 宮頸癌的靶向藥物治療研究進展[J]. 國外醫藥（抗生素分冊），2015，36（4）：154-156，183.

[5] 劉慧強. 我國宮頸癌流行病學特征和高危因素分析[J]. 中國婦幼保健，2016，（6）：1258-1260.

[6] Ferlay J，Soerjomataram I，Dikshit R，et al. Cancer incidence and mortality worldwide：Sources，methods and major patterns in globocan 2012[J]. International Journal of Cancer，2015，136（5）： E359-E386.

[7] 萬利杰，李小曼，王曉娟，等. 早期宮頸癌患者保留生育功能的治療現狀及研究進展[J]. 臨床合理用藥雜志，2016，9（3）：178-180.

[8] 孫瑤. 宮頸癌的靶向藥物治療研究進展[J]. 現代中西醫結合雜志，2016，25（12）：1366-1368.

[9] 王楠，馬蓉，吳建中，等. 宮頸癌的發病機制、診斷及治療進展[J]. 中國腫瘤外科雜志，2013，5（2）：121-124.

[10] Huh WK，Ault KA，Chelmow D，et al. Use of primary high-risk human papillomavirus testing for cervical cancer screening：Interim clinical guidance[J]. Gynecologic Oncology，2015，136（2）：178-182.

[11] 王莉. 端粒酶與HPV16/18 E6在宮頸病變中的關系及意義[D]. 廣西醫科大學，2014.

[12] 宋曉玲，蔡紅兵. HPV16-E6-DNA對宮頸癌預后預測價值分析[J]. 中華腫瘤防治雜志，2015，22（6）：416-420.

[13] 于云英，張建海，鄒存華，等. 宮頸腺癌組織HPV16/18-E7與Cyclin D1/pRb及ER表達臨床意義分析[J]. 中華腫瘤防治雜志，2014，21（4）：256-259.

[14] 楊科，張冰，吳東，等. 人類白細胞抗原-Ⅰ類基因位點多態性與河南地區兒童急性淋巴細胞白血病相關性研究[J]. 中華實用診斷與治療雜志，2012，26（12）：1152-1154.

[15] 夏小艷，瑪依努爾·尼亞孜. HPV及HLA與宮頸癌關系研究進展[J]. 現代生物醫學進展，2010，10（8）：1566-1569.

[16] 苗小艷，孔繁斗，石敏，等. HPV16/18感染導致宮頸癌的分子機制研究[J]. 中國微生態學雜志，2015，27（10）：1152-1155.

[17] 朱永芹. 宮頸癌前病變及宮頸癌與高危型HPV16，18 DNA關系的探討[J]. 國際醫藥衛生導報，2015，21（4）：480-481.

[18] 許曉燕，邢輝，蘭艷麗，等. 葉酸水平及HPV16感染對婦女發生宮頸癌變的協同作用研究[J]. 實用癌癥雜志， 2016， 31（6）：875-878.

[19] 李英. 宮頸癌相關基因表達與HPV感染的相關性研究[J]. 標記免疫分析與臨床，2016，23（1）：50-53.

[20] 李艷，許玉雯. 高危型HPV感染與宮頸癌前病變及宮頸癌的相關性調查[J]. 中國醫藥指南，2016，14（26）：54.

（收稿日期：2017-02-15）