陽離子脂質體基因載體的穩定性研究

趙軼男，劉 安，付 瑩，張樹彪

(大連民族大學 教育部生物技術與資源利用重點實驗室，遼寧 大連 116605)

陽離子脂質體基因載體的穩定性研究

趙軼男，劉 安，付 瑩，張樹彪

(大連民族大學 教育部生物技術與資源利用重點實驗室，遼寧 大連 116605)

從陽離子脂質體的形態、平均粒徑、粒徑分布、Zeta電位及濁度等方面，考察了季銨鹽型陽離子脂質體CPA14的穩定性。經透射電子顯微鏡檢測，陽離子脂質體呈球形結構，粒徑為100～200 nm。經粒度分析儀檢測，陽離子脂質體平均粒徑為210～260 nm，顆粒分布均勻，Zeta電位為55～90 mV。脂質體在4 ℃條件下存放3個月，外觀無明顯變化，脂質體的濁度變化不大。證實季銨鹽型陽離子脂質體CPA14穩定性良好，適合用作基因載體進行基因轉運。陽離子脂質體與質粒DNA在N:P質量比為3:1時可高效轉染人宮頸癌細胞，與商品轉染試劑DOTAP轉染效率相當。為新型季銨鹽型陽離子脂質體基因載體的構建提供了理論依據。

陽離子脂質體；粒徑；Zeta電位；濁度；轉染效率

在基因治療發展的幾十年里，全世界啟動了超過1 500個基因轉染的基因治療臨床試驗。1990年美國國立衛生研究院采用基因治療方法對腺苷脫氨酶缺陷癥進行治療，首次將基因治療應用到臨床并取得了成功[1]。2000年法國采用基因治療方法成功治療聯合免疫缺陷綜合癥[2]，從此證實了基因治療策略的有效性。基因治療要得到進一步的發展，必須獲得具有靶向性的高效的基因導入系統。陽離子脂質體是目前研究最透徹、技術最成熟、應用最廣泛的非病毒基因載體系統，具有制備容易、無免疫原性、緩釋性能好、外源基因容納量不受限制等優點[3]。但由于其體內基因表達持續時間短，轉染效率低等問題，限制了陽離子脂質體基因載體的臨床應用。而陽離子脂質體的穩定性是導致這些問題的重要因素之一。脂質體膜是動態膜，磷脂分子間不斷交換位置，脂質體顆粒可自發聚集、沉降，造成脂質體的不穩定[4]。而陽離子脂質體的穩定性能延長陽離子脂質體載體的體內循環時間，延緩藥物的釋放，為持續靶向給藥提供方便，能獲得良好的治療效果[5-6]。

本文選取課題組合成的季銨鹽型陽離子類脂CPA14與助類脂二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)結合制備陽離子脂質體，其中CPA14的化學結構如圖1。通過激光粒度儀測定脂質體的平均粒徑、粒徑分布及Zeta電位；通過透射電子顯微鏡測定脂質體的形態變化；采用濁度計測量脂質體的濁度變化。從陽離子脂質體的物理化學性質方面考察了脂質體的穩定性，并將陽離子脂質體作為基因載體運載質粒DNA轉染Hela細胞，考察脂質體基因載體的體外轉染效率，從而為季銨鹽型陽離子脂質體介導基因轉運研究提供理論依據及實驗指導。

圖1 季銨鹽型陽離子類脂CPA14的化學結構

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

陽離子類脂CPA14(課題組合成)；二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE，上海西格瑪有限公司)；人宮頸癌細胞Hela(中國科學院上海細胞庫)；1,2-二油烯氧基-3-三甲氨基丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethy-lammonium-propane(chloride salt)，DOTAP，美國Roche公司)；質粒pGFP-N2(含綠色熒光蛋白基因，實驗室提取)；磷酸鹽緩沖液(DPBS，生工生物工程(上海)股份有限公司)；Opti-DMEM培養基、胎牛血清(美國Gibco公司)。

攜Zeta電位測定與納米激光散射粒度分布儀(SZ-100，日本HORIBA公司)；濁度計(WGZ-2000，上海儀電物理光學儀器有限公司)；超純水儀(美國Millipore公司)；倒置熒光顯微鏡(IX71，日本Olympus公司)；二氧化碳培養箱(美國Thermo公司)；高壓蒸汽滅菌鍋(MLS-3750，日本三洋公司)。

1.2 陽離子脂質體的制備

按照1:1摩爾比準確稱取類脂CPA14和DOPE，加入氯仿溶解，在N2下吹干形成均勻薄膜。將膜置于真空干燥箱過夜，準確加入0.5 mL預熱的無水乙醇和4.5 mL超純水，浸泡2 h。反復超聲振蕩處理，使膜充分溶解以至澄清，即得到陽離子脂質體，置于4 ℃冰箱保存待用。

1.3 脂質體的平均粒徑及Zeta電位測定

陽離子脂質體每隔15天測定其平均粒徑和Zeta電位，通過攜Zeta電位測定與納米激光散射粒度分布儀測量，測定前將脂質體經超聲處理后，用超純水稀釋，1 mL超純水加入20 μL脂質體樣品。檢測條件為波長630 nm的氦-氖激光，重復測量3次。

1.4 陽離子脂質體的形態測定

脂質體的形態主要是通過負染色透射電子顯微鏡(TEM)來表征。陽離子脂質體超聲10 min，400目碳膜銅網吸附脂質體20～30 min，滴上2%磷鎢酸染色30 s，干燥后在透射電鏡下觀測并照相，加速電壓200 kV，檢測最小物鏡光闌孔為20～30 μm，放大倍數為15～30 K[4]。

1.5 陽離子脂質體的濁度檢測

陽離子脂質體濁度測定通過WGZ-2000型濁度計測定，測定前將脂質體超聲處理，準確移取脂質體20 μL，用1 mL超純水稀釋，樣品測量重復5次，儀器穩定顯示的讀數即為被測樣品濁度值。

1.6 陽離子脂質體轉染綠色熒光蛋白基因

將Hela細胞種植于24孔細胞培養板中，每孔加DMEM細胞培養液(含雙抗和血清)400 μL，濃度約為1.0×106個/孔。將細胞放置在37 ℃，5% CO2培養箱中孵育24 h，使在轉染日細胞密度達80%～90%。移去生長培養基，用等量DME培養基(無血清)清洗，再用等量DMEM培養基(無血清)替換。將脂質體/DNA復合物100 μL，加到每孔中，搖動培養板，輕輕混勻。放在37 ℃，5% CO2培養箱中培養4～5 h，更換含10%血清和抗生素的培養基，培育48 h。采用倒置熒光顯微鏡進行基因表達分析，觀察倍數20×10。

2 結果與討論

2.1 陽離子脂質體的穩定性

圖2 陽離子脂質體三個月內的濁度變化

2.2 陽離子脂質體的平均粒徑

脂質體的粒徑對脂質體穩定性的影響很大，粒徑較大的脂質體(>300 nm) 缺乏血管通透性，不能通過肝血管的細胞間隙，易被網狀內皮系統吞噬，故在體內的半衰期較短。粒徑小于300 nm的脂質體可以減少肝、脾的攝取，增加靶部位的聚集，延長其在血液中的半衰期[7-9]。另外，不同大小的脂質體融合和聚集的程度不同，也會影響脂質體的儲存時間。陽離子脂質體的平均粒徑的統計結果如圖3。

圖3 陽離子脂質體的平均粒徑

本文方法制得的陽離子脂質體的平均粒徑在210～260 nm，隨著脂質體放置時間的增加，粒徑沒有明顯變化。脂質體的粒徑分布通常用多分散性系數PDI值表示，PDI值越小，表明粒徑分布的范圍越窄，說明分散體系中顆粒的粒徑具有較好的規整度和均一性，通常認為較小的粒度分布對應脂質體具有較好的穩定性，適于體內轉染的應用；PDI值越大，越接近于1，表明脂質體顆粒分布越不均一[10-11]。本文所制備脂質體的PDI值都在0.3左右，脂質體的有效粒徑分布均較窄，說明陽離子脂質體顆粒分布比較均勻。

2.3 陽離子脂質體的Zeta電位

脂質體表面帶電性的一個重要指標就是Zeta電位，Zeta電位的大小可以預測脂質體系是否穩定[12]。Zeta電位越大表示脂質體表面所帶電荷越多，可使由雙電層引起的靜電斥力增大，凝聚時要克服的能量越大，越不易產生凝聚，從而增加脂質體穩定性。此外，Zeta電位的高低還表明了其壓縮DNA的能力，一般來說，Zeta電位越大，其壓縮DNA的量越多，但同時細胞的毒性也越大，因此要將脂質體的Zeta電位控制在一個合適的范圍。通常情況下，脂質體Zeta電位絕對值小于30 mV時，荷電粒子不穩定，容易聚集；脂質體Zeta電位絕對值大于30 mV時，具有較好的靜電穩定性；而絕對值大于60 mV，已經相當穩定[13]。制備的陽離子脂質體的電位分布和Zeta電位如圖4。

圖4 陽離子脂質體的Zeta電位

3個月內脂質體的Zeta電位在55～90 mV變化，具有一定的電荷穩定性，可保證陽離子脂質體具有較好的穩定性。

2.4 陽離子脂質體的形態

透射電子顯微鏡是表征分子有序組合體微觀形態的最直觀檢測手段，本文采用透射電子顯微鏡觀察所制備脂質體的形態。采用負染色技術將脂質體滴加在附有碳膜的銅網上，以2%磷鎢酸水溶液對脂質體的背景進行染色，脂質體被高密度的磷鎢酸染色劑包圍形成背景。背景對電子束產生散射作用，相對較暗，而大多數電子束可以穿過脂質體，于是屏幕上就形成了暗色背景下脂質體較亮的圖像。這種方法能較好地觀察脂質體的二維結構，但不能觀察其三維表面特征，脂質體透射電鏡結果如圖5。

陽離子脂質體放置三個月后，電鏡觀察形態相差不大，脂質體基本為球形結構，平均粒徑在100 nm以內，顆粒分布比較均勻。對比圖3可看出，由電鏡測得的粒徑相對于粒度儀測得的平均粒徑要小。這是因為電鏡是極少的點面靜態顆粒測量，粒度儀是立體的、大量的、動態測量；另外，脂質體失水后，粒徑也要變小一些。由電鏡圖可以看出，脂質體平均粒徑較小，形態相差不大，分布較為均勻，說明脂質體具有很好的穩定性。

圖5 陽離子脂質體透射電鏡(加速電壓100kV)

2.5 陽離子脂質體轉染綠色熒光蛋白基因

質粒pGFP-N2中含有綠色熒光蛋白基因，基因表達的產物含有綠色熒光蛋白(GFP)，陽性細胞發出明亮的綠色熒光，GFP陽性細胞越多，信號越強，表明轉染效率越高，可以定性分析脂質體/DNA復合物的轉染效率[14-16]。選取制備三個月后的脂質體CPA14，與質粒DNA按質量比(N:P)為1:1，3:1，6:1和8:1分別制備脂質體/DNA復合物，轉染對數增殖期的Hela細胞，定性分析陽離子脂質體的轉染效率，結果如圖6。

圖6 陽離子脂質體介導pGFP-N2質粒轉染Hela細胞綠色熒光蛋白表達

在N:P比為1時，陽離子脂質體壓縮的質粒DNA量較少，轉染效率不高；當N:P比為6和8時，由于陽離子脂質體用量相對較大，可能會對Hela細胞產生一定毒性，導致細胞轉染效率降低。陽離子脂質體與質粒DNA以3:1質量比制備的脂質體/DNA復合物能高效轉染Hela細胞，且與商品轉染試劑DOTAP轉染效率相當。

3 結 論

本文通過對季銨鹽型陽離子脂質體CPA14的平均粒徑、粒徑分布、Zeta電位及濁度等方面的研究，考察了脂質體的穩定性。所制備的陽離子脂質體澄清透明，在4 ℃條件下存放3個月，外觀無明顯變化，無沉淀析出，穩定性較好。經透射電子顯微鏡檢測，陽離子脂質體呈球形結構，粒徑小于100 nm；經粒度分析儀檢測，陽離子脂質體的粒徑在210～260 nm，脂質體的PDI 值均在0.3左右，粒徑分布較均一，粒徑分散均勻，Zeta電位為55～90 mV，具有一定的電荷穩定性。脂質體的濁度在7.0 NTU左右，且隨著時間的增加并無明顯變化，具有良好的穩定性。陽離子脂質體與質粒DNA在N:P質量比為3:1時可高效轉染人宮頸癌細胞，與商品轉染試劑DOTAP相當。實驗結果表明所構建的季銨鹽型陽離子脂質體具有良好的穩定性，滿足作為基因轉染載體的條件，有適于體內外轉染的應用潛力，具有一定的應用價值。

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(責任編輯 趙環宇)

Study on Stability of Cationic Liposomes Gene Carriers

ZHAO Yi-nan, LIU An, FU Ying, ZHANG Shu-biao

(SEAC-ME Key Laboratory of Biotechnology and Bio-resources Utilization, Dalian Minzu University, Dalian Liaoning 116605, China)

The stability of liposome CPA14 was studied by examining the size, morphology, Zeta potentials and turbidity. The TEM showed the particle sizes of liposomes which is of spherical structure were 100～200 nm, and the dynamic light scattering showed the particle size of cationic liposomes were from 210 to 260 nm, which were distributed uniformly. Zeta potentials of the liposomes were between 55～90 mV. The appearance of liposomes did not change significantly at 4 ℃ for 3 months. The turbidity of liposomes remained unchanged in three months. It was confirmed that the quaternary ammonium cationic liposome CPA14 had good stability and was suitable for gene transfer.Invitrotransfection of the liposomes was evaluated by using pGFP-N2 plasmid DNA against Hela cells. The results indicated that they had nearly the same transfection to the reagent DOTAP at the N:P ratio of 3:1. The results provide a theoretical basis for the construction of a novel quaternary ammonium cationic liposome gene carriers.

cationic liposomes; particle sizes; Zeta potentials; turbidity; transfection efficiency

2017-03-27；最后

2017-04-10

國家自然科學基金項目(21176046，21606041), 國家高新技術研究發展計劃(863計劃)項目(2014AA020707)，中央高校基本科研業務費專項資金資助項目(DC201501076)。

趙軼男(1979-), 女, 遼寧撫順人, 高級工程師, 博士，主要從事基因載體及其輸送技術研究。

張樹彪(1971-), 男, 教授, 博士生導師, 主要從事基因載體及其遞送技術研究，E-mail:zsb@dlnu.edu.cn。

2096-1383(2017)03-0202-05

R941

A