新型Rho激酶抑制劑FSD-C10對A53T細(xì)胞突起的作用

趙 靜 張 偉 馬 杰 張海飛 尉杰忠△ 柴 智 宋麗娟 肖保國 馬存根1，2，△

1)山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科 太原 030001 2)山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所 大同 037009 3)山西中醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)研究中心 太原 030024 4)復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所 上海 200025

·論著·

新型Rho激酶抑制劑FSD-C10對A53T細(xì)胞突起的作用

趙 靜1，2)張 偉1，2)馬 杰1，2)張海飛2)尉杰忠2)△柴 智3)宋麗娟3)肖保國4)馬存根1，2，3)△

1)山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科 太原 030001 2)山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所 大同 037009 3)山西中醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)研究中心 太原 030024 4)復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所 上海 200025

目的 探討新型Rho激酶抑制劑FSD-C10對A53T細(xì)胞突起的影響及其促進(jìn)突起生長的機(jī)制。方法 A53T細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)和傳代，細(xì)胞生長到90%左右后，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)的需要，分為PBS陰性對照組、Fasudil陽性對照組及FSD-C10干預(yù)組。應(yīng)用Image-Pro Plus v6.0軟件測量不同時(shí)間各組細(xì)胞突起的長度，Western blot檢測突起相關(guān)蛋白synapsinⅠ、synaptophysin、PSD-95的表達(dá)情況。結(jié)果 FSD-C10促進(jìn)A53T細(xì)胞突起的生長，synapsinⅠ蛋白表達(dá)升高。結(jié)論 FSD-C10可能通過誘導(dǎo)synapsinⅠ的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對突起生長的促進(jìn)作用。

FSD-C10；A53T細(xì)胞；突起；synapsinⅠ

Fasudil作為目前臨床唯一使用的Rho激酶(ROCK)抑制劑，自1996年在日本用于動(dòng)脈瘤破裂后遲發(fā)性血管痙攣臨床治療以來，目前已被廣泛用于多種與血管痙攣相關(guān)疾病的治療。ROCK是近10 a來發(fā)現(xiàn)參與細(xì)胞諸多活動(dòng)的主要酶之一。已有研究表明，ROCK可在諸多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中被異常激活，在一些腦卒中、炎性脫髓鞘和炎性變性病等疾病發(fā)生發(fā)展的病理過程中扮演重要角色。ROCK抑制劑則可有效改善MS[1]及PD[2]動(dòng)物模型的臨床癥狀。近年來，越來越多的證據(jù)表明，F(xiàn)asudil還可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞軸突再生，激發(fā)神經(jīng)干細(xì)胞的分化潛能，促進(jìn)其分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞，并在EAE模型中顯示其良好的治療潛能[3-5]。然而，由于Fasudil口服生物利用度差，安全窗相對較小，不宜長期使用，限制了諸多慢性進(jìn)行性神經(jīng)元變性疾病的治療。FSD-C10是基于Fasudil為母板合成的新型Rho激酶抑制劑衍生物。本研究利用A53T細(xì)胞探討FDS-C10對突起生長的影響，并觀察對突起相關(guān)蛋白synapsinⅠ、synaptophysin、PSD-95的表達(dá)。

1 材料與方法

1．1 材料 A53T細(xì)胞由復(fù)旦大學(xué)神經(jīng)病學(xué)研究所肖保國教授惠贈(zèng)。胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)液、雙抗購自Gibco公司，MTT購自美國Sigma公司，多克隆兔抗突觸素Ⅰ抗體、鼠SYP單克隆抗體、兔PSD-95多克隆抗體、HRP-標(biāo)記山羊抗鼠二抗購自Santa Cruz公司，HRP-標(biāo)記山羊抗兔二抗購自北京博奧森公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Invitrogen公司。

1．2 方法

1．2．1 細(xì)胞的培養(yǎng)和分組：A53T細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于10 cm2的培養(yǎng)皿中，在含有10%胎牛血清、1%雙抗(100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)的高糖DMEM培養(yǎng)液中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)和傳代。細(xì)胞生長到約90%密度后，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)的需要，傳代接種于新的10 cm2的培養(yǎng)皿中，同時(shí)分為PBS陰性對照組、Fasudil陽性對照組、FSD-C10干預(yù)組。首先，F(xiàn)asudil陽性對照組、FSD-C10干預(yù)組分別加入Fasudil、FSD-C10，使其培養(yǎng)液含有終濃度為15 μg/mL的Fasudil、FSD-C10；然后將A53T細(xì)胞置5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，于4 h、72 h分別收集細(xì)胞。重復(fù)進(jìn)行3次相同的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1．2．2 細(xì)胞突起長度的測量：細(xì)胞培養(yǎng)至1 h、2 h、4 h、8 h、24 h，顯微鏡下分別觀察各組細(xì)胞。采用簡單隨機(jī)抽樣的方法，隨機(jī)挑選3個(gè)視野進(jìn)行拍照，應(yīng)用Image-Pro Plus v6.0軟件測量細(xì)胞突起的長度。

1．2．3 Western blot分析：細(xì)胞收集后，按100 mg 樣品加入0.2 mL預(yù)冷裂解液 A (40 mmol/L Tris，1%二硫蘇糖醇，蛋白酶抑制劑混合物，內(nèi)含1 mmol/L苯甲基磺酰氟，1 mmol/L乙二胺四乙酸，0.7 μg/mL 抑肽素，0.5 μg/mL 亮肽素)勻質(zhì)化，10 000 r/min、10 min、4 ℃離心混合物，將上清轉(zhuǎn)移到干凈無菌的離心管中，檢測蛋白含量(bicinchoninio acid，BCA)。待調(diào)整濃度后，分裝置-80 ℃保存。30 μg蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳和轉(zhuǎn)膜后，用5%牛奶封閉1 h，加入一抗(突起相關(guān)蛋白1∶500，內(nèi)參 1∶10 000)4 ℃過夜。次日用PBS-T洗滌后，加入HRP-偶聯(lián)的相應(yīng)二抗(1∶1 000)室溫2 h。再次洗滌后，條帶經(jīng)化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)反應(yīng)后，采用化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)(Bio-Rad公司，Hercules，CA，美國)、圖像測量軟件(Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室，Hercules，CA，美國)比較目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白比值，進(jìn)行半定量計(jì)算。

2 結(jié)果

2．1 FSD-C10對A53T細(xì)胞突起生長的影響 FSD-C10處理后，細(xì)胞突起的平均長度在培養(yǎng)1、2、4、8、24 h時(shí)明顯長于PBS組(P<0.05)，1、2、4 h時(shí)短于Fasudil組(P<0.01)，8、24 h長于Fasudil組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、圖2。

圖1 A53T細(xì)胞在Fasudil、FSD-C10作用0、1、2、4、8、24 h的細(xì)胞形態(tài)

圖 2 Fasudil和FSD-C10不同時(shí)間對A53T細(xì)胞突起長度的影響

2．2 FSD-C10對synapsinⅠ表達(dá)的影響 如圖3所示，F(xiàn)asudil及FSD-C10在4 h作用后均不能誘導(dǎo)synapsinⅠ的表達(dá)，而72 h時(shí)Fasudil誘導(dǎo)synapsinⅠ的上調(diào)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，F(xiàn)SD-C10可顯著誘導(dǎo)synapsinⅠ的表達(dá)(P<0.05)，提示FSD-C10誘導(dǎo)synapsinⅠ表達(dá)的能力優(yōu)于Fasudil。

2．3 FSD-C10對synaptophysin表達(dá)的影響 如圖4所示，F(xiàn)asudil和FSD-C10無論在4 h或72 h作用后，均不能影響A53T細(xì)胞synaptophysin的表達(dá)；與對照組相比，synaptophysin的表達(dá)無明增加或減少。

圖3 Fasudil和FSD-C10誘導(dǎo)synapsinⅠ的表達(dá)

圖4 Fasudil和FSD-C10誘導(dǎo)synatophysin的表達(dá)

2．4 FSD-C10對PSD-95表達(dá)的影響 如圖5所示，F(xiàn)asudil和FSD-C10作用A53T細(xì)胞4 h后，均可輕度誘導(dǎo)PSD-95的表達(dá)，雖差異尚未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，F(xiàn)asudil及FSD-C10作用A53T細(xì)胞72 h后，均可輕度抑制PSD-95的表達(dá)，但差異也未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示ROCK抑制劑Fasudil或FSD-C10作用早期可促進(jìn)PSD-95表達(dá)，而在作用晚期則可抑制PSD-95表達(dá)。

圖5 Fasudil和FSD-C10誘導(dǎo)PSD-95的表達(dá)

3 討論

突觸素(synapsin)是一種磷酸蛋白，與突觸囊泡相連，是突觸小泡特異性的外側(cè)膜蛋白，在神經(jīng)分化的早期及突起形成的過程中，每種突觸素都有其特異性作用，且在大腦各區(qū)的每個(gè)發(fā)育階段，突觸素在腦結(jié)構(gòu)形成的過程中及其結(jié)構(gòu)和功能可塑性都是必不可少的。突觸素家族包括突觸素Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，其中突觸素Ⅰ(synapsinⅠ)是囊泡的外側(cè)膜蛋白。有研究利用基因敲除小鼠發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)發(fā)育過程中，突觸素發(fā)揮了重要作用，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)突觸連接的形成和維持。敲除突觸素Ⅰ基因后，雖小鼠發(fā)育仍正常，且解剖學(xué)上無明顯異常，但在其腦內(nèi)結(jié)構(gòu)海馬CA3區(qū)的突觸前結(jié)構(gòu)，神經(jīng)末端明顯縮小，且活性區(qū)突觸囊泡減少，可見突觸形成明顯延遲[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠的突觸素Ⅰ基因，小鼠的突觸形成受阻[8-9]。本實(shí)驗(yàn)將Fasudil及FSD-C10分別添加到A53T細(xì)胞的培養(yǎng)液中，觀察細(xì)胞突起生長情況，經(jīng)Fasudil及FSD-C10處理的細(xì)胞突起的平均長度長于PBS組，說明Fasudil及FSD-C10具有促進(jìn)A53T細(xì)胞突起生長的作用，而Fasudil及FSD-C10對synapsinⅠ的表達(dá)呈現(xiàn)誘導(dǎo)作用，且在后期FSD-C10誘導(dǎo)synapsinⅠ表達(dá)的能力優(yōu)于Fasudil，表明Fasudil及FSD-C10通過誘導(dǎo)突觸素Ⅰ的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對突起生長的促進(jìn)作用。而在早期Fasudil作用的細(xì)胞突起生長平均長度長于FSD-C10作用的細(xì)胞，而后期FSD-C10作用后細(xì)胞突起生長平均長度長于Fasudil作用的細(xì)胞。因此，F(xiàn)SD-C10在具有Fasudil作用優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，長期作用可能比Fasudil更穩(wěn)定或有效。

突觸體素(synaptophysin)是一種位于突觸前膜的囊泡蛋白，與突觸的結(jié)構(gòu)可塑性和功能可塑性密切相關(guān)[10]。本實(shí)驗(yàn)中，在Fasudil及FSD-C10的作用下，與PBS組相比，未見synaptophysin的表達(dá)顯著增加或減少，結(jié)果顯示，F(xiàn)asudil及FSD-C10盡管可促進(jìn)細(xì)胞突起的形成，但似乎可能并不通過突觸體素的作用實(shí)現(xiàn)。

PSD是一層均質(zhì)的致密物質(zhì)，位于突觸后膜內(nèi)側(cè)胞質(zhì)面，包含多種蛋白質(zhì)，突觸后致密蛋白-95(postsynaptic density protein-95，PSD-95)是其主要蛋白質(zhì)成分之一，在突觸可塑性中起重要作用。突觸可塑性是指突觸的形態(tài)和功能發(fā)生較為持久改變的特性或現(xiàn)象，是學(xué)習(xí)記憶形成的神經(jīng)生理學(xué)基礎(chǔ)[11]，包括功能可塑性和結(jié)構(gòu)可塑性兩大部分[12]。PSD-95為突觸后膜的標(biāo)記蛋白，對維持樹突棘的穩(wěn)定具有重要作用[13]。本實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)asudil及FSD-C10早期略可誘導(dǎo)PSD-95的表達(dá)，后期Fasudil及FSD-C10似乎抑制了PSD-95的表達(dá)，表明PSD-95在突觸結(jié)構(gòu)形成的早期及維持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定中起作用。但突觸形成后是否降解或轉(zhuǎn)化為其他蛋白有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，與Fasudil比較，F(xiàn)SD-C10也可有效促進(jìn)A53T細(xì)胞突觸生長，其完整和準(zhǔn)確的機(jī)制尚未闡明。然而，我們的結(jié)果提示，F(xiàn)asudil和FSD-C10促進(jìn)細(xì)胞突起形成可能與突觸素Ⅰ的誘導(dǎo)相關(guān)，而與突觸體素?zé)o關(guān)；同時(shí)，F(xiàn)asudil和FSD-C10對PSD-95的作用，早期表現(xiàn)為誘導(dǎo)，晚期則為抑制。此外，本研究還顯示，F(xiàn)SD-C10對突觸素的作用可能優(yōu)于Fasudil，因此有必要對FSD-C10化合物進(jìn)行深入研究，以便為今后臨床治療相關(guān)疾病，如腦卒中、炎性脫髓鞘和炎性變性病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] Huang XN，F(xiàn)u J，Wang WZ．The effects of fasudil on the permeability of the rat blood-brain barrier and blood-spinal cord barrier following experimental autoimmune encephalomyelitis[J]．J Neuroimmunol，2011，239(1/2)：61-67．

[2] Rodriguez-Perez AI，Dominguez-Meijide A，Lanciego JL，et al．Inhibition of Rho kinase mediates the neuroprotective effects of estrogen in the MPTP model of Parkinson’s disease[J]．Neurobiol Dis，2013，58：209-219．

[3] Hou Y，Zhou L，Yang QD，et al．Changes in hippocampal synapses and learning-memory abilities in a streptozotocin-treated rat model and intervention by using fasudil hydrochloride[J]．Neuroscience，2012，200：120-129．

[4] Ding J，Yu JZ，Li QY，et a1．Rho kinase inhibitor Fasudil induces neuroprotection and neurogenesis partially through astroeyte-defived GCSF[J]．Brain Behav Immun，2009，23(8)：1 083-1 088．

[5] Baer AS，Syed YA，Kang SU，et al．Myelin-mediated inhibition of oligodendroeyte precursor differentiation can be overcome by pharmacological modulation of Fyn-RhoA and protein kinase C signaling[J]．Brain，2009，132(Pt 2)：465-481．

[6] Bloom O，Evergren E，Tomilin N，et al．Colocalization of synapsin and actin during synaptic vesicle recycling[J]．J Cell Biol，2003，161(4)：737-47．

[7] Iga M，Inui M，Sobue K．Characterization of the interac-tion between synapsinⅠ and calspectin (brain spectrin or fodrin)[J]．Biochem Biophys Res Commun，1997， 231(3)：852-855．

[8] Ferreira A，Chin LS，Li L，et al．Distinct roles of synapsinⅠ and synapsinⅡ during neuronal development[J]．Mol Med，1998，4(1)：22-28．

[9] Ferreira A，Han HQ，Greengard P，et al．Suppression of synapsinⅡ inhibits the formation and maintenance of synapses in hippocampal culture[J]．Proc Natl Acad Sci USA，1995，92(20)：9 225-9 229．

[10] Kwon SE，Chapman ES．Synaptophysin regulates the kinetics of synaptic vesicle endocytosis in central neurons[J]．Neuron，2011，70(5)：847-854．

[11] Richter JD，Klann E．Making synaptic plasticity and memory last：mechanisms of translational regulation[J]．Genes Dev，2009，23(1)：1-11．

[12] 陳燕．神經(jīng)元的突觸可塑性與學(xué)習(xí)和記憶[J]．生物化學(xué)與生物物理，2008，48(6)：610-619．

[13] Ehrlich I，Klein M，Rumpel S，et al．PSD-95 is required for activity-driven synapse stabilization[J]．Proc Natl Acad Sci USA，2007，104(10)：4 176-4 181．

(收稿2017-03-23)

The effect of novel Rho kinase inhibitor FSD-C10 on neurite of A53T cell

Zhao Jing﹡，Zhang Wei，Ma Jie，Zhang Haifei，Yu Jiezhong，Chai Zhi，Song Lijuan，Xiao Baoguo，Ma Cungen

﹡Department of Neurology，the First Clinical Medical College，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

Objective To investigate the effect of novel Rho kinase inhibitor FSD-C10 on neurite of A53T cell and its possible mechanism of the neurite outgrowth．Methods A53T cells were routinely cultured and divided into three groups：PBS group，F(xiàn)asudil group and FSD-C10 group．The neurite length of A53T cells was measured by Image-Pro Plus v6.0 at different time points．The expressions of synapsinⅠ，synaptophysin and PSD-95 protein were examined by Western blot．Results Fasudil and PSD-C10 promoted neurite outgrowth of A53T cells．The expression of synapsinⅠ protein in A53T cells was increased，especially in FSD-C10-treated A53T cells．Both Fasudil and FSD-C10 slightly stimulated the PSD-95 at early state，but inhibited it at late state．Conclusion FSD-C10 can promote neurite outgrowth of A53Tcells possibly by its effect on the expression of synapsinⅠ protein．

FSD-C10；A53T cells；Neurite；SynapsinⅠ

國家自然科學(xué)基金2012年面上項(xiàng)目(81272163)；山西省回國留學(xué)人員重點(diǎn)科研資助項(xiàng)目(2014-重點(diǎn)7)；山西中醫(yī)學(xué)院“2011”培育計(jì)劃項(xiàng)目(2011PY-1)

R-33

A

1673-5110(2017)11-0001-04

△通訊作者：尉杰忠(1977-)，在讀博士，副教授，碩士生導(dǎo)師；馬存根(1960-)，博士，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：macungen2001@163.com