黃瓜Ca2+家族序列特征及其表達特性分析

盛 慧，杜偉玲

（哈爾濱市農業科學院生物中心，黑龍江 哈爾濱 150029）

黃瓜Ca2+家族序列特征及其表達特性分析

盛 慧，杜偉玲

（哈爾濱市農業科學院生物中心，黑龍江 哈爾濱 150029）

通過黃瓜基因組數據庫，采用生物信息學方法獲得15個黃瓜Ca2+家族序列，并對其染色體位置、基因組位置、氨基酸長度、轉錄起始位點和Pfam匹配結構域數進行預測；利用RT-PCR方法對所有搜索到的Ca2+家族基因進行組織特異性分析；對黃瓜植株進行低溫處理，分析黃瓜Ca2+基因家族的表達情況。結果顯示：15個基因中除Csa021245未定位以外，其余均勻分布在1～6號染色體上，一致性為47.67%；Csa001688、Csa009857和Csa009360 等3個基因的5′區出現CpG島結構；組織表達特異性分析結果顯示，Csa001688、Csa006826、Csa010172和Csa016434在葉中表達量最高，Csa003758、Csa010172 和Csa018949在根中表達量最高；進化樹分析結果顯示，只有Csa010172和Csa009360與擬南芥AtACA2親緣關系最近，這些基因可能在Ca2+家族信號傳導過程中起著主要作用；實時定量表達分析表明，Ca2+基因家族參與黃瓜對低溫脅迫的應答。

黃瓜；Ca2+家族；組織特異性；信號傳導

植物感受外界逆境反應的傳導途徑和傳導方式一直備受關注。Ca2+作為胞內的第二信使，參與許多細胞的調控和基因轉錄［1-3］，在植物對各種逆境信號的轉導［4-7］中起著重要作用。董先平等［8］認為，在生物進化過程中，真核細胞形成了一套包括離子通道、離子泵和離子交換體等復雜的Ca2+轉運系統，用來維持胞質中的Ca2+平衡。細胞內的Ca2+信號傳導主要是通過鈣結合蛋白將信息傳遞給下游基因。孫存華等［9］研究表明，逆境脅迫如干旱、低溫、熱激等都可誘發植物細胞產生Ca2+信號及相應的生理生化反應。Roberto等［10］認為在寄主植物中，細胞內鈣離子變化是一個組成部分的信號機制。Christoph［11］也證實在植物體內，細胞與細胞間的信號傳遞最快、最有效的途徑是電信號，這與瞬間改變的Ca2+濃度是緊密相連的。植物對細胞內Ca2+濃度的調節依賴于定位在不同細胞器和質膜上的Ca2+通道、Ca2+泵和Ca2+/H+反轉運子的活性［12-13］。Lourido等［14］研究表明，在細胞中與鈣離子結合的信號元件主要包括響應元件和傳感元件兩類蛋白。響應元件與鈣離子結合后能直接產生信號效果，因此既是鈣信號的感應器又是鈣信號的效應器，主要是一些鈣依賴蛋白激酶類蛋白［15-16］。它們既含有類似于鈣調蛋白的與鈣離子結合的結構域，也含有蛋白激酶的結構域。傳感元件與鈣離子結合后還必須與目標蛋白相互作用才能產生信號效果，目前已經鑒定出包括鈣調素、鈣調磷酸酶B類似蛋白等多類鈣結合蛋白家族［17］?？傊珻a2+在植物生長發育、器官分化以及生理代謝方面都起到至關重要的作用。目前在擬南芥中已發現14個Ca2+泵基因，但大部分功能還不清楚。

目前，黃瓜基因組測序已經完成，但后續的功能驗證及基因之間的相互作用關系尚不完善。為了鑒定黃瓜基因組中Ca2+家族成員，本研究根據擬南芥Ca2+泵基因ACA2的完整序列搜索黃瓜基因組數據庫，以期得到黃瓜基因組中與Ca2+有關的所有基因；對獲得的所有Ca2+家族基因進行生物信息學分析和組織表達特異性分析，并分析低溫處理下黃瓜Ca2+基因家族的表達情況，為后續信號傳導機制的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

密刺型黃瓜品種M801-3，由哈爾濱市農業科學院黃瓜育種試驗室提供。黃瓜總RNA 的提取使用TaKaRa公司的RNAiso Plus and RNAisomate for Plant Tissue 試劑盒，mRNA 的分離、純化使用A.P mRNA Purification Kit。SYBR PrimeScript RT-PCR試劑盒、PCR相關試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司。LineGene 9620型實時熒光PCR儀購自杭州博日科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取及mRNA分離 選取經低溫處理［18］的黃瓜根、莖和葉組織樣，液氮處理后置于-70℃中保存備用?？俁NA 的提取、mRNA的分離、純化按照試劑盒說明書操作，mRNA純化后檢測樣品的濃度及純度。

1.2.2 黃瓜Ca2+基因家族搜索及其生物信息學分析 依據擬南芥Ca2+家族蛋白質序列，反復檢索黃瓜基因組數據庫（http：//www.icugi.org/ cgi-bin/ICuGI/tool/blast.cgi），經過BLASTX篩選共得到15個黃瓜Ca2+家族序列。利用黃瓜基因組數據庫確定基因在染色體上的位置，并利用DNAman 6.0 軟件對上述基因的氨基酸序列進行比對。

1.2.3 組織表達特異性分析 利用Primer Premier 5.0 設計特異引物，分析上述基因在黃瓜根、莖和葉中的表達情況。PCR反應體系為：10 × PCR Buffer 2.0 μL，dNTP 1.0 μL，上下游引物 各 1.0 μL，Taq 酶0.2 μL，2.5 mmol/L MgCl22.0 μL，模板 1.0 μL，無菌去離子水補足到15 μL。PCR反應條件依據退火溫度而定，循環次數均為31個，具體引物序列詳見表1。

1.2.4 低溫處理下Ca2+基因家族的表達分析 將具有2～3片真葉的黃瓜植株，在4℃下處理0、2、4、12、24 h。葉片-80℃保存，用于總RNA提取。選取Csa001688進行實時定量PCR分析。利用LineGene 9620型實時熒光PCR儀，采用兩步法，在60℃進行熒光信號采集，反應結束后繪制曲線圖。

表1 引物序列及退火溫度

2 結果與分析

2.1 黃瓜Ca2+基因家族序列生物信息學分析

利用網站上發布的擬南芥Ca2+基因家族蛋白質序列（NM_119927.3）反復搜索黃瓜基因組數據庫，共得到15個相關基因。其中，有5個序列分布于第1條染色體上，3個序列分布于第2條染色體上，2個序列分布于第4條染色體上，1個序列尚未定位，其余序列分布見表2，一致性為47.67%，Csa001688、Csa009857和Csa009360等3個基因的5′區出現CpG島結構。

2.2 候選基因序列比對

利用DNAMAN6.0對擬南芥和黃瓜中的Ca2+基因家族氨基酸序列進行同源性比對，結果（圖1，封二）表明，Csa002070、Csa002837、Csa003758、Csa005375、Csa015954、Csa016434、Csa018475和Csa018949同源性較高；Csa010172與擬南芥同源性最高；Csa009360與其他氨基酸序列差異最大，不具有全部保守序列結構域；Csa009857所編碼的氨基酸只具備Ca2+基因家族部分功能。

表2 黃瓜Ca2+基因家族生物信息學分析結果

圖2 黃瓜Ca2+家族成員與擬南芥蛋白的進化樹

2.3 黃瓜Ca2+基因家族進化樹分析

用DNAMAN6.0 軟件將黃瓜15個Ca2+家族蛋白序列與擬南芥AtACA2構建系統進化樹進行聚類分析。從圖2可以看出，黃瓜Ca2+基因家族蛋白主要分為兩類，其中Csa010172和Csa009360與擬南芥AtACA2親緣關系最近，Csa001688、Csa009857和Csa021245與擬南芥AtACA2關系稍遠，其他Ca2+基因家族蛋白成員聚集在一起。

2.4 黃瓜Ca2+基因家族組織表達特異性分析

對15個黃瓜Ca2+基因家族進行組織表達特異性分析。從圖3（封二）可以看出，Csa003758、Csa006135、Csa010172、Csa018475和Csa018949等5個基因在根、莖和葉中均有表達，其中Csa003758在葉中的表達量遠遠高于莖和根，Csa006135在根中的表達量較低；Csa009360和Csa009857在所有組織中均無表達；Csa001688、Csa002070、Csa005375和Csa016434只在葉片中有表達；Csa002837和Csa021245在葉和莖中有表達，且表達量相近；Csa015954在葉和根中均有表達，在根中的表達量較弱，莖中未見。

2.5 低溫處理下黃瓜Ca2+基因家族表達分析

試驗選取Csa001688進行實時定量PCR分析，結果（圖4）顯示，Csa001688基因在4℃處理12 h的表達量達到最高峰，處理24 h時表達量出現急劇下降，表明Csa001688基因參與低溫脅迫的應答。

圖4 低溫脅迫下Csa001688基因的實時定量表達分析

3 結論與討論

Ca2+作為細胞信使的基礎是胞漿Ca2+與胞內鈣庫之間存在濃度梯度，當某種刺激使胞內Ca2+濃度大幅度增加時，就會產生信號傳導［19-21］。在植物細胞中，Ca2+與其他離子有著本質區別，Ca2+不可移動，它不能從老的葉片撤離而補充到新生的年輕細胞中，因此Ca2+必須不斷補充到年輕細胞的胞內Ca2+貯存庫，特別是莖尖和根尖分生區和伸長區細胞。Ca2+泵（Ca2+- ATPase） 屬于P-型ATPase家族，直接利用ATP驅動離子轉運［22-24］。目前在擬南芥中已發現14種Ca2+泵，大部分功能還不清楚。

本研究利用測序已完成的黃瓜基因組數據庫，以擬南芥Ca2+泵基因ACA2的完整序列為模板，共得到15個黃瓜Ca2+基因家族成員。經過生物信息學分析可知，成員內部之間存在高度保守序列，且序列一致性為47.67%。15個基因中除Csa021245未定位以外，其余均勻分布在1～6號染色體上；進化樹分析結果顯示，只有Csa010172和Csa009360與擬南芥AtACA2親緣關系最近；Csa009360和Csa009857在根、莖和葉中均未檢測到表達，可能與低溫誘導的時間有關或只在花和果實等部位特異表達。15個基因中，除Csa009360和Csa009857外，其余13個基因均在葉中有表達，推測葉片對于外界刺激最為敏感，莖部次之，根部最差。但是這13個基因如何參與逆境調控還有待進一步探討。試驗選取Csa001688進行實時定量PCR分析，結果顯示，Csa001688基因在低溫4℃處理12 h時達到表達最高峰，表明Csa001688基因參與低溫脅迫的應答。

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（責任編輯 崔建勛）

Analysis on sequence characteristics and expression of Ca2+family of cucumber

SHENG Hui，DU Wei-ling
（Biological Center，Harbin Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150029，China）

Fifteen sequences of Ca2+family in cucumber were indentified from Cucumber Genome Database using bioinformatics methods，and the chromosomal location，genomic position，amino acid length，transcription initiation site and Pfam matching domain were predicted. At the same time，sequence similarity and phylogenetic tree were analyzed. Cucumber plants were exposed to low temperature，and the expression of Ca2+gene family was analyzed. The results showed that 5 sequences distributed on the first chromosome，3 sequences distributed on the second chromosome，2 sequences distributed on the fourth chromosome，1 sequence was not located，the remaining sequences evenly distributed on other chromosomes. With RT-PCR technique，the expressions of Csa001688，Csa006826，Csa010172 and Csa016434 in leaves were higher， the expressions of Csa003758，Csa010172 and Csa018949 in roots were higher. Phylogenetic tree analysis showed that，only Csa010172 and Csa009360 were close with Arabidopsis AtACA2，these genes may play important roles in Ca2+family signal transduction. Real - time quantitative expression analysis showed that Ca2+gene family was involved response to low temperature stress in cucumber.

cucumber； Ca2+family； tissue specificity； signal transduction

S642.2；Q786

A

1004-874X（2017）03-0061-06

2016-12-25

哈爾濱市科技攻關計劃項目（2006HE6BE052）

盛慧（1976-），女，博士，高級農藝師，E-mail：shenghui415128@163.com

盛慧，杜偉玲.黃瓜Ca2+家族序列特征及其表達特性分析［J］.廣東農業科學，2017，44（3）：61-66.