白術多糖對斷奶仔豬白細胞介素-1β基因表達的影響

柴艷，李琦華，賈俊靜，張文杰，陳濤，師正鵬，梁建平

（1.芒市科技局科協，云南德宏678400；2.云南農業大學動物科學學院，省動物營養與飼料科學重點實驗室，云南昆明650201；3.濰坊六和飼料有限公司臨朐分公司，山東濰坊262609；4.芒市畜牧局，云南德宏678400；5.德宏州畜牧局，云南德宏678400；6.德宏州科技局科協，云南德宏678400））

白術多糖對斷奶仔豬白細胞介素-1β基因表達的影響

柴艷1，李琦華2*，賈俊靜2，張文杰3，陳濤4，師正鵬5，梁建平6

（1.芒市科技局科協，云南德宏678400；2.云南農業大學動物科學學院，省動物營養與飼料科學重點實驗室，云南昆明650201；3.濰坊六和飼料有限公司臨朐分公司，山東濰坊262609；4.芒市畜牧局，云南德宏678400；5.德宏州畜牧局，云南德宏678400；6.德宏州科技局科協，云南德宏678400））

本試驗選用44日齡、平均體重8.94 kg的DLY三元雜交斷奶仔豬60頭，隨機分為5個處理組，每個處理3個重復，每個重復4頭豬。第一組為對照組，飼喂基礎日糧；第二、第三、第四和第五組為試驗組，分別在基礎日糧中添加抗生素（桿菌肽鋅+硫酸粘桿菌素）及0.05%、0.10%、0.15%的白術多糖（PAM），正式期為30 d。30 d后頸靜脈采取血液樣品，并應用SYBR Green I熒光染料實時定量PCR方法進行白細胞介素-1β（IL-1β）基因mRNA的定量，研究白術多糖對斷奶仔豬免疫功能的影響，為白術多糖的深入研究提供科學依據。結果表明：IL-β基因的相對表達量，各處理組間差異不顯著（P＞0.05），但白術多糖處理組均比對照組和抗生素組高，其中以0.1%PAM組最高，抗生素組、0.05%PAM組次之，對照組和0.15%PAM處理組的最低。0.1%PAM處理組與對照組和抗生素組相比，IL-β基因相對表達量分別提高34.21%和27.5%；0.1%PAM處理組與0.05%PAM處理組和0.15%PAM處理組相比，IL-β基因相對表達量分別提高27.5%和34.21%。0.05%PAM處理組與對照組和抗生素組相比，IL-β基因相對表達量分別提高5.2%和0%；0.15%PAM處理組與對照組相比，IL-β基因相對表達量提高0%；0.15%PAM處理組與抗生素組相比，IL-β基因相對表達量降低5%。

斷奶仔豬；白術多糖；白細胞介素-1β基因

白術多糖（PAM）是植物多糖中的一種，為菊科多年生草本植物，在我國的南方地區廣泛種植，是中草藥配方的一種有效成分，其用量居大宗常用中藥材之首（Shiik等，2003；Prieto，2003；Gong等，2002；楊翠平等2002；黃青森，2001；Ronald，1996；Mori等，1989；Fenichel，1984）。研究表明，PAM具有以下作用：（1）提高淋巴細胞增殖和抗體的產生、提高細胞免疫功能（Huang等，2005；P rieto，2003；郭鳳麗等，2003）。（2）提高細胞過氧化物歧化酶（SOD）活性，抑制紅細胞自氧化溶血，直接清除自由基（呂圭源等，1996）。（3）增強家兔離體小腸平滑肌自發性收縮（馬允慰，1982）；能明顯促進小鼠小腸蛋白質的合成；對應激性潰瘍，有顯著抑制作用（馬曉松等，1995）。（4）具有抗菌消炎作用，對傷寒桿菌、甲型副傷寒桿菌、福氏痢疾桿菌等有抑制作用。研究表明，PAM能使小鼠TH細胞明顯增加，提高TH/Ts比值，改善T細胞亞群分布紊亂狀態，使IL－2表達水平顯著提高，并能增加T淋巴細胞表面IL－2R基因的表達。表明PAM可能是增強免疫和調節免疫作用的重要機制之一（余上才，1994）。（5）一定劑量的PAM能增加小鼠胸腺和脾臟重量，對抗環磷酰胺所致白細胞減少作用，增強腹腔巨噬細胞吞噬功能，并能促進T淋巴細胞轉化和溶血素的生成（湯新慧，1998；李育浩等，1991）。（6）抗腫瘤作用（Mori等，1989）。此外，PAM還有抗血凝、擴張血管、防護放射線損害等作用，是國家中醫管理局公布的中醫防治“非典”處方中的重要藥材之一（余上才，1994）。本文將PAM添加至早期斷奶仔豬飼料中，研究其對斷奶仔豬白細胞介素-1β基因表達效果的影響，旨在為PAM在飼料中的合理利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物從昆明和牧牧業有限公司豬場選擇胎次、體重（7.5 kg左右）相近，健康狀況良好的三元雜交（DLY）仔豬，公母各半，共60頭，隨機分為5組，每個處理12頭，分為3個重復（欄），每個重復4頭。

1.2 試驗設計及日糧試驗用白術多糖由華南農業大學提供，試驗日糧原料由昆明云嶺廣大種禽飼料有限公司提供。白術多糖以3個不同劑量分別添加至飼料中。試驗日糧組成和營養水平見表1。抗生素組中添加1∶5的硫酸粘桿菌素和桿菌肽鋅，除抗生素組以外，其他試驗組中均未添加任何藥物和抗生素。

表2 基礎日糧組成及營養水平

1.3 飼養管理飼養試驗在統一條件下進行，試驗豬按體重相近原則隨機的分配到各個處理中，且全部飼養在同一棟朝向相同豬舍內。試驗的前10 d，采用相同功率的紅外燈人工補溫，后20 d自然溫度。試驗前對豬舍進行統一清洗、消毒，試驗豬用耳牌編號，同時按常規免疫程序免疫，并做好疾病控制。整個試驗期采用自由采食和飲水。

1.4 PCR引物設計參照GenBank（http：//www. ncbi.nlm.nih.gov）公開發表的豬白細胞介素-1β基因全長序列和豬βactin核苷酸序列，運用Primer 5.0軟件進行引物設計，并由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。其白細胞介素-1β和18S的產物長度分別為124和195 bp，引物序列如下：

IL-1β上游5'ACCTGGACCTTGGTTCTC 3'

IL-1β下游5'GGATTCTTCATCGGCTTC 3'

18S上游5'GCGGCTTTGGTGACTCTA 3'

18S下游5'CTGCCTCCTTGGATGTG 3'

1.5 白細胞介素-1β基因表達的檢測飼養30 d后頸靜脈采取血液樣品，血樣于-80℃冰箱保存，用RNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司）提取血液RNA，應用SYBR Green I熒光染料實時定量PCR方法進行IL-1β基因mRNA的定量。

1.6 數據處理試驗數據均采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 血液總RNA的提取使用百泰克（血液樣本）總RNA快速提取試劑盒提取血液RNA，然后取7μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測結果如圖1。提取的RNA無蛋白質污染，并且條帶清晰，也沒有降解和斷裂，說明提取RNA達到試驗要求。

圖1 血液RNA提取電泳圖

2.2 IL-β和18SPCR擴增圖經RT-PCR得到目的基因片段如圖2和圖3。1%瓊脂糖凝膠電泳圖譜顯示IL-β基因的目的片段大小為124 bp，18S的目的片段大小為195 bp，擴增產物的長度大小與目的片段大小一致。

圖2 18S基因擴增電泳圖

圖3 豬IL-β基因擴增電泳圖

2.3 測序結果經PCR擴增的IL-β基因膠回收后，產物送北京三博遠志生物技術有限責任公司測序，測序結果經NCBI-BLAST程序比對，確認PCR擴增產物均為目的片段。其比對結果如下：

GENE ID：397122 IL1B|interleukin 1，beta [Sus scrofa]

（10 or fewer PubMed links）

Score=152 bits（82），Expect=1e-33

Identities=85/86（98%），Gaps=1/86（1%）

Strand=Plus/Minus

2.4 熒光定量PCR結果分析

2.4.1 IL-β基因熒光定量PCR結果以cDNA樣品為模板進行定量PCR得到IL-β基因的熒光定量PCR擴增的動力學曲線（圖4）和熒光定量PCR擴增的溶解曲線（圖5）。

圖4 部分樣品IL-β基因的熒光定量PCR擴增動力學曲線

圖5 部分樣品IL-β基因的熒光定量PCR擴增熔解曲線

2.4.2 IL-β基因標準曲線的繪制將目的基因片段回收純化后，按相差10倍的比例做5～8個濃度梯度稀釋，作為熒光定量PCR標準模板，進行定量反應。在標準曲線圖中，Ct值與模板擴增拷貝數的對數呈反比關系。

標準曲線圖中基因的擴增效率一般為80%～105%，相關系數一般大于0.98，即認為定量可靠。本試驗中IL-β基因標準曲線的擴增效率及其相關系數分別為82%和99.8%。如圖6即認為達到熒光定量PCR的擴增要求。

圖6 IL-β標準品熒光定量PCR反應的標準曲線

2.4.3 IL-β實時熒光定量PCR產物檢測經實時熒光定量PCR得到目的基因片段，經1%瓊脂糖凝膠電泳圖譜顯示IL-β目的片段大小為124 bp左右，與預期結果相符。在電泳過程中沒有出現非特異性條帶，且帶型完整，亮度適中。說明熒光定量PCR反應體系和條件設置比較合適，擴增效果良好，定量結果可靠。

2.4.4 18S基因熒光定量PCR結果以血液cDNA樣品為模板進行定量PCR得到18S基因的熒光定量PCR擴增的動力學曲線（7圖）和熒光定量PCR擴增的熔解曲線（圖8）。

圖7 部分樣品18S基因的熒光定量PCR擴增的動力學曲線

圖7 的動力學曲線圖表明樣品的RNA完整性好。圖8的熔解曲線分析顯示，引物二聚體污染較少，熔解溫度均一，峰的形狀較尖銳，表明定量結果比較準確。

2.4.5 18S基因標準曲線的繪制18S基因標準曲線圖中該基因的擴增效率為84.1%，相關系數為0.998（見圖9），達到熒光定量PCR的擴增要求。

圖8 部分樣品18S基因的熒光定量PCR擴增熔解曲線

圖9 18S標準品熒光定量PCR反應的標準曲線

2.4.6 不同白術多糖添加水平對仔豬IL-β基因相對表達量的影響由表3可知，在仔豬基礎日糧中添加白術多糖可以提高斷奶仔豬IL-β基因的相對表達量，劑量不同IL-β基因的相對表達量不同，白術多糖處理組的IL-β基因相對表達量都比對照組和抗生素組高，但添加PAM組之間差異不顯著（P＞0.05），其中以0.1%添加量組相對比較高。另外，0.1%PAM處理組與對照組和抗生素組相比，IL-β基因相對表達量分別高出34.21%和27.5%；0.1%PAM處理組與0.05%PAM處理組和0.15%PAM處理組相比，分別高出27.5%和34.21%。0.05%PAM處理組與對照組相比，IL-β基因相對表達量高出5.2%；0.15%PAM處理組與抗生素組相比，IL-β基因相對表達量降低5%。

3 討論

淋巴細胞可產生大量的細胞因子，其中產生的IL-1β被認為是主要的前炎癥因子（楊文東等，2007）。

表3 不同白術多糖添加水平仔豬IL-β基因相對表達量的比較分析

近年來，多糖對淋巴細胞增殖的影響已有許多報道，研究表明，大多數多糖在體內或體外均能促進淋巴細胞的轉化。例如黃芪多糖（胡庭俊等，2005）、蜂膠多糖（王德云等，2005）、當歸多糖（胡庭俊等，2005）均能促進畜禽淋巴細胞增殖。湯新慧（1998）研究發現，白術多糖能明顯促進淋巴細胞向成熟T淋巴細胞轉化。Guo（2000）報道，從紫云英中提取的果膠多糖，可促進體外培養的鼠B細胞IL-6的分泌，其機制是IL-6 mRNA轉錄活性增加。胡曉蕾（2006）報道，添加1%和2%白術多糖均可顯著提高鼠的免疫功能，但二者的效果差異不顯著；而0.5%白術添加組與對照組相比無明顯的免疫促進作用。可能原因是0.5%白術添加量太小，以致對大鼠脾臟系數和胸腺系數無明顯的促進作用，甚至有降低的趨勢。

本試驗結果表明，在斷奶仔豬日糧中添加0.1%的白術多糖可以提高仔豬IL-1β的表達量，添加量為0.15%和0.05%時，仔豬IL-1β的表達量與對照組和抗生素組無顯著差異。

本研究中IL-1β的相對表達量結果與其他報道結果有不相一致的地方，這可能與選擇多糖的種類、來源、有效成分的含量、添加量、日糧組成、試驗條件、試驗動物等有關，具體情況有待進一步研究。

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A total fo 60 three-line crossbred DLY（44 days old）early-weaned piglets（average weight is about 8.94 kg）were random ly assigned to 5 treatments with 3 replicates of 4 pigs.GroupⅠfeed basal diet（CK），groupⅡfeed with antibiotic（bacitracin zinc+polymyxin E），groupⅢ，IV，V were fed with 0.05%，0.10%，0.15%Atractylodesmacrophala Koidz（PAM）.This experiment had one phases，total of 30 days，after 30 days，adopts the blood sample from neck meridians.And IL-1βgenemRNA wasmeasured by SYBR Green IFluorescent dye Real-time quantitative PCR to study the effect of immune function in piglets，and provid scientific proof for the future research of PAM.The results showed as follows：the experimental groups did not show significant difference on IL-1βgene mRNA（P＞0.05）.But natural PAM groupswere higher than control group and antibiotic group.Among them，0.1%PAM group was highest，0.05%PAM group and antibiotic group were second，control group and 0.05%PAM group were lowest.Compared with the control group and antibiotic group，the relative expression of IL-1βgene in 0.1%natural PAM group were higher 34.21%and 27.5%respectively；Compared with 0.05%natural PAM group and 0.15%natural PAM group，the relative expression of IL-1βgene in 0.1%natural PAM group were higher 27.5%and 34.2%respectively；Compared with the control group and antibiotic group，the relative expression of IL-1βgene in 0.05%natural PAM group were higher 5.2%and 0%respectively；Compared with the control group，the relative expression of IL-1βgene in 0.15%natural PAM group was higher 0%；Compared with antibiotic group，the relative expression of IL-1βgene in 0.15%natural PAM group was lower 5%.

weaned-piglet；polysaccharides of Atractylodesmacrophala Koidz；IL-1βgene

S816.7

A

1004-3314（2017）06-0010-05

云南省運用基礎研究面上基金項目（2007C0056M）

*通訊作者