miR-16在金黃色葡萄球菌膿毒癥中的表達及意義探討

王家學，陳 燕，劉小香，孫愛華，楊 珺，呂火烊，周永烈

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miR-16在金黃色葡萄球菌膿毒癥中的表達及意義探討

王家學1，陳 燕2，劉小香3，孫愛華3，楊 珺1，呂火烊4，周永烈4

目的 探討miR-16表達水平與金黃色葡萄球菌膿毒癥嚴重程度的關聯性，進一步探討其潛在的臨床意義。方法 收集金黃色葡萄球菌膿毒癥血液標本共計32例，膿毒性休克、嚴重膿毒癥和一般膿毒癥各8例，不同年齡段的健康對照24例；另外，收集革蘭氏陰性菌膿毒癥血液標本8例。用Trizol液裂解全血后提取microRNA，采用熒光定量PCR測定miR-16在不同組的表達水平(2-△△Ct法)，用SPSS 13.0軟件分析各組之間的統計學差異。采用SPSS 13.0軟件將miR-16定量值與相應CRP和PCT值進行相關性分析。結果 miR-16表達水平與金黃色葡萄球菌膿毒癥嚴重程度呈明顯的負關聯，各實驗組與對照組相比均有統計學差異(P<0.001)，實驗組之間也有統計學差異(P<0.01)。miR-16表達水平與CRP和PCT值呈負相關性，相關系數分別為-0.561和-0.769。結論 miR-16表達與金黃色葡萄球菌膿毒癥有明顯的負關聯性，提示其可能作為該菌膿毒癥嚴重程度的標記物。

miR-16;金黃色葡萄球菌;膿毒癥

金黃色葡萄球菌可引起臨床嚴重感染。膿毒癥是在細菌感染基礎上以促炎癥激活過程為特征的全身性反應狀態(tài)[1]，死亡率高且患病率正逐年遞增[2]。目前，膿毒癥治療主要為抗菌和抗炎，但這些方法的臨床應用效果有限。微小RNA(microRNA，又稱miRNA或miR)可調控炎癥通路上的多個靶點，在免疫反應的調節(jié)方面發(fā)揮重要作用[3]。miRNA是生物體內長度約23個核苷酸左右的非編碼小RNA，可與蛋白編碼的mRNA互補配對而在轉錄后水平抑制靶基因表達[4]。它也能通過調控膿毒癥信號轉導通路中一些關鍵分子而間接調節(jié)促炎因子和抗炎因子的表達平衡[5]。鑒于miRNA對膿毒癥炎癥反應具有調節(jié)作用，深入研究其在金黃色葡萄球菌膿毒癥炎癥反應中的作用，可對該病的預防和治療開拓一種潛在思路。

miR-16能防止炎癥反應過度擴大[6]，在促進多種炎癥介質的降解方面發(fā)揮必要性作用[7]。miR-16與金黃色葡萄球菌膿毒癥是否有關聯，目前尚無報道。本研究根據膿毒癥定義及嚴重程度分類標準，收集了不同嚴重程度的金黃色葡萄球菌膿毒癥臨床血標本，通過熒光定量PCR檢測患者血液中miR-16表達水平，采用統計學方法探討了miR-16表達是否與膿毒癥嚴重程度有關聯。為了進一步探討miR-16的臨床意義，本文也將其表達水平與CRP和PCT值進行了相關性分析。期望可為進一步探討miR-16在金黃色葡萄球菌膿毒癥發(fā)生中的調控機制奠定基礎，為該菌膿毒癥的預防和治療找到合理、有效的切入點。

1 材料與方法

1.1 患者與健康對照 根據臨床資料選取合適的膿毒癥患者，臨床病例和健康對照均顯示無慢性炎癥反應性基礎疾病史。本研究納入了24例金黃色葡萄球菌膿毒癥患者、8例革蘭氏陰性菌膿毒癥患者和24例健康對照者，標本采集均獲得了受試者的知情同意。血液標本在診斷為膿毒癥后的4 h內采集，抽取患者的抗凝血標本。抽取新鮮血液后，立即將標本轉移至無RNA酶試管，用Trizol液裂解血標本，置于-80 ℃冰箱保存待用。

依據《華盛頓國際膿毒癥定義會議標準》定義膿毒癥，患者符合：存在感染所致的損害性全身炎癥反應綜合征(SIRS)，有明確或疑似感染灶，以及器官存在損害表現。診斷標準為患者有明確的感染或可疑感染，同時伴有發(fā)熱(體溫>38.3 ℃)或低溫(<36.0 ℃)；心率大于90 bpm或大于不同年齡的正常2個標準差；氣促大于30 bpm，意識狀態(tài)發(fā)生變化；明顯水腫，或液體正平衡大于20 mL/kg超過24 h；高糖血癥但未顯示糖尿病史。嚴重程度分級依據《2012年國際嚴重膿毒癥及膿毒性休克診療指南》和參考文獻[8]。

1.2 主要材料與試劑 從http://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/網站搜索miR-16序列(UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG)，miR-16特異性引物由瑞博生物技術有限公司合成，血標本裂解液(Trizol，#R401-01)和熒光定量PCR試劑(SYBR Green Master Mix，#Q111-02)購自Vazyme生物技術有限公司，microRNA抽提試劑盒(miRcute miRNA isolation kit，#DP501)購自天根生化科技有限公司。采用羅氏電化學發(fā)光儀E170測定PCT值，采用BECKMAN特定蛋白儀IMMAGE 800測定CRP值。氯仿、苯酚和乙醇均購自鼎國生物技術有限公司。熒光定量PCR采用LightCycler 480 PCR儀(羅氏)，逆轉錄采用S1000 Thermal Cycler PCR儀(美國伯樂)。

1.3 實驗方法 取新鮮全血1 mL加入等體積Trizol裂解液，置于-80 ℃冰箱保存。小RNA提取時，取出裂解液室溫靜置5 min。12 000 r/min離心分離上清，加入等體積氯仿后室溫12 000 r/min離心，將水相轉移至無RNA酶EP管后加入無水乙醇，室溫放置2 min。將混合液轉移至吸附柱室溫放置2 min，12 000 r/min離心。將離心液加入2/3體積無水乙醇，然后將混合液轉移至miRlute柱，室溫放置2 min，12 000 r/min離心30 s，加入去蛋白液后離心，再加入漂洗液、離心，最后用無RNA酶的去離子水洗脫目標RNA。RNA逆轉錄的體系為無RNA酶水3.5 μL、4 X g DNA Wiper 2 μL、引物(2 μmol/L)0.5 μL和模板RNA 2 μL，條件為42 ℃ 2 min，然后加入2 μL 5 X HiScript Ⅱ，再50 ℃ 15 min和85 ℃ 2 min。熒光定量體系為BYBR Green 10 μL、引物各0.8 μL、逆轉錄模板2 μL和去離子水7.2 μL，反應條件為：95 ℃ 5 min，1個循環(huán)；95 ℃ 10s，60 ℃ 30s,40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95℃ 15 s，1個循環(huán)。CRP和PCT測定均按照生產商的操作說明進行。熒光定量實驗每個標本設置3復孔，每個實驗重復3次。

1.4 統計學分析 采用2-ΔΔCT法計算miRNA表達水平。用SPSS 13.0軟件(IBM，New York，USA)進行統計學分析。熒光定量檢測數據采用均數±標準差表示，組間采用ANOVA方差分析，采用非參數Spearman法進行相關性分析。P<0.05為有統計學差異。

2 結 果

本研究納入了24例金黃色葡萄球菌膿毒癥患者，其中膿毒性休克、嚴重膿毒癥和輕度膿毒癥各8例，標本主要來源于浙江省人民醫(yī)院檢驗中心和感染科。膿毒癥患者來源于ICU和老年呼吸病房，健康對照患者來源于門診體檢。本研究收集的金黃色葡萄球菌膿毒癥病例全部為60周歲以上患者，男性和女性患者分別為14例和10例。在符合膿毒癥定義和分類基礎上，所選病例的患者體溫、WBC和中性粒細胞比值均明顯符合細菌感染的臨床指征。

miR-16熒光定量結果以及PCT和CRP測定值如表1所示(均值±SD，n=8/組)。采用2-ΔΔCT法計算miR-16熒光定量值，數值通過健康對照組進行了校正。根據實驗結果，一般膿毒癥、嚴重膿毒癥和膿毒性休克組的miR-16表達量均值分別為0.2656±0.0727、0.0188±0.0043和0.0046±0.0006。與健康對照組相比，3組分別降低了3.8、53.2和217.4倍。PCT和CRP值也隨著膿毒癥程度的加重而升高(均值±SD，n=8/組)。

表1 各組受試者miR-16熒光定量值以及CRP和PCT測定值(均值±SD，n=8)
Tab.1 Measured miR-16 values and CRP and PCT values in each group (means±SD,n=8)

健康對照組Healthycontrolgroup(n=8)膿毒癥患者組Sepsispatientgroup(n=24)一般膿毒癥組Generalsepsisgroup(n=8)嚴重膿毒癥組Severesepsisgroup(n=8)膿毒性休克組Septicshockgroup(n=8)PRNAquantitativevalue10.2656±0.07270.0188±0.00430.0046±0.0006<0.001PCTvalue(ng/mL)0.18±0.050.32±0.050.61±0.134.5±3.1<0.05CRPvalue(mg/L)5.35±2.8442.16±21.8495.63±18.55289.75±154.91<0.001

注：P值計算是依據各膿毒癥組v.s.健康對照組。
Note: The p value was calculated based on each sepsis group v.s. healthy control group.

本文的金黃色葡萄球菌膿毒癥均為60周歲以上患者，為了排除患者的生理因素對miR-16表達水平的影響，本文選取了24例來自不同年齡段的健康受試者進行了miR-16表達水平的比較，60周歲、18-59周歲和2-18周歲的受試者各8例，miR-16表達水平檢測結果如圖1所示。結果表明，3個年齡組的健康受試者miR-16的表達水平沒有統計學差異(P≥0.05)。

在金黃色葡萄球菌膿毒癥中，實驗組相對于健康對照組miR-16水平均呈顯著性下降，而且隨著膿毒癥嚴重度增加，miR-16表達量也逐漸降低。經統計學分析，一般膿毒癥組相對于其他組均具有統計學差異(P<0.001)，嚴重膿毒癥組與膿毒性休克組之間也具有統計學差異(P=0.003)。本研究也同時測定了8例革蘭氏陰性菌膿毒癥患者的miR-16表達水平，結果顯示其表達水平顯著升高(圖2，組1)。

為探究miR-16表達與CRP和PCT之間的關聯性，本文也進行了兩者的趨勢分析。經過非參數Spearman分析，miR-16與CRP和PCT的相關系數分別為-0.561和-0.769，表明miR-16與CRP和PCT值存在負相關性(圖3)。

圖1 不同年齡段健康受試者的miR-16表達水平Fig.1 Expression of miR-16 in healthy subjects of different ages

1組：革蘭氏陰性菌膿毒癥患者組；2組、3組和4組分別代表金黃色葡萄球菌一般膿毒癥組、嚴重膿毒癥組和膿毒性休克組Group 1: Sepsis group with gram-negative bacterial infection; Group 2,group 3 and group 4 is the general sepsis group,severe sepsis group and septic shock group with Staphylococcus aureus infection,respectively.圖2 革蘭氏陰性菌和金黃色葡萄球菌膿毒癥患者的miR-16表達水平分析Fig.2 Expression of miR-16 in gram negative bacteria and Staphylococcus aureus sepsis

圖3 患者miR-16表達水平與CRP和PCT的相關性分析Fig.3 Analysis of the correlation between miR-16 expression and CRP and PCT in patients

3 討 論

金黃色葡萄球菌膿毒癥在革蘭氏陽性菌中已躍居首位[9]。細菌膿毒癥的研究目前多見于革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌膿毒癥研究較少，探討該菌膿毒癥相關機制具有較大臨床價值。miRNA可作為感染性疾病診斷和治療的潛在靶標[10]，但其產生和致病相關的機制尚不清楚。膿毒癥與非感染性全身性炎癥反應綜合征區(qū)別的金標準是血培養(yǎng)，但細菌血培養(yǎng)陽性率較低[11]，因此選取合適血清標志物對于膿毒癥輔助診斷較有意義。

本研究發(fā)現，在金黃色葡萄球菌膿毒癥患者中miR-16表達水平與膿毒癥嚴重程度呈明顯負相關，各組之間有統計學差異，與炎癥指標PCT和CRP有負相關，提示其可作為金黃色葡萄球菌膿毒癥診斷或治療的潛在靶標，具有較大的潛在臨床應用價值。然而，本文發(fā)現miR-16在革蘭氏陰性菌膿毒癥中表達水平顯著升高。研究[12]也曾在革蘭氏陰性菌中發(fā)現miR-16在膿毒癥患者中相對于健康對照組表達量明顯升高。膿毒癥本質上是由病原體感染誘發(fā)的炎癥反應，但其機制較為復雜[13]，革蘭氏陽性和陰性菌主要分別存在脂多糖(LPS)和脂磷壁酸(LTA)，兩者在膿毒癥發(fā)病機制方面會有所不同[14-15]。為了排除患者生理因素可能影響miR-16表達，本文選取了不同年齡組的健康受試者進行了miR-16水平測定，結果顯示miR-16表達在不同年齡組的健康受試者中沒有統計學差異(P>0.05)，表明患者的生理因素不會對miR-16表達水平造成影響。本文將miR-16表達水平與相應的CRP和PCT測定值進行了相關性分析，發(fā)現存在明顯的負相關性，表明miR-16可潛在作為金黃色葡萄球菌膿毒癥嚴重程度的分子標記物。

miRNA參與膿毒癥誘導性炎癥反應信號通路的作用尚不太清楚，但有證據顯示Toll樣受體(TLR)家族介導了膿毒癥炎癥發(fā)生[16]，該受體是一種可感知保守性病原體相關分子(PAMP)的跨膜蛋白。TLR活化時，其可通過下游激酶激活NF-κB等促炎因子進行炎癥反應的調控[16]。TLR家族在不同類別細菌中作用方式不同，TLR2和TLR4分別被革蘭氏陽性和陰性菌的成份激活[17]。因此，后續(xù)可通過探討TLR2和NF-κB等信號通路的激活狀況，進一步研究miR-16在金黃色葡萄球菌膿毒癥中的致病機制。

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Expression level of miR-16 inStaphylococcusaureussepsis and its clinical significance

WANG Jia-xue1,CHEN Yan2,LIU Xiao-xiang3,SUN Ai-hua3, YANG Jun1,LYU Huo-yang4,ZHOU Yong-lie4

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,HangzhouMedicalCollege,Hangzhou310053,China; 2.SpecialWard,ZhejiangTaizhouHospital,Taizhou317000,China; 3.DepartmentofBasicMedicine,HangzhouMedicalCollege,Hangzhou310053,China; 4.TheCenterofClinicalLaboratory,ZhejiangProvincePeople'sHospital,Hangzhou310014,China)

We investigated correlation between the level of miR-16 expression and the severity ofStaphylococcusaureussepsis,and further explored its potentially clinical significance. Blood samples were collected from 32 patients,including each 8 cases of septic shock,severe sepsis and general sepsis,as well as 8 cases of healthy volunteers. Blood samples from 24 cases of healthy subjects with different ages were measured,and additionally 8 cases of blood samples from gram negative bacteria sepsis were also determined in current study as a control. Trizol solution for the whole blood lysis was added into blood samples,and followed by the extraction of microRNA. The expression levels of miR-16 in different groups were measured by fluorescence quantitative PCR,in which 2-Delta Ct method was used. SPSS software (version 13.0) was used to analyze the statistical differences between the groups,and further analyze the correlation between miR-16 value and the corresponding CRP and PCT values. Results showed that the expression level of miR-16 was negatively correlated with the severity ofStaphylococcusaureus

sepsis. There were statistically significant differences in experimental groups when compared with the control (P<0.001),and there was also a statistically significant difference between each experimental group (P<0.01). We found that the expression level of miR-16 was negatively correlated with CRP and PCT,the correlation coefficients were -0.561 and -0.769 respectively,and trend analysis showed that there was a significantly negative correlation. A significantly negative correlation was found between the miR-16 expression level and severity of sepsis,suggesting that miR-16 may serve as a biomarker for the severity ofStaphylococcusaureussepsis.

miR-16;Staphylococcusaureus; sepsis

Sun Ai-hua,Email: sunah123@126.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.05.008

浙江省自然科學基金(LY16H190006)；國家自然科學青年基金(31501581)；浙江省教育廳一般科研項目(Y201534394)；浙江醫(yī)學高等?？茖W?？茖W研究計劃項目(2015XZA02)。

孫愛華，Email: sunah123@126.com

1.杭州醫(yī)學院檢驗醫(yī)學院，杭州 310053； 2.浙江省臺州醫(yī)院特需病區(qū)，臺州 317000； 3.杭州醫(yī)學院基礎醫(yī)學部，杭州 310053； 4.浙江省人民醫(yī)院臨床檢驗中心，杭州 310014

R378.1

A

1002-2694(2017)05-0427-05

2016-08-29 編輯：張智芳

Supported by Natural Science Foundation of Zhejiang Province (No. LY16H190006),the National Natural Science Foundation of China (No. 31501581),the Scientific Research Foundation of Zhejiang Provincial Department of Education (No. Y201534394),and the Scientific Research Plan Project of Hangzhou Medical College (No. 2015XZA02)