“珍珠-25”味丸對(duì)小鼠心臟組織VEGF基因mRNA的影響研究

韓光明 特格喜白音 杭呼格吉樂(lè)

內(nèi)蒙古自治區(qū)國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010065

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“珍珠-25”味丸對(duì)小鼠心臟組織VEGF基因mRNA的影響研究

韓光明 特格喜白音 杭呼格吉樂(lè)

內(nèi)蒙古自治區(qū)國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010065

目的：研究蒙藥“珍珠-25”味丸對(duì)小鼠心臟與動(dòng)脈VEGF基因mRNA的作用。方法：蒙藥“珍珠-25”味丸溶液以2次/d，連續(xù)給藥4周后把小鼠斷頸處死，取小鼠心臟用TRIzol法提取總RNA。然后設(shè)計(jì)小鼠VEGF基因響應(yīng)引物，利用qPCR技術(shù)監(jiān)測(cè)蒙藥“珍珠-25”味丸作用下的小鼠心臟VEGF基因mRNA變化。結(jié)果：各組小鼠VEGF mRNA 的表達(dá)水平在低劑量、中級(jí)量、高劑量組與對(duì)照組相比明顯增加，中劑量組和高劑量組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論：蒙藥“珍珠-25”味丸對(duì)小鼠心臟與動(dòng)脈VEGF基因mRNA有調(diào)控作用。

蒙藥；心血管疾病；VEGF

心腦血管疾病是危害人類(lèi)健康最嚴(yán)重的一類(lèi)疾病，發(fā)病因素包括：肥胖、胰島素抵抗、糖代謝異常、凝血因子升高、慢性炎癥、睡眠呼吸障礙等；此外與年齡、性別、家族史、吸煙、高血壓、糖尿病、脂代謝紊亂等也有一定的關(guān)系。最近研究表明血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)對(duì)于許多心血管疾病有著重要的生物學(xué)意義和臨床意義[1-2]。VEGF以血管內(nèi)皮細(xì)胞為特異性靶細(xì)胞，對(duì)一些伴有血管內(nèi)皮損傷的心血管疾病具有較好的實(shí)驗(yàn)治療作用，面臨臨床應(yīng)用的過(guò)渡。VEGF對(duì)側(cè)枝血管形成、動(dòng)脈粥樣硬化病變、血管通透性、血管損傷后的修復(fù)及腫瘤形成的影響極為突出[3,6,7]。VEGF是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一特異性促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂的生長(zhǎng)因子，由于內(nèi)皮細(xì)胞增殖是血管形成的重要部分，故VEGF可在新生血管的形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，因此對(duì)心血管疾病具有潛在的治療意義[8-10]。

蒙醫(yī)認(rèn)為心腦血管病屬于蒙醫(yī)學(xué)“脈管病”范疇，主要機(jī)制是機(jī)體在外因的作用下使體內(nèi)三根元素與七素平衡紊亂，使之心血管功能產(chǎn)生數(shù)到質(zhì)的變化。蒙醫(yī)學(xué)在治療心血管疾病的過(guò)程中創(chuàng)建了許多良好的方子[4]。其中，二十五味珍珠丸是蒙醫(yī)經(jīng)典方劑，始載于公元8世紀(jì)的藏醫(yī)古典巨著《四部醫(yī)典》中，以珍珠、珍珠母、訶子、余甘子等25味藥按君臣佐使等原則組成，是蒙醫(yī)治療“黑脈病”(相當(dāng)于西醫(yī)心腦血管病和半身不遂的總稱(chēng))的傳統(tǒng)驗(yàn)方。為開(kāi)竅劑，具有安神開(kāi)竅的功效，用于中風(fēng)、半身不遂，口眼歪斜、昏迷不醒、神志紊亂、譫語(yǔ)發(fā)狂等疾病。蒙藥“珍珠-25”味丸是名老蒙醫(yī)陳玉良教授用來(lái)治療心腦血管疾病的良方，該制劑用于臨床40多年療效明顯。雖有良好的治療效果，但其具體的作用機(jī)制并不明確。研究以蒙藥“珍珠-25”味丸治療心血管疾病為實(shí)驗(yàn)依據(jù)，研究蒙藥“珍珠-25”味丸對(duì)血管內(nèi)皮功能基因VEGF的保護(hù)作用，從而進(jìn)一步探討蒙藥“珍珠-25”味丸對(duì)血管內(nèi)皮功能異常對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化(AS)發(fā)病機(jī)制的影響[4-5]。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Leica 200M 2000 解剖顯微鏡(Nikon)，Ti-U型倒置顯微鏡，TRACE1300-ISQ LT氣質(zhì)聯(lián)用儀，實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems 7500)， 2720-PCR儀(Applied Biosystems)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c小鼠(北京華阜康生物科技有限公司)，雄性，4～6周齡，體重18～20 g，無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)飼養(yǎng)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥 選取培養(yǎng)至第10-14d的BALB/c 小鼠，隨機(jī)分為空白組(生理鹽水)、蒙藥“珍珠-25”味丸各劑量(低劑量100μM；中劑量200μM；高劑量500μM)組，2次/d，連續(xù)灌胃4周后把小鼠斷頸處死，解剖取出心臟放入液氮保存。

2.2 TRIzol法RNA的提取 利用TRIzol法提取小鼠心臟的總RNA，為清除殘留的基因組DNA，每個(gè)RNA 樣本中加入10U DNaseⅠ(Takara，日本)37℃孵育30min。3個(gè)RNA 樣本的濃度被測(cè)定后，每個(gè)樣本各取10μg等量混合組成1個(gè)RNA 池(RNA pool，共30μg)。接著使用Oligotex mRNA Midi Kit(Qiagen，德國(guó))分離純化樣品mRNA。整個(gè)流程RNA 的質(zhì)量和含量通過(guò)使用Nanodrop ND-1000(LabTech，美國(guó))檢測(cè)吸光度 (A260/A280)進(jìn)行測(cè)定, RNA 的完整性通過(guò)1.2%的凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，然后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.1 RNA濃度測(cè)定 RNA濃度=(OD260-OD320)×稀釋倍數(shù)×0.04μg/μL。OD230，260，280，320分別是鹽濃度、核酸、蛋白質(zhì)等有機(jī)物和背景(溶液混濁度)的吸光度值。

2.2.2 RNA 凝膠電泳實(shí)驗(yàn) ①取出提前制備好的瓊脂糖凝膠，將凝膠放入電泳槽。加入1×TAE緩沖液恰好過(guò)膠面約1mm即可。②先加10μL Marker于點(diǎn)樣孔中，注意不要將凝膠弄破。③在各樣品中加入2μL，充分混合后，取10μL于點(diǎn)樣孔中。④接通電源，使樣品槽在負(fù)極端，用15v/cm的電壓，電泳30min時(shí)間。⑤電泳結(jié)束后，將含EB的凝膠直接放在凝膠成像分析系統(tǒng)上，打開(kāi)抽屜燈箱拍照觀(guān)察。操作需在暗室觀(guān)察。

2.3 RT-PCR驗(yàn)

2.3.1 引物設(shè)計(jì) ①β-ACTIN上游引物：5' -CCTGTATGCCTCTGGTCGTA-3'；下游引物：5'-CCATCTCCTGCTCGAAGTCT3-'。②VEGF上游引物：5'-CCATGAACTTTCTGCTCTTC-3'；下游引物：5'-GGTGAGAGGTCTAGTTCCCGA-3'。

2.3.2 試劑配制及PCR ① RNA 1μg； Olig 1μL； dNTP2μL； dH2O 6μL。反應(yīng)溫度：65℃ 5min；4℃min。②上述反應(yīng)液 10μL；5×primer script buffer 6μL；RNase inhibitor 1μL; Reverse TranscriptasexL 1μL； dH2O 4μL。反應(yīng)溫度：42℃ 30min； 72℃ 15min;4℃ 5min。③10×buffer2μL；MgCl2 1.2μL； dNTP 0.4μL； Tag 0.3μL； dH2O 13.5μL；primer1 0.2μL；primer2 0.2μL； SYSB 1μL；cDNA 1μg；反應(yīng)溫度：95℃ 5min；95℃ 15sec；58℃ 20sec；68℃ 1min。

2.4 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以表示組間比較，采用t檢驗(yàn)；率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 小鼠心臟總RNA的提取 利用TRIzol方法提取小鼠心臟總RNA，然后用微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，用0.8%的凝膠進(jìn)行RNA電泳實(shí)驗(yàn)。由圖1可知，本次提取總RNA的實(shí)驗(yàn)非常成功，箭頭所指部位是RNA的雙條鏈條。

3.2 小鼠VEGF基因引物的設(shè)定 引物又名引子，是一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA復(fù)制的起始點(diǎn)，在核酸合成反應(yīng)時(shí)，作為每個(gè)多核苷酸鏈進(jìn)行延伸的出發(fā)點(diǎn)而起作用的多核苷酸鏈，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯鏈形式進(jìn)行合成，因此引物的3′-OH，必須是游離的。另外，在DNA合成中DNA聚合酶僅僅可以把新的核苷酸加到已有的DNA鏈上。本次實(shí)驗(yàn)根據(jù)β-actin和VEGF基因序列設(shè)計(jì)了兩對(duì)β-actin引物和兩對(duì)VEGF引物，利用PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了β-actin和VEGF基因的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明VEGF(2)和β-actin(1)的擴(kuò)增情況良好。見(jiàn)圖2。

3.3 對(duì)小鼠心臟VEGF基因mRNA變化的影響 各組小鼠VEGF mRNA 的表達(dá)水平在低劑量、中劑量、高劑量組與對(duì)照組相比明顯增加，中劑量組和高劑量組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果如圖3。

4 討 論

心腦血管疾病嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，50歲以上中老年人較為常見(jiàn)，具有高患病率、高致殘率和高死亡率的特點(diǎn)，全世界每年死于心腦血管疾病的人數(shù)高達(dá)1500萬(wàn)人，居各種死因首位[11]。傳統(tǒng)蒙藥“珍珠-25”味丸具有安神開(kāi)竅作用，常用于治療心肌炎、心絞痛、心肌梗塞、心律失常(心動(dòng)過(guò)速、心律不齊)、先天性心臟病、風(fēng)濕性心臟病及動(dòng)脈硬化癥等。該藥組方簡(jiǎn)潔合理，藥源廣泛易得。將其原劑型研究改進(jìn)成膠囊劑，為本品的質(zhì)量穩(wěn)定、服用方便、充分發(fā)揮療效奠定了良好基礎(chǔ)，但制備工藝有待進(jìn)一步提高完善。“珍珠-25”味丸頒布標(biāo)準(zhǔn)尚缺含量測(cè)定鑒別項(xiàng)目，且質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)亟待進(jìn)一步深入研究，以保證為臨床提供一種質(zhì)量穩(wěn)定可控的、療效確切的、安全無(wú)毒或低毒的、具有民族特色的蒙藥新制劑。

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Study on Mongolian medicine Pearl Pill -25 effect on mRNA VEGF gene in mouse heart tissue

HAN Guangming Tegexibaiyin HANG Hugejile

Inner Mongolia International Mongolian Hospital,Hohhot 010065,China

Objective Analysis of effect of Mongolian medicine Pearl -25 Pill on mice heart and arterial VEGF gene mRNA.Methods We prepared the Mongolian medicine Pearl Pill -25 solution with 2d administered continuously for 4 weeks after the mice were sacrificed the mice heart by TRIzol method to extract total RNA.Then the mouse VEGF gene response primer was designed.Finally, using the mouse heart VEGF gene mRNA qPCR technology to monitor the change of Mongolian medicine Pearl Pill under -25.Results The expression level of VEGF mRNA in each group was significantly lower than that in the control group, the middle dose group and the high dose group had statistical significance (P<0.01). Conclusion The Mongolian medicine Pearl -25 pill could regulate mouse cardiac and arterial VEGF gene mRNA.

Mongolian Medicine； Cardiovascular Disease；VEGF

內(nèi)蒙古衛(wèi)紀(jì)委科研計(jì)劃項(xiàng)目(201301014)。

韓光明(1969-)，男，蒙古族，主任醫(yī)師，研究方向?yàn)樾难芗膊　-mail:tegexibaiyin@yeah.net

R29

A

1007-8517(2017)09-0034-03

2017-03-03 編輯：陶希睿)