金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌多重PCR方法的建立與初步應用

祝巖波，鄭 龍，尤紅煜，王 璇，梁曉亮，劉健敏，張東明，連偉光，栗彥寧，王俊霞*

(1.河北省實驗動物重點實驗室，河北醫科大學實驗動物學部，石家莊 050000； 2.河北醫科大學第二醫院，石家莊 050000)

技術方法

金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌多重PCR方法的建立與初步應用

祝巖波1，鄭 龍1，尤紅煜1，王 璇2，梁曉亮1，劉健敏1，張東明1，連偉光1，栗彥寧1，王俊霞1*

(1.河北省實驗動物重點實驗室，河北醫科大學實驗動物學部，石家莊 050000； 2.河北醫科大學第二醫院，石家莊 050000)

目的 建立金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌多重PCR檢測方法，為實驗動物細菌檢測提供快速、靈敏、簡便的方法。方法 根據金黃色葡萄球菌nuc基因、綠膿桿菌LasI基因、肺炎克雷伯桿菌PhoE基因和細菌通用16S rRNA基因設計出特異性引物；經過多重PCR引物濃度和退火溫度的優化，特異性和敏感性的檢測，建立多重PCR體系。應用該PCR體系對人工感染標本、實驗動物糞便樣本進行驗證檢測,與傳統檢測方法對比。結果 多重PCR分別擴增出金黃色葡萄球菌(153 bp)、綠膿桿菌(600 bp)、肺炎克雷伯桿菌(368 bp)和通用(520 bp)的目的條帶。多重敏感性為10 pg，特異性檢測未從其他細菌中檢測出目的條帶。應用建立的多重PCR體系檢測出不同組合的人工感染標本，從76只糞便檢測出綠膿桿菌陽性1例,與傳統檢測方法結果一致。結論 本文建立的多重PCR方法具有特異、靈敏、簡便、快速等優點，為實驗動物微生物的快速檢測提供了可靠的方法。

金黃色葡萄球菌；綠膿桿菌；肺炎克雷伯桿菌；多重PCR

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S．aureus)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa，P．aeruginosa)和肺炎克雷伯桿菌(Klebsiellapneumoniae，K．pneumoniae)均為人畜共患病的條件致病菌，是我國SPF級別實驗動物大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠、兔等必須排除的病原體。三種病原體在實驗動物機體免疫功能低下、實驗刺激等情況下，可能導致呼吸道和消化道等疾病，嚴重感染甚至造成動物死亡[1]。近幾年實驗動物質量監測結果顯示，金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌等條件致病菌陽性時有發生[2-4]。目前我國實驗動物微生物等級及監測標準GB/T14926．13—2001，GB/T14926．14—2001，GB/T14926．17—2001，針對上述三種條件致病菌采用的是傳統的分離培養和生化鑒定方法進行檢測，此種方法費時費力，而且實驗人員需要具備較高的專業素質。目前分子生物學方法對于細菌、病毒的檢測已得到廣泛應用，本研究探討了多重PCR方法對上述三種細菌進行檢測的方法，為建立快速、準確和簡便的檢測方法提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

本實驗所用菌種金黃色葡萄球菌(ATCC6538)由石家莊市疾控中心惠贈，綠膿桿菌(CMCC10110)、多殺巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌由中國食品藥品檢定研究院惠贈，肺炎克雷伯桿菌(CMCC46117)購自廣東省微生物菌種保藏中心。支原體分離株，大腸桿菌，志賀菌，乙型溶血性鏈球菌本室保存。

1.1.2 動物樣本

隨機抽檢來自河北省實驗動物中心，河北醫科大學第三醫院和河北醫科大學第四醫院動物實驗室的共計76只清潔級活體動物糞便樣本及回盲部內容物，其中包含21只大鼠，36只小鼠，6只豚鼠，5只地鼠，8只兔。

1.1.3 引物

根據金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌的特異性區域設計相應引物，引物基因、引物序列、產物長度和文獻出處見表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.4 試劑

普通營養瓊脂培養基，營養肉湯培養基，甘露醇氯化鈉瓊脂培養基(SP)，NAC液體培養基，NAC瓊脂培養基，DHL瓊脂平皿，血瓊脂平皿，均購自北京三藥科技開發公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，糞便基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。細菌生化鑒定管購自杭州天和微生物試劑有限公司； Mix購自康為世紀；Tris購自Solarbio公司；DNA Ladder購自南京諾唯贊生物科技有限公司；瓊脂糖Agarose購自BIOWEST公司；核酸染料ExRed購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

1.1.5 儀器

所用微量分光光度計為NanoDrop為基因公司；PCR儀為美國ABI 9700；凝膠成像系統為美國UVPGDS-8000。

表1 引物序列

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌DNA的提取

注：(A)M.100 bp DNA Ladder;1～4,金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯桿菌和綠膿桿菌引物濃度均為0.2 μmol/L,通用引物濃度分別為0.2 μmol/L,0.1 μmol/L,0.05 μmol/L,0.025 μmol/L;(B)M.100 bp DNA Ladder;1～4,退火溫度分別56℃,58℃,60℃,62℃。圖1 多重PCR引物濃度和退火溫度的優化Note.(A)M.100 bp DNA Ladder;1～4, Staphylococcus aureus、Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella pneumoniae primer concentrations is 0.2 μmol/L,universal primer concentration is 0.2 μmol/L,0.1 μmol/L,0.05 μmol/L,0.025 μmol/L;(B)M.100 bp DNA Ladder;1～4, annealing temperature is 56℃,58℃,60℃,62℃.Fig.1 Optimization of multiplex PCR in primer concentrations and annealing temperature

標準菌株復蘇培養后，天根細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，操作根據試劑盒說明進行。經紫外分光光度計檢測，測取各菌株的濃度。

1.2.2 糞便DNA的提取

收集活體動物糞便用天根糞便基因組DNA提取試劑盒按照使用說明提取基因組DNA。

1.2.3 多重PCR反應體系和反應條件

PCR反應體系為50 μL，包括：Mix 25 μL，引物 6.5 μL(金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯桿菌和綠膿桿菌反應體系終濃度分別0.2 μmol/L，通用引物0.05 μmol/L)，DNA 3 μL。

反應條件為94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共30個循環; 72℃ 7 min。PCR產物在2.5% 瓊脂糖凝膠中，120 V 電泳30 min。

1.2.4 特異性檢測

用所建立的多重PCR體系分別擴增多殺巴氏桿菌，支氣管敗血性波氏桿菌，支原體分離株，大腸桿菌，志賀菌，乙型溶血性鏈球菌來檢測所建方法的特異性。

1.2.5 敏感性檢測

將金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯桿和綠膿桿菌的DNA按照1∶1∶1混合，并做10 倍系列稀釋至10-5倍濃度，每種濃度取3 μL作為PCR反應模板，不同稀釋濃度病原體模板質量分別為10 ng，1 ng，100 pg,10 pg,1 pg,100 fg，檢驗多重PCR的敏感性。

1.2.6 應用

將金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯桿菌和綠膿桿菌分別混入動物糞便中，提取糞便DNA，使用三種病原菌多重PCR方法擴增；收集21只大鼠，36只小鼠，6只豚鼠，5只地鼠，8只兔共76份動物糞便，提取糞便DNA，使用三種病原菌多重PCR方法檢測，將陽性擴增產物測序，測序結果與Genebank公布序列進行比對。將回盲內容物根據國家標準的傳統檢測方法分離培養鑒定，將其結果與多重PCR結果進行比對。

2 結果

2.1 PCR引物濃度和退火溫度的優化

分別對金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯桿菌和綠膿桿菌進行單重PCR實驗，結果顯示金黃色葡萄球菌擴增出153 bp產物，肺炎克雷伯桿菌擴增出368 bp產物，綠膿桿菌擴增出600 bp產物，細菌通用引物擴增出520 bp產物。多重PCR體系引物濃度優化，當3種病原菌引物濃度均為0.2 μmol/L時，比較通用引物濃度分別為0.2、0.1、0.05、0.025 μmol/L時擴增效果，結果顯示通用引物濃度0.05 μmol/L時，四條擴增條帶較均一清晰(見圖1A)。多重PCR擴增體系退火溫度優化，結果顯示60℃退火溫度時，四條擴增條帶較清晰均勻(見圖1B)。

2.2 特異性

用建立的多重PCR方法擴增多殺巴氏桿菌、支氣管敗血性波氏桿菌、支原體、大腸桿菌志賀菌和乙型溶血性鏈球菌，結果顯示只出現一條細菌通用引物擴增目的條帶，無其他陽性產物(見圖2)。

注：(M)100 bp DNA Ladder；(1)陽性對照;(2)多殺巴氏桿菌；(3)支氣管敗血性波氏桿菌；(4)支原體;(5)大腸桿菌；(6)志賀菌；(7)乙型溶血性鏈球菌。圖2 多重PCR特異性Note.(M)100 bp DNA Ladder;(1)Positive control；(2)Pasteurellamultocida；(3)Bordetella bronchiseptica;(4)Mycoplasma pneumoniae;(5)Escherichia coli;(6)Shigella;(7)β-hemolytic streptococcus.Fig.2 Specificity results of multiplex PCR

2.3 敏感性

三種病原菌金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯桿菌和綠膿桿菌多重PCR敏感性實驗結果顯示，每種病原菌DNA最低檢測質量均為10 pg，見圖3。

2.4 應用

注：(M)100 bp DNA Ladder；(1)陽性對照;(2)陰性對照；(3，8)正常糞便；(4，9)加金黃色葡萄球菌；(5，10)加綠膿桿菌；(6，11)加肺炎克雷伯桿菌；(7,12)加金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌。圖4 多重PCR的人工感染標本檢測結果Note.(M)100 bp DNA Ladder;(1)Positive control；(2)Negative control；(3,8)Normal feces；(4,9)Staphylococcus aureus；(5,10)Pseudomonas aeruginosa；(6,11)Klebsiella pneumoniae；(7,12)Three bacteria.Fig.4 multiplex PCR detection results of artificial positive samples

使用多重PCR方法對人工感染的糞便DNA樣本進行擴增，結果顯示與預期結果一致，并無非特異性產物擴增(見圖4)；用多重PCR體系對收集的76份動物糞便DNA檢測，結果顯示有一例樣本在約600 bp處有一條擴增條帶，與綠膿桿菌擴增產物條帶大小相似(見圖5)，送測序，測序結果與Genebank綠膿桿菌DNA 序列一致。

注：(M)100 bp DNA Ladder；(1～6)質量分別為10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg。圖3 多重PCR敏感性Note.(M)100 bp DNA Ladder;(1～6)The quality is 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg.Fig.3 Sensitivity results of multiplex PCR

3 討論

金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌屬于人畜共患病的病原菌，均屬我國SPF級實驗動物必須排除的病原菌。目前我國實驗動物的金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌的檢測仍采用國家標準推薦的傳統的分離培養方法和生化鑒定。該方法經典、準確，但操作繁瑣，費時，實驗條件限定和檢測人員的主觀判定使得該方法各檢測室之間易出現結果的差異[2，3]。因此急需建立一種快速、準確的新檢測方法。

金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌PCR方法早已在微生物檢測中應用，但之前方法每次只能檢測一種細菌，檢測效率低，工作量大，影響了廣泛的應用[8]。本文根據金黃色葡萄球菌nuc基因、綠膿桿菌LasI基因、肺炎克雷伯桿菌PhoE基因和細菌通用16S rRNA基因設計出特異性引物建立了可以同時檢測三種實驗動物條件致病菌的三重PCR方法。并在反應體系中加入由16S rRNA基因設計的細菌通用引物，作為內質控，在病原菌檢測中可以根據通用引物擴增條帶的情況判定反應體系是否完好及評估體系中加入的模板質量。

注：A：(M)100 bp DNA Ladder；(1)陽性對照;(2)陰性對照；(3～12)小鼠糞便樣本。B：(M)100 bp DNA Ladder；(1)陽性對照;(2)陰性對照；(3～12)小鼠糞便樣本；(13～17)大鼠糞便樣本。圖5 多重PCR糞便樣本檢測結果Note.A：(M)100 bp DNA Ladder;(1)Positive control；(2)Negative control；(3～12)Fecal sample of mice.B:(M)100 bp DNA Ladder；(1)Positive control；(2)Negative control；(3～12)Fecal sample of mice；(13～17)Fecal sample of rats.Fig.5 Feces samples test results of multiplex PCR

在多重PCR條件的優化過程中，金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯桿菌和綠膿桿菌引物濃度均為0.2 μmol/L,通用引物濃度為0.2、0.1、0.05、0.025 μmol/L時，均可獲得四條帶，但在通用引物濃度為0.05 μmol/L時可獲得更明亮均一的條帶，在此引物濃度基礎上，對退火溫度優化，四個溫度均可擴增出目的片段，但60℃最優，同時，其特異性和敏感性良好，因此可以達到一個比較滿意的效果。

因三種病原體均存在于動物糞便中，考慮糞便DNA提取物可能影響多重PCR反應特異性，本研究將金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌三種病原菌分別混入到動物糞便中，提取總DNA，多重PCR方法擴增結果與預期結果一致，能夠準確的檢測出不同的菌株組合，并且沒有非特異性擴增。為了驗證本方法在實際實驗動物病原菌檢測中應用性，在多家實驗動物單位取材，取回盲內容物應用傳統分離培養的檢測方法，結果為一例綠膿桿菌感染陽性，同時取相應的實驗動物的活體糞便，提取糞便DNA，使用多重PCR方法檢測三種病原菌，結果顯示在76份活體動物糞便中均可以擴增出通用條帶，檢測到一例綠膿桿菌感染陽性，與傳統方法獲得一樣的結果，初步驗證本方法的可行性。本文建立的多重PCR方法旨在活體檢測，便于對活體動物進行長期的微生物監測，達到質量控制標準。總之，在下面工作中，將進一步擴大檢測樣本量驗證本方法的準確性和實用性。

本方法有良好的重復性，操作簡單、快速，成本較低，可以在實驗動物微生物檢測中進一步應用。

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Establishment and application of a multiplex PCR method inStaphylococcusaureus、PseudomonasaeruginosaandKlebsiellapneumoniae

ZHU Yan-bo1，ZHENG Long1,YOU Hong-yu1,WANG Xuan2,LIANG Xiao-liang1,LIU Jian-min1,ZHANG Dong-ming1，LIAN Wei-guang1,LI Yan-ning1,WANG Jun-xia1*

(1.Department of key laboratory Animal Hebei Province, laboratory Animal Hebei Medical University， Shijiazhuang 050000，China; 2.The Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000,China)

Objective Aiming at detectingStaphylococcusaureus、PseudomonasaeruginosaandKlebsiellapneumoniaein laboratory animals,the paper provides a rapid,sensitive and simple test method.Methods According toStaphylococcusaureusnucgene,PseudomonasaeruginosaLasIgene,KlebsiellapneumoniaPhoEgene and general 16S rRNA gene, designed specific primers ; Through the optimization of multiplex PCR primer concentrations and annealing temperature, the specificity and sensitivity of detection, establishing multiplex PCR system.Application of the PCR system test specimens of artificial infections and experiment animal feces is compared with traditional test method.Results Multiplex PCR amplification ofStaphylococcusaureus(153 bp),Pseudomonasaeruginosa(600 bp) withKlebsiellapneumoniae(368 bp) and general (520 bp).The multiplex sensitivity for the purpose of 10pg, specificity of detection was not detected from other pathogens.Application of establishing multiplex PCR system to detect the artificial positive samples, and detect 1Pseudomonasaeruginosapositive case in 76 fecals.Conclusions This paper established the multiplex PCR method which has the advantages of specific,sensitive,simple and rapid, and provides a reliable way for rapid test in laboratory animals microbiology.

Staphylococcusaureus;Pseudomonasaeruginosa;Klebsiellapneumoniae; Multiplex PCR

國家科技支撐計劃(2015BAI07B02-05)。

祝巖波(1990-)，女，碩士研究生，專業：動物學。E-mail:787211186@qq.com

王俊霞(1962-)，女，教授，研究方向：從事微生物檢驗。E-mail:13333011022@163.com

R-33

A

1671-7856(2017) 05-0094-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.05.020

2016-11-28