胸腺素α1二聚體蛋白的初步毒理學研究

牛東，武都都，高凱麗，王昭維，張存，張英起，張偉，李維娜

1．腫瘤生物學國家重點實驗室；

2.第四軍醫大學 a.藥學系生物制藥學教研室；b.學員一旅二營八連；陜西 西安 710032

胸腺素α1二聚體蛋白的初步毒理學研究

牛東1,2a,2b，武都都1,2a,2b，高凱麗1,2a，王昭維1,2a，張存1,2a，張英起1,2a，張偉1,2a，李維娜1,2a

1．腫瘤生物學國家重點實驗室；

2.第四軍醫大學 a.藥學系生物制藥學教研室；b.學員一旅二營八連；陜西 西安 710032

目的：對胸腺素α1二聚體蛋白開展初步的毒理學研究，為后續系統地進行臨床前研究提供依據。方法：將BALB/c小鼠隨機分為生理鹽水對照組和胸腺素α1二聚體蛋白高、中、低劑量組，觀察胸腺素α1二聚體蛋白給藥后小鼠的一般行為，進行血液生化學指征及組織病理學檢測。結果：動物未見明顯的中毒癥狀和死亡，與對照組相比，高、中、低各劑量胸腺素α1二聚體蛋白注射組的動物行為、活動、體重、進食量等與對照組無顯著差異，血液生化指標與主要臟器組織形態學檢查也均未見異常。結論：未發現胸腺素α1二聚體對小鼠有明顯的毒性作用。

胸腺素α1；二聚體；毒理學；小鼠

胸腺素α1（thymosinα1，Tα1）是一種胸腺來源的酸性多肽，由28個氨基酸殘基組成，是重要的生物調節劑，可以顯著提高生物體的免疫應答能力[1]，臨床上已廣泛用于治療各種原發性或繼發性T細胞缺陷病、某些自身免疫性疾病、乙型肝炎、丙型肝炎以及輔助治療腫瘤[2-6]。其臨床療效確切，毒副作用輕微，具有廣闊的應用前景。

為克服市場上同類藥品存在的純度低、價格昂貴等問題，我們實驗室前期構建和表達了Tα1二聚體（Tα1②）蛋白，實現了Tα1以二聚體的形式在大腸桿菌中高效表達，并用簡便廉價的純化工藝獲得了高產量、高活性的純化產物。細胞學實驗證實Tα1②可以促進小鼠脾淋巴細胞的增值，具有比化學合成單體更高的生物學活性[7]。

為了進行系統的臨床前研究，我們對Tα1②進行了初步毒理學檢測。通過觀察不同劑量Tα1②給藥對小鼠的進食、體重等一般狀況的影響，檢測血清生化學指標、重要臟器相對重量、組織病理學情況，考察Tα1②的安全性，為進一步系統性進行Tα1②的臨床前研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

BALB/c小鼠（雌性，16～18 g）購自第四軍醫大學實驗動物中心；日達仙（SciClone公司）；IPTG（Solon公司）；4℃高速離心機、全自動生化分析儀（貝克曼公司）；HE染色試劑盒（博士德公司）。

1.2 小鼠的飼養與給藥

BALB/c小鼠飼養環境為溫度24～26℃，相對濕度40%～70%，自然通風，光照/黑暗各12 h，自由攝食、飲水。40只小鼠按體重隨機分為生理鹽水對照組及低濃度（80μg/只）、中濃度（160μg/只）、高濃度（320μg/只）Tα1②實驗組，每組10只。分別于腹腔內注射生理鹽水或Tα1②，每周2次，連續給藥6周，給藥后檢測各項指標。

1.3 小鼠的一般情況

給藥后每日觀察小鼠一般狀況，包括體貌、毛色、活動、攝食、飲水、對刺激的反應等。觀察各組是否出現豎尾、躁動、驚厥等興奮現象，或嗜睡、蜷縮、弓背等抑制現象。觀察各組糞、尿情況，是否有腹瀉、便血、黑便、尿血等現象，如有異常則進行記錄。每周稱取小鼠空腹體重并測定飼料消耗量1次，共計6周。

1.4 生化指標測定

小鼠最后一次給藥次日摘眼球取血，取血前禁食過夜。血液靜置30 min使其充分凝固，3000～4000 r/min離心分離血清，采用全自動生化分析儀進行血清生化學檢測。

1.5 重要臟器形態學與組織學觀察

迅速脫頸處死小鼠，進行系統解剖，觀察各主要臟器形態大小差異，同時稱重，與小鼠體重比較，求得各臟器系數（g/100 g）。摘取心、肝、肺、腎及腦新鮮組織，用多聚甲醛固定；固定后的組織經修塊取材，常規石蠟包埋，滑動切片機5 μm切片；切片脫水脫蠟，蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下對各組織進行病理學檢測。

1.6 統計學分析

采用SPSS17.0軟件，組間t檢驗和單因素方差分析，計量結果以x±s表示，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結果

2.1 小鼠的一般情況檢測

高、中、低劑量Tα1②組及生理鹽水對照組注射給藥期間，各組動物一般狀況良好，沒有出現死亡；各組一般生理活動及二便未見異常；小鼠皮毛光澤，皮膚黏膜無異常，眼、耳、鼻、口及肛門等無異常分泌物；未見呼吸困難或呼吸頻率、幅度等發生異常變化；攝食、飲水正常，未見嘔吐、腹瀉等胃腸道反應。

小鼠按體重隨機分組，入組時各組體重無統計學差異。于給藥第1、2、3、4、5、6周各稱量體重一次，觀察各組小鼠體重是否有變化，結果如表1及圖1，各組小鼠體重呈緩慢上升趨勢，給藥組體重變化與對照組比較無顯著性差異。

小鼠入組時各組攝食量無統計學差異。于給藥第1、2、3、4、5、6周各計算攝食量一次，給藥組與對照組比較無顯著差異（表2、圖2）。

表1 胸腺素α1二聚體對小鼠體重的影響（g，x±s，n=10）

2.2 血清生化學檢測結果

給藥6周后進行血清生化學分析，結果見表3。高劑量給藥組總膽紅素（TBIL）和血糖（GLU）水平與對照組比較略升高（P＜0.05），低劑量給藥組的白蛋白（ALB）水平低于對照組（P＜0.01），但上述變化均在BALB/c小鼠的正常值范圍內；其他各項血清生化指標與對照組比較無顯著差異。

2.3 臟器組織病理學結果

解剖小鼠，肉眼觀察各主要臟器均顏色鮮活，位置、大小無異常。稱重并計算各臟器數（表4），給藥組與對照組相比較無顯著差異。各組織用多聚甲醛固定后，包埋蠟塊切片進行HE染色（圖3），各劑量組小鼠心、肝、肺、腎沒有發現明顯病變，與生理鹽水對照組相比無差異。

3 討論

作為一種重要的生物學應答調節物，Tα1對調節免疫功能、維持人體內動態免疫平衡具有重要作用。Tα1可以促進T細胞增殖及對抗原刺激的反應性[8]，增強T細胞介導同種或自身淋巴細胞反應的能力[9]，并且通過延遲自由基的產生和減少谷胱甘肽的消耗，拮抗淋巴細胞成熟過程中的凋亡[10]。Tα1能夠活化巨噬細胞，促進其胞飲、胞吞及抗原提呈能力[11]。Tα1對樹突狀細胞（DCs）也具有促進成熟、分化的作用，能促使DCs分泌巨噬細胞激活因子從而增強機體免疫應答功能[12]。Ta1還有雙向性免疫調節效應，具有保護免疫功能和調節神經內分泌細胞因子網絡的作用，從而減輕細胞因子所致炎性損害，改善感染導致的高代謝狀態[13]。

表2 胸腺素α1二聚體對小鼠攝食量的影響（g，x±s，n=10）

圖1 小鼠給藥期間的體重變化

圖2 小鼠給藥期間的攝食量變化

圖3 各組小鼠重要臟器的HE染色圖

表3 胸腺素α1二聚體對小鼠血清生化指標的影響（x±s，n=10）

Tα1已廣泛應用于各種原發性或繼發性免疫缺陷病、自身免疫病、病毒及微生物感染、腫瘤等的治療中。單獨應用或聯合其他藥物，臨床療效確切，不良反應極其輕微，且大劑量使用時無發熱及過敏反應，有廣闊的應用前景。但是，目前市售的Tα1多為化學合成或生物提取。前者制備成本高、售價昂貴，且生產工藝對環境有很大污染；后者從小牛等動物胸腺組織中提取獲得，產量和純度低，易引起患者的過敏反應。而Tα1序列過短，因此難于用基因工程方法直接獲得。為解決這一難題，我們構建表達了有生物學活性的Tα1②，獲得了高產量、低成本、高活性的純化產物，具有比化學合成單體更高的生物學活性[7]。

我們以小鼠為試驗對象，對Tα1②進行了初步毒理學研究，以評價其安全性。Tα1②給藥后未引起動物死亡及出現明顯的中毒癥狀，對小鼠的生長發育和血液生化指標等均沒有不良影響。Tα1②給藥后動物的行為、活動、體重、進食量等與對照組無顯著差異。文獻報道Tα1主要通過腎臟排泄[14]，實驗結果顯示與對照組相比，腎功能檢測指標與腎臟外觀大小、臟器系數及組織病理學等指標均未發現異常，其他主要臟器組織形態學檢查也均未見異常。綜上所述，未發現Tα 1②對小鼠有明顯的毒性作用，為進一步系統性進行Tα1②的臨床前研究提供了參考依據。

表4 胸腺素α1二聚體對小鼠臟器系數的影響（g/100g，x±s）

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Toxicity Study of Thymosinα1 Concatemer in BALB/c M ice

NIU Dong1,2,WU Du-Du1,2,GAO Kai-Li1,2,WANG Zhao-Wei1,2, ZHANG Cun1,2,ZHANG Ying-Qi1,2,ZHANG Wei1,2,LIWei-Na1,2*

1.State Key Laboratory of Cancer Biology;2.Department of Biopharmaceutics,School of Pharmacy,Fourth Military Medical University;Xi'an 710032,China

*Corresponding author,E-mail:liweina@fmmu.edu.cn

Objective:A primary safety study of recombinant human thymosinα1 concatemer protein was conducted to support the following design of preclinical trial.Methods:The BALB/c mice were injected intraperitoneally with saline or thymosinα1 concatemer protein.The parameters of standard toxicology were evaluated systematically.Results:Visible changes were not found on general signs,body weight,food consumption,clinical chemistry and necropsy analysis of main organ between thymosinα1 concatemer administrated group and normal saline control group.Conclusion:In conclusion,primary toxicology study showed that recombinant human thymosinα1 concatemer was well tolerated and had no significant adverse effect on mice.

thymosinα1;concatemer;toxicology;mice

R99

A

1009-0002（2017）03-0338-04

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.019

2017-01-06

國家自然科學基金（81301785，81472649，81672800）

牛東（1995-），男，本科生，（E-mail）88488031@qq.com

李維娜，（E-mail）liweina@fmmu.edu.cn