生物化學綜合性實驗的設計與實現
——以親和層析法純化豬胰蛋白酶為例

黃體冉， 劉悅萍， 張國慶， 王文平， 張 靜

(1. 北京農學院 生物科學與工程學院, 北京 102206; 2. 農業部都市農業(北方)重點實驗室, 北京 102206)

生物化學綜合性實驗的設計與實現
——以親和層析法純化豬胰蛋白酶為例

黃體冉1,2， 劉悅萍1， 張國慶1， 王文平1， 張 靜1

(1. 北京農學院 生物科學與工程學院, 北京 102206; 2. 農業部都市農業(北方)重點實驗室, 北京 102206)

生物化學實驗是生命科學領域一門重要專業基礎課，其所包含的實驗技術在訓練學生基本技能、培養實踐能力和創新能力上起著至關重要的作用。圍繞生物化學中蛋白質化學、酶學性質的有關內容，將雞卵粘蛋白的制備、豬胰蛋白酶的制備、豬胰蛋白酶的純化以及純胰蛋白酶活性和雞卵粘蛋白抑制活性的測定重新整合，設計了一個包括蛋白質分離純化、蛋白質含量測定以及酶活性測定3個單元的綜合性實驗，并將光譜和色譜技術融入其中。最后對實驗內容的綜合性設計部分進行了探索性研究，以期為生物化學綜合性、設計性實驗開發和研究提供參考。

生物化學; 綜合性實驗; 柱層析; 分離純化

0 引 言

生物化學實驗是生命科學領域的一門專業基礎課程之一，是植(動)物生理學、遺傳學、細胞生物學、微生物學、分子生物學、細胞工程、基因工程等理論及其實驗課程先修課程。在以往的生物化學實驗教學中，基礎性實驗、驗證性實驗的授課學時占去了整個實驗授課學時的大部分，學生只要按照實驗指導書上的步驟按部就班的完成相關實驗操作即可，一定程度上束縛了學生的思維，不利于學生主觀能動性的發揮，更不利于學生分析和解決問題能力的培養和科學素養的形成[1]。綜合性實驗屬于復合性實驗范疇，往往與本課程綜合知識相關的實驗內容，或與本課程相關課程知識的實驗，是綜合訓練學生技能的方法[2]。通過綜合性實驗教學，一方面使學生掌握的理論知識逐步系統化，激發學生帶著好奇的眼光初步了解探索科學研究領域興趣，培養和提高學生的動手能力；另一方面還可通過專業綜合創新實驗的訓練，增加學生對科研領域中先進課題實驗技能、原理、研究現狀及發展前景的認知，提高學生關注和學習與學科前沿問題相關實驗知識體系的意識，增強學生的科學探索與創新精神[3]。目前，國內多數實驗指導教材，生物化學實驗基本上是按照糖、脂肪、蛋白質、核酸等的理化性質為模塊進行設置的，雖然每個模塊單獨設置實驗，但實驗項目之間銜接不夠，甚至相互割裂，這在一定程度上制約了生物化學實驗教學在培養應用型、創新型人才方面作用的發揮。近年來，生物化學教學團隊結合自身教學實踐，嘗試將一些模塊串聯起來，形成一個內容相關、實驗方法多樣的綜合性實驗，同時對實驗教學模式進行了改革，取得了良好的效果。

1 生物化學實驗教學中存在的問題

教學實驗是為達到某種教學目的而有計劃安排的實驗，是學生在實驗室進行的教學活動[4]。生物化學課程教學的主要內容包括糖類、脂類、蛋白質(含氨基酸)、核酸(DNA和RNA)的理化性質、分離鑒定、定量測定，以及酶促動力學等內容[5]，相應地實驗教學內容包括糖的顏色反應、可溶性總糖、還原糖和淀粉含量的測定、蛋白質理化性質及其定量測定、蛋白質的分離純化、氨基酸含量測定、核酸定量測定、維生素C含量的測定、酶的特異性、溫度、pH對酶活性的影響、酶活性的測定等。傳統的生物化學實驗教學一般是將這些單元作為一個獨立實驗進行教學。雖然開設的實驗項目基本涵蓋了主要教學內容，但實驗內容簡單，缺乏關聯性、系統性。這種單元化教學方式很容易使得學生獲得的知識也呈現單元化，進而導致學生不能很好理解生物化學的理論教學內容，更不能活學活用生物化學實驗技術。如果能將這些單元化的實驗串聯起來，組裝成一個綜合性實驗，必將有助于學生對生物化學實驗的全局有一個把握，使學生能夠深刻理解并掌握各實驗間的有機聯系。

2 綜合性實驗的內容與設計

普通高等學校開設綜合性實驗的目的，是通過課程實驗，培養學生的實驗綜合與應用能力、理論與實際相結合的能力和創新研究能力[6]。因此，基于生物化學實驗的特殊性，團隊僅僅圍繞上述目標，按照實驗內容復合性、實驗方法多元性、實驗手段多樣性、人才培養綜合性的要求，秉承互補、交融、滲透、承前啟后、遞進的原則[4,6]，設計出了一個親和層析法分離純化豬胰蛋白酶的綜合性實驗。

2.1 綜合性實驗的內容

親和層析法分離純化豬胰蛋白酶的基本實驗內容包括雞卵粘蛋白的制備、豬胰蛋白酶的制備以及豬胰蛋白酶的純化三部分內容。

2.1.1 雞卵粘蛋白的制備

取新鮮雞蛋蛋清50 mL，緩慢加入等體積10% pH 1.15 的三氯乙酸溶液，邊加入邊攪拌，直至蛋清沉淀均勻，用5 mol/L NaOH或5mol/L HCl調懸濁液的pH值至3.5，室溫下靜止4 h以上。 待清蛋白完全沉淀后，以3 000 r/min離心10 min，棄沉淀，上清液用濾紙過濾，除去上清液中的脂類物質及不溶物，收集濾液到500 mL燒杯，檢查pH=3.5(準確)，放置冰浴冷卻片刻，緩緩加入3倍體積的預冷丙酮，用玻璃棒攪拌均勻，并用塑料薄膜蓋好防止丙酮揮發，冰浴放置4 h以上。待雞卵粘蛋白完全沉淀后，小心傾出一部分上清液，剩余的部分沉淀液全部轉移到50 mL離心管里，蓋好蓋，以3 000 r/min離心15 min，棄上清液，離心杯沉淀物放入真空干燥器或通風廚內抽氣，除去殘留丙酮，然后用20 mL蒸餾水溶解，如液體渾濁可用濾紙過濾，即可獲得雞卵粘蛋白粗品[7]。

取20 mL雞卵粘蛋白粗品通過Sephadex G-25 柱層析脫鹽(上樣量不得超過柱床體積的1/6)用0.02 mol/L pH6.5磷酸緩沖液(以下簡稱Buffer)洗脫收集雞卵粘蛋白粗提液；將脫鹽的雞卵粘蛋白粗提液上DE-32陰離子交換柱吸附， 以Buffer平衡，流出液經紫外分光光度計測定光吸收A280 nm小于0.02以后，改用含0.3 mol/L NaCl的Buffer洗脫，收集洗脫峰，收集體積一般在35-45 mL為宜。將經DEAE-32陰離子交換柱層析分離的雞卵粘蛋白溶液裝入透析袋內對蒸餾水透析，間隔一段時間更換一次蒸餾水，直到用1%AgNO3檢查無氯離子為止；透析液轉移到燒杯內，取出2 mL透析液測定雞卵粘蛋白含量及其抑制活性，其余的透析液用1 mol/L HCl調到pH4.0，量取體積，然后加入3倍體積的預冷丙酮沉淀(此時應當出現大量的白色沉淀，否則就是溶液的pH值不準確)，蓋上塑料膜，在冰浴里靜置4 h以上或過夜；待雞卵粘蛋白析出后，傾出部分上清液，剩余的沉淀液裝入50 mL離心管里，于3 000 r/min離心15 min，棄去上清液，收集沉淀物真空干燥，干燥后的雞卵粘蛋白為透明膠狀物；然后以提取的雞卵粘蛋白為樣品，分別測定其濃度和活性[8]。

2.1.2 豬胰蛋白酶粗提取液的制備

稱50 g豬胰臟(已剝去脂肪和結締組織)，剪碎后裝入組織搗碎機內，加入150 mL預冷的3.5%乙酸酸化水，勻漿(5 s/次，間隔30 s，共3次)，然后把勻漿轉移到5 00 mL燒杯中，在4℃冰箱提取2 h，4層紗布過濾，濾液用2.5 mol/L H2SO4調pH至3.0，4 ℃冰箱靜置2 h以上，靜置期間pH值保持在3.0左右，然后用濾紙過濾，收集濾液待激活。將胰蛋白酶原的粗提取液用5 mol/L NaOH調節pH至8.0，量取溶液體積；加入固體CaCl2使溶液Ca2+的終濃度達到0.1 mol/L，再次檢查溶液pH是否是8.0，若偏酸或偏堿，則用5 mol/L的NaOH或HCl精確調pH至8.0；然后，加入約50 mg標準胰蛋白酶，混勻，在4℃冰箱中激活12～16 h。在酶激活期間，經常檢測酶的活性，取1 mL上清液分別測定胰蛋白酶的濃度和活性，待酶的比活達到1 000 u/mg時，用2.5 mol/L H2SO4調至pH至3.0，停止激活[9]。

2.1.3 豬胰蛋白酶的純化

稱取10 g Sepharose 4B置于玻璃燒結漏斗G-3中抽干，用100 mL 1.0 mol/L NaCl溶液抽洗3次，再用200 mL蒸餾水抽洗3次，抽干后轉移到小三角瓶內。然后依次加入7 mL蒸餾水、8 mL 1，4二氧六環、6.5 mL 2 mol/L NaOH、1.5 mL環氧氯丙烷，用塑料薄膜將瓶口封住，在40℃的恒溫水浴搖床中振搖活化2 h，然后將活化的Sepharose 4B轉移到玻璃燒結漏斗中，抽去活化劑，用100 mL蒸餾水洗滌，少量多次，抽干，再將Sepharose 4B轉移到100ml干凈的三角瓶中備用。稱取100 mg雞卵粘蛋白用10 mL 0.2 mol/L pH9.5 Na2CO3緩沖液充分溶解，取0.1 mL稀釋30倍后測定A280 nm，計算溶液中雞卵粘蛋白的濃度，然后將溶解好的蛋白溶液加入到100 mL三角瓶中與活化的Sepharose 4混勻，在40℃恒溫水浴中，以130～140 r/min振搖偶聯22 h左右后，終止偶聯。將已經偶聯好的Sepharose 4B轉移到玻璃燒結漏斗中，用100 mL 0.5 mol/L NaCl溶液洗去未被偶聯的蛋白，收集的濾液，量取體積并在紫外分光光度計上測定未被偶聯的雞卵粘蛋白含量，以計算偶聯蛋白量；然后用100 mL蒸餾洗，50 mL親和柱洗脫液淋洗，蒸餾水洗至中性(大約pH6.0)。然后將親和介質轉移到小燒杯內，用親和柱平衡液浸泡15 min脫氣，裝柱。取一支層析柱( 10×150 mm)柱內先裝入1/4體積的親和柱平衡液，將脫氣的親和吸附劑輕輕攪勻，一次裝入柱內，待其自然沉降，調好流速(2～4 mL/10 min)。用親和柱平衡液平衡，經紫外分光光度計測定A280 mm值小于0.02即可。將已經激活的胰蛋白酶提取液用5 mol/L NaOH精確調至pH8.0，過濾，取濾液20～50 mL上柱(通過親和介質的偶聯量和胰蛋白酶粗提液的比活性，計算出上樣所需體積=)，上樣體積(mL)=[介質偶聯mg數×0.86×1.3×104(u/mg)] ×1.5 /胰蛋白酶粗提液濃度(mg/mL)×比活(u/mg)上完樣以后，再以0.1 mol/L，pH8.0 Tris-HCl 緩沖液(內含0.5 mol/L KCl，50 mmol/L CaCl2)平衡，洗去未被吸附的雜蛋白，直至流出的平衡液經蛋白質核酸檢測儀繪出的基線穩定。上柱后用親和柱平衡液平衡，待流出液在經紫外分光光度計測定A280 nm值小于0.02以后，改用親和柱洗脫液(0.1 mol/L pH2.5甲酸，0.5 mol/L KCl溶液)洗脫，收集第Ⅱ洗脫峰，即為純化后的豬胰蛋白酶[10-11]。

2.1.4 純胰蛋白酶活性和雞卵粘蛋白抑制活性測定

測定雞卵粘蛋白濃度時，先將透析液稀釋30～50倍，然后用重蒸水作空白調零，在λ=280 nm時，測OD值(如測得的OD值大于1，接著再稀釋)，然后計算卵粘蛋白的濃度(雞卵粘蛋白濃度(mg/mL) =A280 nm×稀釋倍數/0.413計算雞卵粘蛋白的含量)。

測定雞卵粘蛋白抑制活性時，在λ=253 nm時，將0.05 mol/L pH7.8 Tris-HCl緩沖液、標準胰蛋白酶和雞卵粘蛋白直接加入比色杯中，混合2 min后(使胰蛋白酶和卵粘蛋白充分混合)；再加入2 mol/L BAEE底物，然后混合記時測定，30 s讀一次共5次，以0.05 mol/L pH7.8 Tris-HCl緩沖液、2 mol/L BAEE底物、標準胰蛋白酶作無空白對照，測定透析液卵粘蛋白的抑制活性。雞卵粘蛋白抑制活性單位(胰酶BAEE)=(未加抑制劑的胰蛋白酶△A253 nm/min-加入抑制劑胰蛋白酶△A253 nm/min)/ 0.001，雞卵粘蛋白抑制比活性單位(胰酶BAEE/mg)=[抑制劑活性單位(胰酶BAEE)×抑制劑的稀釋倍數]/ [抑制劑的濃度(mg/mL)×加入抑制劑的體積][7,11]。

測定標準胰蛋白酶活性時，先計算所需標準胰蛋白酶的體積，在λ=280 nm時，用重蒸水調零，測標準胰蛋白酶的濃度(胰蛋白酶濃度=A280 nm/1.35)，然后用5～10 μg(加入胰酶的量理論值)除濃度即為所得的體積數。在λ=253 nm時，將0.1 mol/L Tris-HCl pH8.0緩沖液和2 mmol/L BAEE底物直接加入比色杯，然后加標準胰蛋白酶(用蓋子或硫酸紙蓋上，上下翻轉2或3次，立即計時)30 s讀一次共5次，以0.1 mol/L Tris-HCl pH8.0緩沖液和2 mmol/L BAEE底物作無空白對照，測定純胰蛋白酶的活性。胰蛋白酶活性單位(BAEE)=(△A253 nm/min)/0.001，胰蛋白酶比活性單位(BAEE/mg)=(胰酶活性U×稀釋倍數)/ 胰酶濃度(mg/mL)×加入酶體積[8]。注意：測定時，雞卵粘蛋白的抑制活性的光吸收遞增值在△A253 nm/min (0.05±0.01)最適宜，測定胰蛋白酶反應的時間為5～7 min，測定雞卵粘蛋白的抑制活性是胰蛋白酶的2～3倍時間或許更長。

在綜合性實驗-親和層析法純化胰蛋白酶中，以蛋白質化學、酶學的性質等內容組織教學，每一個實驗的終產物都是下一個實驗的材料，環環相扣，既很好的將不同單元的實驗操作融合在了一起，又體現了綜合性實驗強調突出內容復合性、方法多元性、手段多樣性的要求[12]，從而實現了實驗教學內容、研究方法、手段的綜合[13]。

2.2 綜合性實驗的設計

作為一個綜合性實驗，親和層析法分離純化豬胰蛋白酶主要圍繞著蛋白質化學、酶學的性質等內容組織教學，選擇有代表性的實驗材料，根據分析的目標融入光譜、色譜、電泳等技術。在實驗技術上，既要考慮內容和方法具有相互關聯和完整性，又要考慮每一個單元側重點和相對獨立性。在實驗項目的教學安排過程中，嚴格按照循序漸進的教學原則，按照雞卵粘蛋白制備-粗胰蛋白酶制備及標準胰蛋白酶活性測定-親和層析純化胰蛋白酶的順序合理安排教學內容，從而使教學過程符合認知科學的理論與實踐[13]。

在雞卵粘蛋白制備模塊中，不僅融入了有機酸、有機溶劑沉淀蛋白質的基本技術，而且融入了柱層析技術分離純化蛋白質的方法，更為重要的是將紫外吸收分光光度計測定蛋白質含量巧妙的引入實驗中。在雞卵粘蛋白粗提的操作步驟中，除了給定濃度、pH的三氯乙酸溶液以及丙酮外，啟發學生通過查閱文獻找出其他可以沉淀蛋白質的有機酸或有機溶劑，并親自通過實驗驗證，同時指出選擇10% pH1.15的三氯乙酸進行蛋白質沉淀的原理，如果沉淀后不調節pH至1.15，最后能否提取出雞卵粘蛋白，同時思考將丙酮換成其他溶劑是否可以達到同樣的目的。在雞卵粘蛋白分離純化的步驟中，使用了Sephadex G-25和 DEAE-32兩種層析介質，為提高教學效果，使學生理解并掌握柱層析的基本實驗技術，課前讓學生提前預習，課上提問兩種介質層析的原理、操作要點，以及層析過程中可能出現的層析峰，如何判斷層析峰的開始與結束，什么時候開始流出的層析液中含有目標蛋白等。通過這種方式，將三氯乙酸提取雞卵粘蛋白、丙酮沉降法分級分離、Sephadex G-25柱層析分離以及DEAE-32陰離子交換柱層析分離雞卵粘蛋白的方法有機串聯起來，蛋白質的提取、分離、純化不再是一個個單元化實驗操作，而是一個具體的可操作的完整的有機體。

在粗胰蛋白酶制備及標準胰蛋白酶活性測定模塊中，不僅巧妙地融入酶原激活概念和方法，進一步加深了學生對酶和酶原這兩個概念的理解，而且引入了酶抑制活性測定的概念和方法，從而將該模塊與雞卵粘蛋白制備模塊有機結合起來。授課時，通過提問和釋疑的方式，引導學生深入理解和區別酶活性和酶抑制活性的概念及其應用。如在豬胰蛋白酶原粗提過程中，使用的乙酸酸化水的作用是什么，它與三氯乙酸、丙酮在雞卵粘蛋白制備中的作用有何異同？在靜置提取過程中，pH值為什么要始終保持在2.5～3.0左右？在胰蛋白酶原激活過程中，為什么要加入CaCl2和固體胰蛋白酶，不加入酶原能否被激活？

在親和層析純化胰蛋白酶模塊中， 親和層析介質的制備方法、親和層析分離純化胰蛋白酶的技術流程、圖譜分析技術以及純化胰蛋白酶活性指標的測定與計算方法是考核的主要能力指標。并通過上一模塊的產物豬胰蛋白酶粗提取液與本模塊進行銜接，既保證了實驗的連續性，又是對上一模塊實驗在內容和技術上的升華。豬胰蛋白酶粗提取液中既含有胰蛋白酶，又含有非胰蛋白酶，采用何種方式可以將豬胰蛋白酶分離出來呢？第一模塊中用到的三氯乙酸沉淀、丙酮沉降法分級分離、Sephadex G-25柱層析分離以及DEAE-32陰離子交換柱層析分離蛋白質的方法是否依然使用呢？讓學社帶著這些問題去查閱文獻，對比分析，尋找合適的分離出豬胰蛋白酶的方法，順勢引入Sepharose 4B親和層析的技術與方法。胰蛋白酶分離提純后，其活性指標測定和計算方法的學習也就順理成章了。

在時間安排上，基本上按照雞卵粘蛋白的制備、豬胰蛋白酶粗提液的制備以及親和層析純化豬胰蛋白酶的順序安排實驗，又不完全拘泥于上述實驗各個步驟，如在豬胰蛋白酶粗提液的制備過程中穿插了Sepharose 4B親和介質制備的內容，以達到充分利用各個步驟中的等待時間，提高實驗效率的目的。總體上該綜合性實驗需要5 d，累計授課40學時，具體安排如下：第一天主要進行玻璃器皿的清洗、試劑配制、儀器設備的安裝調試以及三氯乙酸提取雞卵粘蛋白。第二天主要進行以丙酮沉降法分級分離、ephadex G-25柱層析分離以及DEAE-32陰離子交換柱層析分離等為主要內容雞卵粘蛋白的分離純化工作。第三天雞卵粘蛋白純品的獲得、雞卵粘蛋白含量及其抑制活性測定等內容。第四天主要進行豬胰蛋白酶原的提取、胰蛋白酶原的激活、胰蛋白酶的活性濃度及活性測定以及Sepharose 4B親和介質的制備等內容。第五天主要進行親和層析柱的安裝與平衡、豬胰蛋白酶粗提液的上樣、平衡與洗脫以及純胰蛋白酶活性和雞卵粘蛋白抑制活性的測定等內容。

可見，模塊化的實驗設置體系和循序漸進的教學過程安排，使學生在實驗過程中變被動學習為主動學習，有利于逐步提高發現問題、分析問題和解決問題的能力, 增強對困難和失敗的承受力, 并增進團隊精神和協作能力[14]。

2.3 綜合性實驗的考核

由于過去過度依賴實驗報告的優劣作為考評指標，導致學生不注重實驗過程，片面追求實驗結果的正確性、實驗報告的篇幅和整潔程度，嚴重制約了對學生綜合素質的培養[15]。為了提高學生實驗過程中獨立思考的能力和發現問題、分析問題、解決問題的能力，實行實驗座談、實驗報告、實驗考試綜合評定學生的考核制度。該考核制度加大了對實驗過程的考核力度，激發了學生主觀能動性，符合江月玲[15]以及戰春梅等[16]等構建的綜合性實驗教學質量評價體系思想，有利于培養和提高學生的實踐能力和創新能力。

由于綜合性實驗周期相對較長，即便在授課過程中盡可能統籌安排，也難免會有較長的等待時間，為充分利用相對閑散的時間，專門設置了實驗座談環節，座談由教師主持，各實驗小組逐一闡述本組實驗中出現的問題，并分析成功或失敗的原因，其他組的同學進行點評，點評情況由老師測評并計入平時成績。通過這樣的討論，使學生對各實驗操作步驟及其原理有了更進一步的認識，有利于學生在掌握實驗技能的同時，舉一反三，能夠將學到的方法和技術靈活運用到其他實驗材料上。實驗結束時，要求每位同學必須同時完成實驗報告的撰寫，包括結果計算、分析和討論，嚴禁課后補寫實驗報告。設置實驗課程考試環節，考試方式閉卷，內容包括試劑配制及其在實驗中作用、實驗原理、實驗操作、實驗結果分析等，全部為授課過程中涉及到的內容。上述三種方式的綜合得分即為該綜合性實驗的最后得分，即實驗成績=實驗座談成績×35%+實驗報告成績×35%+考試成績×30%。

3 結 語

親和層析法純化豬胰蛋白酶實際上將蛋白質分離純化、蛋白質含量測定以及酶活性測定等3個單元的實驗有機融合在一起，形成了一個綜合性和設計性于一體的實驗項目，旨在培養和提高學生綜合利用生物化學知識的能力與素質。經過多年的實踐，學生們普遍反映，通過該實驗不僅學到了多種實驗技術和方法，而且獲得了綜合運用所學知識設計實驗的思維。此外，該綜合性實驗的實踐與探索為生物化學其他(如糖類、脂類、核酸)綜合性實驗項目設計提供了有益借鑒。

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Design and Implementation of a Comprehensive Experiment of Biological Chemistry — Separated and Purified Porcine Trypsin Using Affinity Chromatography for Example

HUANGTiran1,2,LIUYueping1,ZHANGGuoqing1,WANGgWenping1,ZHANGJing1

(1. College of Biological Sciences and Engineering, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China; 2. Key Laboratory of Urban Agriculture (North) of Ministry of Agriculture, Beijing 102206, China)

Biochemistry experiment is an important professional basic course in the field of life science. The experimental technology contained in the biochemistry experiment played a vital role in training students’ basic skills, cultivating practical ability and innovation ability. Around the protein chemistry and enzymatic properties in the biochemistry, the experiments of chicken ovalin preparation, porcine trypsin preparation, porcine trypsin purification, and the determination of purified trypsin activity and chicken ovalin inhibitory activity were re-integrated. Therefore a comprehensive experiment including protein separation and purification, determination of protein content and enzyme activity was designed. The spectroscopy and chromatography were also used in the comprehensive experiment. Finally comprehensive designing content in the experiment was studied. The design can provide the reference for the research and development of comprehensive and designing experiments in the biochemistry experiment teaching.

biochemistry; comprehensive experiment; chromatograph; separated and purified

2016-05-20

北京農學院實驗技術體系研發基金項目(SXST201606)，北京農學院學位與研究生教育改革與發展項目(2016YJS080)

黃體冉(1983-)，男，山東鄆城人，碩士，實驗師，研究方向：實驗教學與管理、植物分類。

Q 503

A

1006-7167(2017)04-0179-05

Tel.: 010-80799294; E-huangtr151@bua.edu.cn