白術內酯I抑制胃癌MGC-803細胞增殖的機制

陳 遠

(浙江大學醫學院附屬第四醫院消化內科，浙江 義烏 322000)

白術內酯I抑制胃癌MGC-803細胞增殖的機制

陳 遠

(浙江大學醫學院附屬第四醫院消化內科，浙江 義烏 322000)

目的 探討白術內酯I對人胃癌MGC-803細胞增殖的抑制作用及其機制。方法 MTT實驗和集落形成實驗檢測白術內酯I對MGC-803細胞增殖的抑制作用；Western印跡檢測白術內酯I對人胃癌MGC-803細胞中Notch1、Hey1、Jagged1和Hes1蛋白表達的影響；實時定量PCR分析白術內酯I對人胃癌MGC-803細胞中Notch1、Hey1、Jagged1和Hes1 mRNA水平表達的影響。結果 MTT實驗和集落形成實驗表明，白術內酯I抑制人胃癌MGC-803細胞增殖，并且呈時間、劑量依賴性(P<0.05)；Western印跡實驗表明白術內酯I抑制Notch信號通路中Notch1、Hey1、Jagged1和Hes1蛋白表達水平；實時定量PCR結果顯示白術內酯I抑制Notch1、Hey1、Jagged1和Hes1 mRNA表達水平(P<0.05)。結論 白術內酯I通過抑制Notch信號通路從而抑制人胃癌MGC-803細胞增殖，白術內酯I可能用于治療胃癌的新型治療策略。

白術內酯I；胃癌MGC-803細胞；Notch信號通路

盡管手術切除以及化學治療都在胃癌治療方面取得較好的效果，但胃癌患者的生存情況仍然很不理想。白術(Rhizoma Atractylodis Macrocephalae)是一種菊科植物，屬于中國傳統藥材，在治療消化失調、胃病以及厭食等方面有良好效果〔1〕。近年來研究發現白術還具有其他活性，例如抗感染、抗腫瘤等〔2～5〕。本文用不同濃度的白術內酯(AT)-Ⅰ處理人胃癌細胞系MGC-803，并檢測Notch1、Hey1、Jagged1和Hes1 mRNA和蛋白水平表達的變化，以探究AT-I對胃癌細胞的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 AT-I購自Must Bio-technology(中國)。AT-I固體粉末溶解在二甲基亞砜中制成儲備液(100 mmol/L)，避光-20℃儲存。人重組堿性成纖維生長因子(bFGF)和上皮生長因子(EGF)購自R&D公司。Hey1、Jagged1、Notch1、Hes1抗體購自CST公司。β-actin購自Santa Cruz公司。

1.2 細胞來源以及培養 人胃癌細胞系MGC-803購自中國Cell Resource Center of Life Sciences。用RPMI1640培養基培養，并且在此基礎上加入10%胚牛血清(FBS，Hyclone)和100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素(Invitrogen，美國)。細胞培養在5% CO2以及37℃環境中。

1.3 方法

1.3.1 噻唑藍(MTT)實驗檢測細胞活性 將人胃癌細胞系MGC-803培養在96孔板中，培養密度為0.5×105，接種24 h，并且設置4個副孔。然后分兩組處理，第一組用不同濃度AT-I(0、25、50、100 μmol/L)處理MGC-803細胞48 h;第二組用50 μmol/L AT-I處理MGC-803細胞24、48、72 h。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，用20 μl 5 mg/ml MTT試劑處理MGC-803細胞，放在細胞培養箱中培養。丟棄MTT溶液，每孔加200 μl DMSO溶液，放在搖床上搖蕩10 min，用酶聯免疫檢測儀檢測490 nm處吸光值。

1.3.2 集落形成實驗 將MGC-803細胞接種到24孔板中，每個孔接種200～300個細胞，用不同濃度AT-I(0、25、50、100 μmol/L)處理細胞，每個濃度設置4個副孔。7 d之后，無水乙醇固定15 min，然后0.1%結晶紫(W/V)染色10 min。之后PBS洗3次，每次5 min，然后在帶有拍攝功能的顯微鏡下拍攝。

1.3.3 Western印跡 將MGC-803細胞原有的培養基棄掉，用PBS洗2次。每個小皿加入100 μl裂解液，在冰上裂解30 min。根據BSA(0.5 mg/ml)標準曲線檢測不同濃度AT-I(0、25、50、100 μmol/L)處理后的細胞濃度。制備上樣蛋白，即20 μl樣品+5 μl上樣緩沖液上樣于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠中，之后電轉到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂牛奶室溫在孵育盒中將PVDF膜封閉1 h，PBS洗3次，每次5 min。孵育抗-CD44、抗-Hey1、抗-Jagged1、抗-Notch1，放在4℃過夜。PBS洗3次，每次5 min。孵育相應的二抗，PBS洗3次，每次10 min。在膜上均勻撒化學發光液，在化學發光成像系統中顯影。

1.3.4 總RNA提取和cDNA合成 不同濃度AT-I(0、25、50、100 μmol/L)處理細胞，用TrizolTM試劑盒(Invitrogen公司)提取總RNA。通過核酸蛋白分析儀測量吸光度值，計算A260/A280比值(每一個RNA樣品均A260/A280比值大于1.8)。cDNA合成用PrimeScriptTMRT 試劑盒以及gDNA Eraser(Takara)合成。

1.3.5 實時定量PCR分析 相關靶基因的計算通過相對循環閾值(CT)計算，以GAPDH為內參。引物：Notch1：正義：5′-GTCAACGCCGTAGATGACCT-3′；反義：5′-TCTCCTCCCTGTTGTTC-TGC-3′。Hes1：正義：5′-AAGGCGGACATTCTGGAAAT-3′；反義：5′-GTCACCTCGTTCATGCACTC-3′。Hey1：正義：5′-TGGATCACCTGAAAATGCTG-3′；反義：5′-TTGTTGAGATGCGAAACCAG-3′。Jagged1：正義：5′-GATCCTGTCCATGCAGAACG-3′；反義：5′-GGATCTGATACTCAAAGTGG-3′。GAPDH：正義：5′-CAGGGCTGCTTTTAACTC-3′；反義：5′-GGAAGATGGTGATGGGAT-3′。所有的定量都統一到β-actin的mRNA水平。

1.4 統計學方法 采用GraphPad Prism5.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1 AT-I抑制人胃癌細胞系MGC-803增殖 與對照組(0 μmol/L組)相比〔(91.60±4.93)%〕，不同濃度AT-I組的細胞存活率都顯著降低〔(25、50、100 μmol/L組分別為(76.05±9.35)%、(55.26±5.51)%、(45.43±5.23)%，P<0.05〕，且這種抑制呈時間〔作用24、48、72 h存活率分別為(72.53±5.51)%、(55.26±5.51)%、(38.52±3.70)5〕、劑量依賴性。集落形成實驗表明，與對照組(0 μmol/L組)比較，不同濃度AT-I組的細胞密度都顯著降低(P<0.05)，且具有濃度依賴性。見圖1。

2.2 Western印跡檢測AT-I對MGC-803細胞Notch信號的影響 與對照組(0 μmol/L組)比較，MGC-803細胞中Notch1、Hey1、Jagged1和Hes1蛋白表達在AT-I 50、100 μmol/L兩個濃度時顯著降低(P<0.05)。見圖2。

圖1 AT-I作用后集落形成實驗結果

1)P<0.05，2)P<0.01，下圖同圖2 AT-I對MGC-803細胞Notch信號通路的影響

2.3 實時定量PCR分析AT-I對MGC-803細胞Notch信號的影響 在50、100 μmol/L兩個濃度時，Notch1、Hey1、Jagged1和Hes1 mRNA水平都顯著低于對照組(0 μmol/L組)(P<0.05)。見圖3。

圖3 實時定量PCR分析Notch1、Jagged1、Hey1和Hes1 mRNA水平

3 討 論

AT-I是桉烷型倍半萜內酯，是白術中主要的天然復合物，吸引了越來越多的關注。有研究表明AT-I通過線粒體介導的凋亡途徑誘導肺癌細胞凋亡〔6〕。此外，還有研究報道AT-I抗黑色素瘤細胞增殖，誘導細胞分化，通過Ras途徑抑制細胞遷移，并且調節細胞外調節蛋白激酶(ERK)和磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號通路〔7〕。

Notch信號是進化保守途徑，介導小范圍細胞與細胞之間相互作用，并且與一系列細胞過程有關，包括細胞命運的決定、細胞分化、增殖和死亡〔8，9〕。當膜結合配基Jagged，結合到Notch受體，γ-分泌酶調節的切割隨后釋放細胞內的Notch，然后Notch能夠轉錄到核內，從而激活Notch轉錄的靶基因，例如Hes1/Hey1〔10〕。證據表明Notch在胃癌發生、發展、存活中發揮著重要的作用〔11〕。Notch信號在干細胞自我更新時發揮關鍵作用〔12〕。證據表明Notch信號具有維持多種腫瘤細胞中干細胞樣特征的作用，包括膠質瘤、肝癌、胰腺癌和前列腺癌〔13〕。Notch1高水平的表達與腫瘤患者的不良生存率有關，在胃癌中，Notch信號主要涉及其中的發展過程〔14〕。

本研究表明AT-I調節Notch信號，包括Notch1、Hey1、Jagged1和Hes1活性。因此，AT-I介導的細胞增殖至少部分是通過Notch信號調節。

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7 潘利文，宋 捷.白術內酯Ⅰ體內外的抗黑色素瘤研究〔J〕.中國醫院藥學雜志，2015；35(8)：682-5.

8 孫麗哲，侯 林.Notch的結構、功能和相關信號通路〔J〕.中國細胞生物學學報，2010；32(6)：914-21.

9 Shang H，Braggio D，Lee YJ，etal.Targeting the Notch pathway：A potential therapeutic approach for desmoid tumors〔J〕.Cancer，2015；121(22)：4088-96.

10 付亞娟，葉 楓，呂衛國，等.Notch信號通路的研究現狀〔J〕.醫學分子生物學雜志，2007；4(5)：447-50.

11 劉 敏.COX-2通過Notch1信號通路調控Snail參與胃癌侵襲遷移的機制研究〔D〕.蘭州：蘭州大學，2014.

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14 劉 濤.靶向抑制NOTCH信號通路誘導胃癌細胞凋亡的網絡調控研究〔D〕.蘭州：蘭州大學，2014.

〔2016-09-11修回〕

(編輯 袁左鳴)

陳 遠(1988-)，女，碩士，住院醫師，主要從事胃癌研究。

R28

A

1005-9202(2017)10-2383-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.016