發酵蘋果渣多糖分離純化、結構及其與加工特性的關系

賈豐，郭玉蓉，楊曦，劉冬，李潔

（陜西師范大學食品工程與營養科學學院，西安 710119）

發酵蘋果渣多糖分離純化、結構及其與加工特性的關系

賈豐，郭玉蓉，楊曦，劉冬，李潔

（陜西師范大學食品工程與營養科學學院，西安 710119）

【目的】在研究發酵蘋果渣多糖分離純化動態趨勢的基礎上，對其結構特性進行深入研究，進一步探究發酵蘋果渣多糖分離純化、活性及加工特性。【方法】以蘋果原渣多糖（apple pomace polysaccharides，AP）、蘋果酒渣多糖（wine fermented apple pomace polysaccharides，WFP）、蘋果醋渣多糖（vinegar fermented apple pomace polysaccharides，VFP）為原料，對其含量進行分析，利用發酵蘋果渣多糖不同組分間極性差異，采用DEAE-52纖維素，以NaCl溶液進行梯度洗脫，部分收集器進行逐管收集，苯酚硫酸法測定吸光值，制作洗脫曲線；同時，對DEAE-52纖維素層析所得組分利用去離子水經Sephadex G-200凝膠柱，根據一定分子量截留的特點進行進一步分離純化，測定所得組分純度后，對不同組分進行結構表征，主要包括X衍射儀（XRD）觀察晶體結構、熱重分析儀進行熱重分析（TG）、激光粒度儀對溶液粒度進行分析（LPSA）、同時通過剛果紅試驗探究其是否具有三螺旋結構，運用臺式掃面電鏡進行微觀結構分析。【結果】粗多糖含量達到70%左右，同時不含蛋白質、核酸，提取效率較高；AP在0.1和0.2 mol·L-1NaCl洗脫液濃度下經DEAE-52纖維素層析、Sephadex G-200凝膠層析可得NAP0.1、NAP0.2；WFP在0.0、0.1和0.2 mol·L-1NaCl濃度洗脫下可得NWFP0、NWFP0.1、NWFP0.2，VFP可得NVFP0、NVFP0.1、NVFP0.2，以上所得成分含量均達到92%以上，分離純化效果良好；3種多糖分離純化前后皆為非晶態物質，呈無定型結構；多糖溶液濃縮過程溫度應低于65℃，在加工中應注意控制溫度在150℃以內；分離純化前，3種多糖都存在三螺旋結構，分離純化后，組分NWFP0、NVFP0、NVFP0.1出現了三螺旋結構，AP經分離純化無三螺旋結構成分出現；蘋果渣多糖在分離純化后更加穩定，粒徑差異更小，主要表現在經分離純化后多糖的粒徑分散系數更小；分離純化導致片狀結構變小，交聯作用減弱，能更好發揮其生物活性。【結論】發酵蘋果渣多糖含量達70%，經分離純化后的含量與AP均可達92%；由XRD、TG、LPSA、剛果紅、微觀結構等方面得出其在溶解度、黏度、物理性質等方面的改變有利于更好發揮生物活性，同時獲得更好的加工特性。

發酵；蘋果渣；多糖；分離純化；結構表征；加工特性

0 引言

【研究意義】植物多糖一直是研究熱點，因其特有的生物活性、加工特性為研究者所青睞[1]，蘋果多糖是植物多糖的一種，且蘋果是大眾消費最多的水果之一[2]。蘋果渣利用常集中在飼料，常常造成極大浪費。對發酵蘋果渣多糖進行分離純化、結構表征研究，對指導蘋果渣的利用具有重要指導意義。【前人研究進展】在目前的研究中，馬文杰[3]、蘇鈺琦[4]、張麗萍[5]、付成程[2]、李錦運[6]等對蘋果多糖的制備、脫色、提取工藝優化以及分離純化進行了研究；李倩[7]、孫陽[1]、楊素[8]、張典[9]、李潔[10]等在蘋果多糖的生物活性、加工特性以及結構表征等方面進行了研究；LIU[11]、LI[12-14]、YANG[15]、ZHANG[16]、QIAN[17]、DOU[18]、LI[19]、WANG[20]、NG[21]、GALVEZ-LOPEZ[22]等在蘋果多糖生物活性與結構、分離純化與功能特性方面進行了研究。【本研究切入點】盡管國內外對于蘋果（渣）多糖進行了深入的研究，但對于發酵蘋果渣多糖的分離純化、結構表征尚未進行。因此，對于發酵蘋果渣多糖進行進一步研究顯得尤為重要。【擬解決的關鍵問題】通過對發酵蘋果渣粗多糖進行分離純化、結構表征，來解釋結構與活性、加工特性之間的關系，為發酵蘋果渣多糖的應用提供理論保證。

1 材料與方法

試驗于 2015—2016年在陜西師范大學食品工程與營養科學學院進行。

1.1 材料與試劑

蘋果（秦冠）原渣，2015年4月陜西藍海果業有限公司蘋果酒加工副產物原渣；蘋果酒渣，蘋果原渣接種安琪酵母DV10，常溫固態發酵20 d；蘋果醋渣，蘋果原渣經陜西咸陽三原甘露池醋廠釀醋工藝（添加 5%左右蔗糖，3—5 d安琪酵母固態發酵，6—15 d 醋酸菌固態發酵，室溫發酵）獲得醋渣；3種蘋果渣于50℃烘干，破碎，過40目篩，經超聲輔助熱水浸提法提粗取多糖成分，經透析，干燥得蘋果原渣多糖（AP）、酒渣多糖（WFP）、醋渣打多糖（VFP），待用。2015年9月至2016年4月進行分離純化；2016年3—5月進行結構研究。氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、苯酚、剛果紅等藥品均為分析純；Cellulose DE-52 Whatman，北京索萊寶科技有限公司；Sephadex G-200，Pharmacia公司。

1.2 儀器與設備

Multiskan Go全波長酶標儀，美國熱電公司；TM3030臺式掃描電子顯微鏡，日立公司；LGJ-18C真空冷凍干燥機，北京四環科學儀器廠；層析柱BOMEX，內徑2、5 cm各一套；DHL-A 電腦數顯恒流泵，上海滬西分析儀器廠有限公司；BS-100A 自動部分收集器，上海滬西分析儀器廠有限公司；Q1000DSC+LNCS+FACS Q600SDT熱分析系統，美國TA公司；BI－90Plus 激光粒度儀，美國布魯克海文儀器公司；DX-2700 X射線衍射儀，丹東浩元儀器有限公司；TU-1810 紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發酵蘋果渣多糖純度測定

1.3.1.1 紫外掃描純度鑒定分析 參照李潔等[10]的方法，200—400 nm紫外光譜掃描，以檢測樣品蛋白質和核酸是否除盡。

1.3.1.2 發酵蘋果渣多糖含糖量測定 參照李潔等的[10]方法，利用苯酚硫酸法測定含糖量。

1.3.2 發酵蘋果渣多糖分離純化

1.3.2.1 DE-52纖維素柱處理

（1）DEAE-52纖維素首次處理 將100 g DE-52纖維素用去離子水沖洗2—3次，去除雜質，浸泡24 h，待用[23]。

（2）DEAE-52纖維素裝柱預（再生）處理 分別配制0.5 mol·L-1NaOH、HCl溶液；用300 mL NaOH溶液浸泡30 min后用蒸餾水迅速洗至中性，抽干；然后用300 mL HCl溶液浸泡30 min同樣洗至中性，抽干；再用300 mL NaOH溶液浸泡30 min，洗至中性，抽干，待用[23]。

（3）DEAE-52纖維素裝柱平衡 將1.3.2.1（1）處理樣裝入抽濾瓶，用塞子密封，抽氣至無氣泡，裝柱，填料體積為柱體積的3/4，平衡12 h，待用[23]。

1.3.2.2 G-200凝膠柱處理

（1）G-200凝膠柱首次處理 稱取20 g Sephadex G-200，按1.3.2.1⑴操作。

（2）G-200凝膠裝柱預（再生）處理 用去離子水沖洗3—5次，每次浸泡30 min，去除雜質與漂浮物，抽干，待用[23]。

（3）G-200凝膠裝柱平衡 按1.3.2.1（3）操作。

1.3.2.3 發酵蘋果渣多糖樣品的獲得

（1）DEAE-52纖維素柱發酵蘋果渣多糖樣品的獲得方法 稱取粗多糖樣品0.3 g溶于10 mL去離子水中，緩慢加入 DEAE-52纖維素柱，以 0.00—0.30 mol·L-1NaCl溶液進行梯度洗脫，流速1.0 mL·min-1，部分收集器每管收集8 min，苯酚硫酸法測定吸光值，制作洗脫曲線[23]。

（2）Sephadex G-200柱發酵蘋果渣多糖樣品的獲得方法 稱取1.3.2.3（1）多糖樣品0.03 g溶于5 mL去離子水，緩慢加入Sephadex G-200柱，去離子水為洗脫液，流速0.5 mL·min-1，部分收集器每管收集10 min，苯酚硫酸法測定吸光值，制作洗脫曲線[23]。

1.3.2.4 發酵多糖分離純化組分純度測定 參考竇姣等[23]方法測定分離純化組分純度。

1.3.3 發酵蘋果渣多糖結構表征

1.3.3.1 發酵蘋果渣多糖XRD分析 參照王小梅等[24]方法采用X射線衍射儀，條件為：Cukα輻射，管壓40 kV，管電流60 mA，角度5—50°，角度梯度0.02°進行樣品測定。

1.3.3.2 發酵蘋果渣多糖熱重分析 參照馬青等[25]的方法，在溫度范圍20—800℃，升溫速度10℃·min-1，掃描速度2 ℃·min-1，利用熱分析系統對樣品分析。

1.3.3.3 發酵蘋果渣多糖剛果紅試驗分析 參照王小梅等[24]方法利用紫外可見分光光度計在波長范圍 400—600 nm 進行掃描，以剛果紅為對照，以氫氧化鈉濃度為橫軸，測定該氫氧化鈉濃度下最大波長，以此為縱軸，作圖。

1.3.3.4 發酵蘋果渣多糖溶液粒度分析 參照王小梅等[24]方法配制20 mg·L-1多糖溶液，25℃，633 nm處用激光粒度儀檢測粒度分布情況。

1.3.3.5 發酵蘋果渣多糖微觀結構分析 采用TM3030臺式掃描電子顯微鏡在電壓為15 kV的條件下觀察發酵蘋果渣多糖樣品的形貌特征[26]。

1.4 數據分析與處理

空間自相關是指在具有差異性的空間區位商的地理現象，它們的某個特征值存在統計關聯性，空間自相關可分為全局空間自相關和局域空間自相關[8]。基于Geoda軟件計算出沈陽448個小區房價的莫蘭指數I，通過莫蘭指數I來判斷不同空間區位的小區房價在空間方面是否具有空間關聯性。

DPS v7.05統計軟件進行統計分析，Excel 2010、Origin 8.0軟件繪圖制表。

2 結果

2.1 發酵蘋果渣多糖的鑒定結果

2.1.1 發酵蘋果渣多糖純度鑒定

如圖1，3種多糖在260、280 nm無明顯紫外吸收，而蛋白質、核酸分別在280、260 nm處具有特征吸收峰，同時3種多糖在200 nm有多糖的特征吸收峰，說明3種粗多糖的核酸和蛋白質已除盡[27]。

圖1 多糖的紫外光譜圖Fig. 1 UV spectra of polysaccharides

2.1.2 發酵蘋果渣多糖含糖量測定 葡萄糖標準曲線為Y=3.6319X+0.0014，可計算蘋果原渣多糖（AP）、酒渣多糖（WFP）和醋渣多糖（VFP）含糖量，分別為70.17%、69.67%、71.34%，不存在顯著性差異，可見提取工藝所得多糖含糖量基本維持在70%左右，提取工藝具有可重復性[23]。

2.2 發酵蘋果渣多糖分離純化結果

2.2.1 DEAE-52纖維素處理對發酵蘋果渣多糖成分的影響 AP、WFP、VFP經DEAE-52纖維素柱根據多糖極性大小進行分離純化，由圖2-a可知AP經NaCl濃度梯度洗脫可得5種組分，其中以AP0.1、AP0.15、AP0.2較多，且 AP0.15＞AP0.2＞AP0.1，但水未能將AP分離開；由圖2-b可知，WFP經NaCl濃度梯度洗脫可得6種組分，其中以WFP0、WFP0.1、WFP0.15較多，且WFP0.15＞WFP0.1＞WFP0；圖2-c可知VFP 經NaCl濃度梯度洗脫可得6種組分，其中以VFP0、VFP0.1、VFP0.15、VFP0.2較多，且VFP0.15＞VFP0.1＞VFP0.2＞VFP0。

2.2.2 G-200凝膠處理對發酵蘋果渣多糖成分的影響2.2.2.1 樣品前處理 根據DEAE-52纖維素柱層析處理結果，將AP0.05與AP0.10記為DAP0.1，AP0.15 與AP0.20記為DAP0.2；同樣WFP可記為DWFP0（水洗脫組分）、DWFP0.1、DWFP0.2；VFP記為DVFP0、DVFP0.1、DVFP0.2。

2.2.2.2 G-200凝膠處理對 AP 的影響 DAP0.1、

DAP0.2經 G-200凝膠柱根據分子量篩選達到分離純化的目的，可得NAP0.1、NAP0.2。由圖3可以看出兩種組分均得到單一的峰，且峰型基本一致，可見經Sephadex G-200柱層析后得到均一的多糖成分[23]。

圖2 DEAE-52纖維素NaCl溶液梯度洗脫曲線Fig. 2 NaCl gradient elution curve with DEAE-52 cellulose column

圖3 AP Sephadex G-150洗脫曲線Fig. 3 Elution curve of AP on Sephadex G-150 column

2.2.2.3 G-200凝膠處理對WFP 的影響 DWFP0、DWFP0.1、DWFP0.2經去離子水G-200凝膠柱層析，得到NWFP0、NWFP0.1、NWFP0.2。由圖4可以看出經Sephadex G-200層析得到均一的多糖成分[23]。

2.2.2.4 G-200凝膠處理對 VFP 的影響 DVFP0、DVFP0.1、DVFP0.2經 Sephadex G-200層析，得到NVFP0、NVFP0.1、NVFP0.2。由圖5可以看出得到了分子量在一定范圍的均一純品[23]。

圖4 WFP Sephadex G-150洗脫曲線Fig. 4 Elution curve of WFP on Sephadex G-150 column

圖5 VFP Sephadex G-150洗脫曲線Fig. 5 Elution curve of VFP on Sephadex G-150 column

2.3 發酵蘋果渣多糖結構表征

2.3.1 發酵蘋果渣多糖XRD結果 XRD是利用X衍射原理來對樣品晶體結構進行研究的一種方法，可精確進行物相分析以及定性、定量[24]。3種多糖分離純化前后XRD如圖6-a、b、c，可見分離純化前后晶體結構變化并不明顯。根據晶體衍射布拉格公式2dsinθ=nλ可知當n=1，λ=1.54?時，由圖6可知θ計算晶格間距d，同時可知衍射最大峰值CPSmax，如表1。

表1 XRD參數匯總表Table 1 The parameter of polysaccharides with XRD

圖 6 原渣多糖（a）、酒渣多糖（b）、醋渣多糖（c）分離純化前后XRD對比Fig. 6 Comparison of AP and NAP0.1, NAP0.2 with XRD (a), comparison of WFP and NWFP0, NWFP0.1, NWFP0.2 with XRD (b), comparison of VFP and NVFP0, NVFP0.1, NVFP0.2 with XRD (c)

結合前人[28-29]研究可知，3種多糖分離純化前后衍射角2θ在5—50°都有衍射峰，且在分離純化后衍射峰值有減小趨勢，即分離純化不利于3種多糖晶體結構的形成。

2.3.2 發酵蘋果渣多糖熱重分析結果 熱重分析研究物質的晶體性質，如熔化、蒸發、升華和吸附等物質的物理現象及其熱穩定性、分解過程、脫水以及相關定量分析[30]。如圖7-a、b、c，AP在30.06℃左右質量開始下降，說明樣品中還有一定的自由水分，30.06—80℃重量損失較快，即80℃左右自由水分損失完全；80——230℃質量損失減緩，根據已有研究判斷是結合水損失階段；230℃以后質量損失速率達到最大，即230℃為AP的分解點溫度，重量半損失溫度為275℃，800℃重量損失85%。同樣方法可對其余成分進行分析，可知經分離純化處理發酵的多糖與AP所得成分有一定的差異，但區別不明顯。由表2可知，主要可以通過自由水損失溫度、結合水損失溫度、樣品分解溫度、半重損失溫度、末重損失率來分析晶體特性，對于失重初溫度只可作為參考值，因為試驗中每次加入樣品量難以達到統一，會直接影響到失重初溫度，而其余指標則基本不受添加量影響。

圖7 不同多糖熱重分析對比Fig. 7 Comparison of TG of different polysaccharides

表2 熱重分析結果Table 2 TG results

2.3.3 發酵蘋果渣多糖剛果紅檢測 剛果紅試驗是檢驗多糖是否具有螺旋結構的重要方法[24]。結合已有研究[31]，剛果紅與3種多糖溶液混合時，溶液最大吸光值發生了明顯紅移，隨著 NaOH濃度由0—0.5 mol·L-1，AP出現了亞穩區，結合最大吸收波長減小等特征可知存在三螺旋結構，但隨著 NaOH濃度由 0—0.5 mol·L-1，純化所得兩種組分并未出現亞穩區，因此，多糖在分離純化后并不存在三螺旋結構（圖8-a）；如圖8-b所示，當剛果紅與4種多糖溶液混合時溶液最大吸光值發生了明顯紅移，但隨著NaOH濃度由0—0.5 mol·L-1，WFP、NWFP0出現亞穩區、最大吸收波長減小，因此WFP、NWFP0存在三螺旋結構；如圖8-c所示，同樣可知VFP、NVFP0、NVFP0.1存在三螺旋結構。

圖8 純化原渣多糖（a）、酒渣多糖（b）、醋渣多糖（c）剛果紅試驗對比Fig. 8 Comparison of NAP0.1, NAP0.2 (a), NWFP0, NWFP0.1, NWFP0.2 (b), NVFP0, NVFP0.1, NVFP0.2 (c) with Congo red experiments

2.3.4 發酵蘋果渣多糖溶液粒度測定 多糖粒度大小與分子量、生物活性等密切聯系，越來越受到研究者的重視[24]。由表3知，AP由于分子量較大，為1 025.12 nm，分離純化后粒徑顯著減小（P＜0.05），減小到692.45 nm，且根據不同極性分離的多糖組分表現出極性越大、粒徑越大的特點，可見當極性達到最大時，組分粒徑大于AP；對于發酵多糖，由于分子量小、粒徑小，經DE-52纖維素和Sephadex G-200處理，加上透析對于分子量選擇作用，將小分子多糖或單糖丟失，造成粒徑在分離純化過程有所增加，但無顯著性差異；WFP粒徑為392.98 nm，經分離純化粒徑為449.07—691.16 nm；VFP粒徑為553.69 nm，經分離純化處理粒徑無明顯差異[32]。

表3 不同多糖粒度對比Table 3 Comparison of different particle sizes of polysaccharides

2.3.5 發酵蘋果渣多糖微觀結構 臺式掃描電鏡（DSEM）可廣泛應用于材料科學、納米顆粒、生物醫學、食品藥品等諸多領域[33]。如圖9，AP為片狀、條狀，同時有片狀出現彎曲現象，片狀之間存在一定的交聯，組合連接緊密，片狀結構大，形成網狀結構；NAP0.1、NAP0.2在DEAE-52纖維素與G-200凝膠層析作用下片狀明顯減小，NAP0.1主要是小塊片狀，且交聯作用弱化，組織連接相對松散，不存在網狀結構；NAP0.2主要是小塊片狀與顆粒（球）狀，交聯作用進一步弱化。此外，經DEAE-52纖維素與G-200凝膠層析作用，由AP、NAP0.1、NAP0.2可以看出三者可塑性越來越大，從另一方面證明交聯作用減弱，更加分散。

如圖10，WFP電鏡觀察為片狀、鋸齒狀，結構間連接緊密，有一定交聯作用；經DEAE-52纖維素與G-200凝膠層析作用，NWFP0，NWFP0.1，NWFP0.2片狀結構變小，與AP結果基本一致，可能是分離純化過程破壞分子間作用力、氫鍵等作用，同時齒狀結構消失，這與填料的篩分作用有關。此外，隨著極性增大，片狀結構依次減小，交聯作用減弱，NWFP0.1、 NWFP0.2出現了桿狀、顆粒狀結構[24]。

VFP電鏡觀察為片狀，結構間連接緊密，有一定交聯作用，但與AP、WFP相比，依次減弱（圖11）；經DEAE-52纖維素與G-200凝膠層析作用，NVFP0、NVFP0.1、NVFP0.2片狀結構變小，NVFP0出現孔狀、球形結構，NVFP0.1出現棒狀結構[24]。

圖9 蘋果原渣多糖分離純化前后臺式掃描電鏡對比（×1000）Fig. 9 Comparison of AP and NAP0.1, NAP0.2 with DSEM

圖10 蘋果酒渣多糖分離純化前后臺式掃描電鏡對比（×1000）Fig. 10 Comparison of WFP and NWFP0, NWFP0.1, NWFP0.2 with DSEM

圖11 蘋果醋渣多糖分離純化前后臺式掃描電鏡對比（×1000）Fig. 11 Comparison of VFP and NVFP0, NVFP0.1, NVFP0.2 with DSEM

3 討論

3.1 發酵蘋果渣多糖分離純化

AP、WFP、VFP提取率在70%左右，且經提取工藝處理后無核酸、蛋白質特征吸收峰，結果與竇姣[23]等研究相同。AP和發酵粗多糖經DEAE-52纖維素、Sephadex G-200層析篩選出均一的純品多糖，總糖含量在92%—95%，分離純化效果明顯[23-24]。

經DE-52纖維素梯度洗脫發酵蘋果渣多糖的極性減弱，原因是微生物作用下多糖分子鏈打開，分子量減小，此結果與前期研究[34]發酵對蘋果渣多糖溶解度、黏均分子量影響結果一致。根據王兆梅[35]、王曉娟[36]、戴偉[37]等研究結果，多糖的生物活性與分子量、黏度、溶解度等密切相關，即高溶解度是多糖發揮生物活性的前提，同時多糖黏度的大小直接影響其活性與加工特性，發酵蘋果渣多糖在溶解度方面的提升、黏度的減小都有利于更好的發揮抗癌、抗病毒等方面的生物活性，也有利于食品加工[35-37]。DEAE-52纖維素柱層析過程中極性越大的成分其分子量越大，經G-200凝膠柱層析部分大分子多糖在篩分作用下未能流出，導致分子量大的組分停留在固定相中，最終表現在峰高有所減小，與發酵蘋果渣多糖加工特性研究一致[25,34]。此外，發酵蘋果渣多糖分離純化各組分峰高區別不大的原因是釀醋過程不但包括酒精發酵還包括醋酸發酵，相對于酒渣發酵過程，醋渣具有周期長、菌種繁雜等特點，導致多糖分子經菌種利用后分子鏈破壞，分子量減小，經G-200凝膠柱層析作用大部分組分流出，峰高較大[23-24]。此外，分子量的大小直接影響多糖的生物活性與加工特性[25,35-37]，多糖分子量的減小對增加生物活性意義重大[36]。

經分離純化片狀結構變小，交聯作用減弱，導致多糖表觀黏度減小、溶解度增大，同時吸油性、吸水性等性質發生相應變化，與先前有關發酵蘋果渣多糖加工特性研究中物性、流變性等加工特性變化一致[34]。此外，交聯性減弱可能與 DEAE-52纖維素與 G-200凝膠層析作用有關，分離純化過程導致分子間作用力、氫鍵等作用減弱[23]。

3.2 發酵蘋果渣多糖結構表征

多糖在生物功能方面一直為多國研究者所青睞，但由于多糖結構復雜仍處于研究初期，需要更多深入的研究將多糖結構與其生物活性之間的關系進行進一步闡釋[35-36]。根據已有研究，除纖維素、淀粉外其余多糖皆為非晶態物質，結合呂峰[28]的研究，由于衍射峰強度較小，3種多糖分離純化前后皆為非晶態物質，呈無定型結構[23-24]。由表3知多糖加熱溫度不宜超過65℃，因此，多糖溶液濃縮溫度應小于65℃；多糖樣品在200℃會發生分解，在加工過程要注意溫度控制，避免影響多糖性質；由末重損失率可以看出多糖在高溫條件下不是很穩定，會發生分解，加工中應注意控制溫度在 150℃以內較好[23-24]，這將為發酵蘋果渣多糖加工與應用提供借鑒與理論支撐。

根據剛果紅試驗可知粗多糖都存在三螺旋結構，經發酵處理，組分NWFP0、NVFP0、NVFP0.1存在三螺旋結構，AP經分離純化無三螺旋結構成分，說明極性小的多糖組分可能含有三螺旋結構，這對于其生物活性也具有重大意義[35-37]。

蘋果渣多糖分離純化后更加穩定，粒徑差異更小，經分離純化后多糖的粒徑分散系數更小，說明分離純化效果明顯，原因是在DEAE-52纖維素與G-200凝膠層析作用下破壞了分子間的交聯作用，或破壞了氫鍵、范德華力等作用[24]；隨著極性變化導致聚集狀態有所變化，最終結構出現變化，導致相關物性、流變學發生相應變化，與之前在物性與流變學等加工特性方面的研究結果一致[34]。

4 結論

發酵蘋果渣多糖純度達70%，經分離純化后可得組分NAP0.1、NAP0.2、NWFP0、NWFP0.1、NWFP0.2、NVFP0、NVFP0.1、NVFP0.2，純度均達 92%以上。在結構研究中，由X衍射儀觀察、熱重、粒度、剛果紅、微觀結構等方面得出其在溶解度、黏度、物理性質等方面的改變有利于更好地發揮生物活性。另外，發酵多糖溶液濃縮溫度應小于65℃，加工溫度應小于150℃，發酵多糖在溶解度、黏度、物理性質等方面的改變也可獲得更好的加工特性。

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（責任編輯 趙伶俐）

Isolation and Purification of Polysaccharide from Fermented Apple Pomace and Its Relationship with Processing Characteristics

JIA Feng , GUO YuRong, YANG Xi, LIU Dong, LI Jie
(College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710119)

【Objective】On the basis of dynamic trend of separating and purifying of fermented apple pomace polysaccharides, the authors further investigated the structural properties , and in hoping of further elucidating the separating, purifying, bioactivity and processing properties of fermented apple pomace polysaccharides.【Method】Apple pomace polysaccharides (AP), wine fermented apple pomace polysaccharides (WFP) and vinegar fermented apple pomace polysaccharides (VFP) were used as experimental materials. On the basis of analysis of polysaccharides content, the authors used DEAE-52 cellulose column, NaCl as eluent, to separate polysaccharides according to the polarity difference among polysaccharides components. Through collecting effluent liquid using fraction collector and then the polysaccharides content was determined using with phenol sulfuric acid method,and the elution curve was depicted. Meanwhile, the obtained polysaccharides components with DEAE-52 cellulose column were further separated using Sephadex G-200 gel column, distilled water as eluent. After obtaining the separated polysaccharides components, the structural properties were thoroughly analyzed by using X-ray powder diffraction to observe the crystallographic structure, Thermogravimetric Analyzer was used to analyze thermogravimetric characteristics, Laser particle size analyzer to analyze granularity, and Congo red was used to explore triple helix structure of polysaccharides. Finally, Desktop Scanning Electron Microscope was also used to observe and analyze micro-structure of apple pomace polysaccharides.【Result】The content of original apple pomace polysaccharides was approximately 70%. Because the polysaccharides didn’t include protein and nucleic acid, so the extraction efficiency was excellent. NAP0.1 and NAP0.2 were obtained after AP were purified firstly through DEAE-52 cellulose column and 0.1, 0.2 mol·L-1NaCl were respectively used as eluents and then through Sephadex G-200 gel column and distilled water as eluent. Meanwhile, NWFP0, NWFP0.1 and NWFP0.2 were obtained after WFP was purified with DEAE-52 cellulose column and subsequently Sephadex G-200 gel column. After VFP was separated, NVFP0, NVFP0.1 and NVFP0.2 were obtained, too. All the separated constituents included over 92% polysaccharides, suggesting separation effect was satisfactory. Three polysaccharides, AP, WFP and VFP, were non-crystalline material between before and after separation. Concentration temperature of polysaccharides was strictly limited below 65 ℃, and the processing temperature was below 150 ℃. Before separation, AP, WFP and VFP all had triple helix structure. After separation, triple helix structure still existed in NWFP0, NVFP0, and NVFP0.1, while NAP0.1 and NAP0.2 had no triple helix structure. Compared with the original apple pomace polysaccharides, the separated apple pomace polysaccharides had better stability and smaller particle size, because lower dispersion coefficient of particle size was observed. Besides, flake structure in polysaccharides was less, and cross-linking effect attenuated after separation, which is beneficial for development of polysaccharides bioactivity.【Conclusion】Fermented apple pomace included over 70% polysaccharides, and polysaccharides content was up to 92% after crude polysaccharides was separated and purified. Besides, according to XRD, TG, LPSA and Congo red as well as DSEM analysis, it was concluded that the changes of solubility, viscosity and physical characteristics facilitated separated apple pomace polysaccharides developing bioactivity and processing characteristics.

fermentation; apple pomace; polysaccharides; separation and purification; structure Characterization; processing characteristics

2016-08-29；接受日期：2016-11-29

農業部現代產業技術體系建設專項（CARS-28）

聯系方式：賈豐，E-mail：feng_juslin@163.com。通信作者郭玉蓉，E-mail：yurongguo730@163.com