基因組定點修飾技術在動物基因組定點修飾中的應用研究進展

孫文采

DOI：10.16660/j.cnki.1674-098X.2017.11.244

摘 要：基因組靶向修飾效率低是目前基因治療的難題之一。近年來基因組定點修飾技術得到了飛速的發展，為克服這一難題提供了新的途徑。鋅指核酸酶（ZFNs）、類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALENs）或規律成簇間隔短回文重復序列（CRISPR/Cas9）技術可以對DNA進行雙鏈切割，通過細胞的同源重組修復機制，能夠實現對靶基因進行高效的定點修飾。該文主要針對這三種基因修飾工具，分別對其作用原理，在動物細胞基因定點修飾中的應用及其局限性進行綜述，以期為構建動物疾病模型，治療遺傳疾病提供新思路。

關鍵詞：基因定點修飾 基因治療 ZFNs TALENs CRISPR/Cas9

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：1674-098X（2017）04（b）-0244-02

基因組定點修飾技術是指利用基因工程的方法對基因組進行靶向改造的技術。基因組定點修飾技術為畜牧基因的改良、基因功能的研究以及遺傳性疾病治療提供了有力的工具，因此該技術對于構建動物疾病模型，治療遺傳疾病都具有重要的意義。基因組定點修飾技術的發展經歷了一個漫長過程。起初，科學家們通過同源重組的方法進行基因組修飾，但是自然條件下發生同源重組的幾率非常低，只有10-6 [1]。為了提高基因組定點修飾的效率，科學家們建立了Cre/loxP[2]、PiggyBac轉座子系統[3]，PhiC31整合酶系統[4]等方法。Cre/loxP可以進行條件性基因敲除或者敲入，目前主要應用于轉基因動物模型的制備，但是首先要在基因組中插入loxP序列，如何提高loxP插入的效率仍然是一個亟待解決的問題。PiggyBac轉座子系統和PhiC31整合酶系統都可以實現外源基因的特異性整合，但是PiggyBac轉座子系統會破壞細胞的內源基因，而PhiC31整合酶系統不能進行定點整合。近年來興起的基因修飾技術如鋅指核酸酶（ZFNs）、類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALENs）或規律成簇間隔短回文重復序列（CRISPR/Cas9）技術，克服了先前基因組定點修飾技術的缺陷，可以對DNA進行雙鏈切割，通過細胞的同源重組修復機制，能夠實現對靶基因進行高度特異和高效的定點修飾，為動物細胞基因組的定點修飾提供了新的途徑。該文就這三種基因修飾方法的作用原理、在動物基因組定點修飾中的應用進行綜述，并分別剖析了其應用局限性，展望了這三大基因組修飾系統的應用前景，以期為構建動物疾病模型，治療遺傳疾病提供新思路。

1 鋅指核酸酶（ZFNs）

1.1 ZFNs的作用原理

鋅指核酸酶單體主要包括兩部分：位于C末端的核酸酶結構域FokI和位于N端的特異性識別DNA的鋅指蛋白 （zinc fnger protein， ZFP）。ZFP通常由3～6個鋅指組成折疊形成ββα的二級結構，每個鋅指能夠識別基因組中3bp長的DNA序列，因此單個ZFN可以識別9～18個堿基。當兩個鋅指核酸酶單體分別與基因組中的特定序列結合且兩個鋅指核酸酶單體的分子間距在6～8bp時，FokI會形成二聚體發揮DNA切割活性。將DNA雙鏈切斷形成雙鏈斷裂切口。細胞會啟動DNA修復機制，主要包括非同源重組末端連接修復和DNA同源重組修復。前者會造成靶位點附近小片段的隨機插入或者缺失引起基因敲除；后者可以實現基因的敲入或者敲除。

1.2 ZFNs在動物細胞基因定點修飾中的應用及其局限性

目前，鋅指核酸酶已經在人類胚胎干細胞、果蠅、斑馬魚、大鼠、小鼠模式動物中實現了基因組的定點修飾。同時，鋅指核酸酶在遺傳疾病治療中也發揮了重要作用。2005年，美國的Sangamo公司利用鋅指核酸酶對免疫缺陷相關基因Il2Rγ進行了定點修復。Sangamo公司利用鋅指核酸酶實現了CCR5基因的定點修飾，從而提高T淋巴細胞對HIV病毒的抵抗力。2011年，Soldner等利用鋅指核酸酶對α-synuclein的點突變位點進行定點修飾，從而對帕金森疾病進行疾病治療。同年，Yusa利用鋅指核酸酶造成DNA雙鏈斷裂然后利用同源重組的方法將α1-抗胰蛋白酶導入到細胞中在小鼠中實現了α1-抗胰蛋白酶缺陷引起的肝病的基因治療。2014年，Genovese等利用鋅指核酸酶在造血干細胞中插入Il2RG基因的cDNA，在免疫缺陷小鼠中重建造血系統。鋅指核酸酶在基因治療中發揮了重要作用，但是該技術本身仍然存在局限性，比如構建難，周期長，價格昂貴以及脫靶會導致細胞毒性。這些局限性限制了鋅指核酸酶在基因治療中的廣泛應用。

2 類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALENs）

2.1 TALENs的作用原理

TALENs的構造類似于ZFN，主要是由DNA結合域和分子剪刀“Fok I”組成。不同的是：TALENs的DNA結合域是一段很長的重復氨基酸序列，是由1.5～33.5個TALE單元組成。每個TALE單元包括33～35個氨基酸組成，不同的TALE單元之間只有12，13位的氨基酸是不同的，其決定DNA堿基的識別點。目前為止，只有五種TALEN單元，其余DNA的對應關系分別為：氨基酸HD特異識別堿基C、氨基酸NI特異識別堿基A、氨基酸NN特異識別堿基G或A、氨基酸NG特異識別堿基T、氨基酸NK可以識別堿基A、T、C、G中的任一種。因此，TALE單元與DNA堿基之間有更好地對應關系。每個TALEN單體識別的靶序列長度一般在14～20個堿基，因此相比于ZFN，TALENs識別靶點的特異性更強，脫靶率更低。TALENs的工作原理類似于ZFNs，當FokI 形成二聚體時切開DNA雙鏈，FokI的切割位點位于兩個TALEN單體識別的靶標序列之間，此間隔一般在15～30 bp之間。DNA雙鏈斷裂后，細胞啟動修復體制，利用同源重組或者非同源重組末端連接修復進行基因修飾。

2.2 TALENs在動物細胞基因定點修飾中的應用及其局限性

目前為止，TALENs不僅在果蠅、蛔蟲、斑馬魚、青蛙、大鼠和豬等模式動物中實現了基因組的定點編輯，而且在斑馬魚和人的基因組中實現了定點插入。2012年，Sun利用TALENs和同源片段對缺陷型β珠蛋白基因進行定點修飾，使其恢復到正常序列，進而治療鐮刀型紅細胞病。2013年，Wang等利用TALENs對小鼠胚胎干細胞基因組進行修飾，獲得了Sry和Uty的突變的基因修飾小鼠。2014年，Liu等利用TALENs技術在猴的身上成功實現了Rett綜合征和孤獨癥相關的基因Mecp2的突變。2014年，Park等利用TALENs技術在hiPSC中成功將含有F8基因的140 kb染色體片段倒置。2015年，Menger等在特異性識別巨細胞病毒的T細胞中利用TALEN敲除糖皮質激素受體的基因，提高了造血干細胞移植的存活率。TALENs技術相比于ZFNs有一定的優勢，但是其本身仍然存在一些問題尚未解決，比如：TALENs重復序列在什么長度下活性最高，識別特異性最好；TALENs的脫靶率和細胞毒性雖然比ZFNs小但是仍未得到徹底解決。

3 規律成簇間隔短回文重復序列（CRISPR/Cas9）

3.1 CRISPR/Cas9的作用原理

CRISPR/Cas9的結構主要包括三部分：trans-activating crRNA（tracrRNA）、DNA內切酶Cas9蛋白編碼基因和CRISPR RNAs（crRNA）基因座。CRISPR主要由25～50 bp的同向重復序列（repeat）和26～72 bp的間隔序列（spacer）構成，其中重復序列被間隔序列間隔。CRISPR/Cas9的作用機制為：外源DNA作為短的回文重復序列整合在CRISPR基因組中，在RNaseIII催化作用下加工成熟，和tracrRNA通過堿基配對結合形成雙鏈RNA結構，共同指導Cas9蛋白在與crRNA引導序列互補的位點進行DNA雙鏈切割，造成雙鏈斷裂。細胞會啟動DNA相應的修復模式。與ZFN和TALEN等相比，CRISPR/Cas9具有打靶效率高、操作簡單、成本低、適用范圍廣的優點。

3.2 CRISPR/Cas9在動物細胞基因定點修飾中的應用及其局限性

目前，CRISPR/Cas9已經在多種細胞和模式動物中實現了基因組修飾。2013年，兩個實驗室同時利用CRISPR/Cas9系統在人類細胞中實現了基因組的靶向修飾。隨后，Wang 和Yang等利用CRISPR/Cas9系統成功實現了對多基因的同時修飾，獲得了轉基因小鼠。2014年，Xie等利用CRISPR/Cas9系統成功的矯正了誘導多能干細胞基因組中人β血紅蛋白基因的突變，為β地中海貧血病的基因治療提供了一種有效的策略。同年，Feng等利用CRISPR/Cas9定點敲除與腫瘤的發生發展密切相關的基因CDK11，成功抑制骨肉瘤細胞的增殖。2014年，Yin等利用CRISPR/Cas9系統在小鼠中成功實現了對突變基因FAH的糾正修復，為遺傳酪氨酸血癥的基因治療提供了有效方法。2015年，Yang等利用CRISPR-Cas9技術在豬基因組中將包括豬內源性逆轉錄病毒（PERV）的病毒在內的62個重復的基因失活，促進了異種器官移植的進一步發展。CRISPR-Cas9基因組修飾技術對基因治療的發展具有重要意義，但是其本身仍然存在一些問題沒有解決。比如：CRISPR/Cas9基因編輯技術對真核生物是否存在細胞毒性？CRISPR/Cas9未來如何在整體水平進行應用？

4 展望

基因組定點修飾技術基礎研究和臨床應用均有重大意義。ZFN、TALEN、CRISPR等新興的基因編輯技術使基因敲除和插入技術變得更為簡便快捷，這對研究基因功能和實現基因治療非常重要。目前，許多模式動物的單基因疾病模型尚未建立，利用這些新興技術在模式動物的胚胎干細胞中進行基因敲除或者定點修飾，對于研究該基因的功能和某些疾病的致病機理具有重要意義；另一方面，基因治療是根治遺傳性疾病的最直接的辦法，但是由于同源重組效率低下，基因組修飾技術不夠完善，阻礙了這一治療方法的廣泛應用。近年新興的這三大基因組修飾系統都大大提高了基因編輯的效率，為人類疾病的治療帶來嶄新的機遇。在今后的發展中，如果能夠針對這些基因編輯工具引起的免疫反應和脫靶效應建立安全、有效的檢測手段；減弱細胞毒性；優化基因導入系統，一定能夠極大地促進基因治療的廣泛應用。雖然這些基因修飾技術仍然存在許多問題，但是相關研究的最新進展表明該技術的應用將漸趨成熟，發展也更全面。利用這些技術開展的基因治療將會對腫瘤及人類遺傳性疾病的治療帶來重大影響。

參考文獻

[1] Cathomen T， Joung JK. Zinc-finger nucleases： the next generation emerges. Molecular therapy[J].The journal of the American Society of Gene Therapy， 2008（16）：1200-1207.

[2] Du ZW， Hu BY， Ayala M， Sauer B， Zhang SC. Cre recombination-mediated cassette exchange for building versatile transgenic human embryonic stem cells lines[J]. Stem Cells，2009（27）：1032-1041.

[3] Chen YT， Furushima K， Hou PS， Ku AT， Deng JM， Jang CW， et al. PiggyBac transposon-mediated， reversible gene transfer in human embryonic stem cells[J]. Stem cells and development，2010（19）：763-771.

[4] Monetti C，Nishino K，Biechele S， Zhang P，Baba T，Woltjen K，et al. PhiC31 integrase facilitates genetic approaches combining multiple recombinases[J].Methods，2011（53）：380-385.