HPLC-ELSD測定草石蠶低聚糖含量的研究

王智榮，崔春，趙謀明

(華南理工大學 食品科學與工程學院，廣州 510640)

HPLC-ELSD測定草石蠶低聚糖含量的研究

王智榮，崔春*，趙謀明

(華南理工大學 食品科學與工程學院，廣州 510640)

建立了高效液相色譜法(HPLC-ELSD)測定草石蠶中低聚糖含量的方法。采用蒸發光檢測器(ELSD)，色譜柱為Waters XBridge Amide色譜柱(4.6 mm×250 mm，3.5 μm)，流動相為乙腈(A)-水(B)，分別添加0.2%(V/V)三乙胺，梯度洗脫(A%為70%→45%→70%→70%，相應時間周期為0 min→16 min→16.01 min→20 min)，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃。結果表明：蔗糖、棉籽糖、水蘇糖在0.1～3.0 g/L質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數不小于0.9986；相對標準偏差(RSD)為1.49%～1.67%(n=5)；平均回收率分別為97.78%,97.99%,97.85%。干基草石蠶中蔗糖、棉籽糖、水蘇糖含量分別為(6.38±0.10)%,(2.72±0.08)%,(43.38±0.25)%。

草石蠶；低聚糖；高效液相色譜；蒸發光檢測器

草石蠶(StachyssieboldiiMiq.)，又稱地蠶、螺絲菜、寶塔菜、甘露子、地牯牛草、土蟲草、石蠶，屬于唇形科多年生草本植物[1]。研究表明[2]：草石蠶營養價值豐富，每1 kg草石蠶中含蛋白質55 g、脂肪3 g、碳水化合物203 g，還含有多種礦物質、維生素和膽堿等。草石蠶的根莖中以低聚糖為主，尤其含有大量的水蘇糖，幾乎不含淀粉和單糖[3]。

水蘇糖(Stachyose)是天然存在的一種功能性低聚四糖，具有穩定性高、低甜度、低熱量的特點，能夠明顯促進胃腸道內雙歧桿菌、乳酸桿菌等有益菌群的增殖，迅速改善人體消化道內環境，調節微生物菌群平衡，被譽為“天然超強雙歧因子”[4-6]。

檢測低聚糖的方法有高效液相色譜法、薄層色譜法和氣相色譜法[7,8]。其中，薄層色譜法具有消耗成本低、分析速度快、檢測時間短的優點，但是利用薄層色譜法做低聚糖的定量有較大的誤差，而且只能在負荷量很小的條件下才能達到滿意的分析結果；而采用氣相色譜法，需要將樣品制備成易于揮發并且對熱足夠穩定的衍生物以后才能進行測定。相比之下，高效液相色譜法則可以直接對提取得到的低聚糖進行檢測分析，具有無需衍生、分離效能高、無干擾等優點，而且還可以減少檢測過程中樣品糖分的損失。但目前使用高效液相色譜法檢測低聚糖的報道中，多以示差檢測器測定，其靈敏度低，系統平衡時間長，所需標準品量大，受外界條件影響較大[9,10]。本研究采用蒸發光檢測器(ELSD)對草石蠶低聚糖進行分析，建立了草石蠶低聚糖的HPLC-ELSD檢測方法，該方法操作簡單、靈敏度高、準確、重現性好。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent-1200系列高效液相色譜儀；Alltech 2000ES 蒸發光散射檢測器 美國格瑞斯公司；Waters XBridge Amide色譜柱(4.6 mm×250 mm，3.5 μm)；DS-8510超聲波發生器 上海生析超聲儀器有限公司；Milli-Q 超純水制備器 美國Millipore公司。

1.2 試劑

水蘇糖、棉籽糖(純度98.0%，Sigma公司)；葡萄糖、蔗糖(純度99.0%，Aladdin公司)；乙腈(色譜純，RCI Labscan Limited 公司)；草石蠶根莖購于甘肅鎮原縣，曬干粉碎；水為Millipore制備的超純水；所有溶劑和樣品溶液均用0.45 μm微孔濾膜過濾；其他試劑均為分析純。

2 試驗材料與方法

2.1 標準溶液的配制

2.1.1 單標儲備液的配制

分別準確稱取蔗糖、棉籽糖、水蘇糖標準品250 mg，用乙腈-水(體積比50∶50)溶解并定容至25 mL，配成10 g/L的甜味劑單標儲備液。

2.1.2 混合標準溶液的配制

將各糖類單標儲備液采用逐級稀釋的方法，采用乙腈-水(體積比50∶50)配制成濃度為0.1～3.0 g/L的系列混合標準液，所有單標儲備液和混合標準液均置于冰箱0～4 ℃下保存。

2.2 樣品的制備

草石蠶根莖曬干，粉碎。精確稱取草石蠶粉末樣品1.000 g，置于錐形瓶中，精密加入50 mL超純水，超聲處理(功率250 W，頻率35 kHz)5 min。將浸提液置于高速冷凍離心機以8000 r/min離心10 min。取上清液，稀釋至合適濃度，經0.45 μm濾膜過濾，濾液供分析用。

2.3 色譜條件的篩選

2.3.1 流動相的選擇

[11,12]和XBridge Amide色譜柱應用文集，經過反復試驗，最終確定梯度洗脫流動相：乙腈(A)，水(B)，分別添加0.2%(V/V)三乙胺。梯度洗脫(A%為70%→45%→70%→70%，相應時間周期為0 min→16 min→16.01 min→20 min)。此條件下所得到的供試品色譜圖分離度均能達到要求，檢出的樣品色譜峰分離度好、峰形尖、對稱性好，見圖1。

圖1 標準品的色譜圖

2.3.2 柱溫的選擇

柱溫不僅影響色譜峰保留時間的遷移，而且影響色譜的分離效果。本試驗考察了30,35,40 ℃ 3種不同柱溫下的HPLC檢測。結果表明：當溫度升高時，保留時間縮短并且柱效較高，但是部分峰位會產生相對位移與合并，所以本研究選擇在柱溫35 ℃時進行檢測。

2.3.3 流速的選擇

參考XBridge Amide色譜柱應用文集，隨著檢測流速的增大，色譜峰的保留時間會逐漸縮短，但是流速升高的同時色譜柱的柱壓也會隨之上升，從而間接地影響色譜柱的壽命，并且大流速時間過長，也會導致色譜柱的柱效降低，從而導致混合物的分離度變差，所以設定流速為1 mL/min。

2.3.4 ELSD參數的選擇

載氣壓力和漂移管溫度是ELSD檢測器的2個重要參數。不同壓力對應不同流速，而載氣流速將會影響霧化器中液滴的形成，從而影響檢測器的信噪比。漂移管溫度影響檢測器的響應，溫度升高，流動相蒸發趨于完全，信噪比上升，但溫度過高，可能導致分析物部分汽化，信號響應值反而變小。所以，本試驗條件下確定漂移管溫度為95 ℃；載氣流速為2.5 L/min。

3 結果與討論

3.1 線性關系及檢出限

根據草石蠶樣品低聚糖含量的差異，對蔗糖、棉籽糖、水蘇糖做了不同線性范圍的考察。將10 g/L的低聚糖單標溶液依次稀釋配制成3，2，1，0.5，0.2，0.1 g/L的系列混合標準液，在最佳條件下檢測，以糖類物質的峰面積(Y)對其質量濃度(X，g/L)進行線性回歸，結果見表1。

表1 蔗糖、棉籽糖和水蘇糖的線性范圍、線性關系、相關系數和檢測限

由表1可知，蔗糖、棉籽糖、水蘇糖在0.1～3.0 g/L質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數不小于0.9986，檢出限均不大于0.01 g/L(以極限噪音3倍的方法計算)。

3.2 精密度試驗

取蔗糖標準溶液(0.2600 g/L)、棉籽糖標準溶液(0.1100 g/L)和水蘇糖標準溶液(2.2500 g/L)，重復進樣5次，測定峰面積，結果見表2。各組分峰面積的相對標準偏差(RSD)為1.49%～1.67%，表明儀器精密度良好。

表2 蔗糖、棉籽糖和水蘇糖含量測定的精密度

3.3 回收率與相對標準偏差

取已知含量的草石蠶樣品提取液5份，稀釋至合適濃度。準確量取10 mL樣品提取稀釋液，精密加入蔗糖、棉籽糖和水蘇糖對照品，制備成加樣回收供試品溶液。在色譜最佳條件下檢測，測定各糖類物質的含量，按下式計算回收率，測定結果見表3。

表3 蔗糖、棉籽糖和水蘇糖加標回收率(n=5)

續 表

3.4 樣品測定

將草石蠶提取液稀釋至合適濃度，在上述色譜條件下進樣10 μL，平行5次。將測得的峰面積代入線性回歸方程，計算各糖類的含量，測得結果見表4。

表4 樣品中蔗糖、棉籽糖和水蘇糖含量(n=5)

在本文色譜條件下，草石蠶樣品中的低聚糖能夠有效分離，且峰型較好，見圖2。

圖2 樣品的色譜圖

4 結論

本研究首次報道了利用Waters XBridge Amide色譜柱測定草石蠶中低聚糖含量，通過優化色譜條件，建立了高效液相色譜-蒸發光檢測測定草石蠶中低聚糖含量的方法。該方法靈敏度高、重現性和回收率好，能準確、快速檢測出草石蠶的蔗糖、棉籽糖、水蘇糖含量。蔗糖、棉籽糖、水蘇糖在0.1～3.0 g/L質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數不小于0.9986；相對標準偏差(RSD)為1.49%～1.67%(n=5)；平均回收率分別為97.78%，97.99%，97.85%。干基草石蠶根莖中蔗糖、棉籽糖、水蘇糖含量分別為(6.38±0.10)%，(2.72±0.08)%，(43.38±0.25)%。

參考文獻：

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Research on Determination of Oligosaccharide inStachyssieboldiiMiq. by HPLC-ELSD

WANG Zhi-rong， CUI Chun*， ZHAO Mou-ming

(School of Food Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

Establish a HPLC-ELSD method for the determination of oligosaccharide inStachyssieboldiiMiq..The sample is separated on a Waters XBridge Amide column(4.6 mm×250 mm,3.5 μm)at 35 ℃ by ELSD and eluted with acetonitrile(A)-aqueous(B) solution added 0.2%(V/V)triethylamine respectively,gradient elution(A% is 70%→45%→70%→70%, the corresponding time period is 0 min→16 min→16.01 min→20 min)at a flow rate of 1.0 mL/min.The results show that there is a good linear range for sucrose,raffinose and stachyose in the quality concentration range of 0.1～3.0 g/L with a correlation coefficient no less than 0.9986,the relative standard deviations are 1.49%～1.67%(n=5),and the average recoveries are 97.78%,97.99% and 97.85% respectively.The sucrose,raffinose and stachyose inStachyssieboldiiMiq. are (6.38±0.10)%,(2.72±0.08)% and (43.38±0.25)% respectively.

StachyssieboldiiMiq.;oligosaccharide;HPLC;ELSD

2016-12-25 *通訊作者

國家863項目(2014AA093602)；中央高校基本科研業務費專項(2014220053)

王智榮(1990-)，男，湖南萊陽人，碩士，研究方向：食品生物技術；

崔春(1978-)，男，湖北洪湖人，教授，博士，研究方向：食品生物技術。

TS207.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.06.024

1000-9973(2017)06-0114-04