淹水脅迫對杭菊花色苷及合成相關酶和基因的影響

汪濤+陳璐+郭巧生+張曉明+宋玲珊

[摘要] 測定不同開放程度杭菊頭狀花序花色苷含量及其相關基因表達量和相關酶活性和含量，分析淹水脅迫對杭菊頭狀花序開放過程中花色苷合成的影響。結果發現杭菊CHS基因表達量和CHS酶含量隨杭菊頭狀花序開放程度的增加呈現先上升后下降的趨勢，而花色苷含量、DFR基因表達量和DFR酶活性均隨杭菊頭狀花序開放程度的增加而呈現先下降后上升的趨勢，花色苷與DFR基因和DFR酶呈顯著正相關，而與CHS基因和CHS酶無顯著相關性。說明淹水脅迫對杭菊花色苷的合成及其相關酶和基因有顯著影響，但不改變它們在杭菊頭狀花序開放過程中的變化規律，DFR基因和DFR酶的變化規律與花色苷一致，確實為花色苷合成的關鍵基因和關鍵酶，而CHS基因和CHS酶含量與花色苷的含量無顯著相關性，CHS基因和CHS酶是否為杭菊花色苷合成關鍵基因和關鍵酶還有待進一步研究。

[關鍵詞] 杭菊； 二氫黃酮醇還原酶； 查爾酮合成酶； 花色苷

[Abstract] The study is aimed at determine the content of anthocyanins and expressions of relative genes and activity of relative enzymes. The effects of flood stress on anthocyanins synthesis with relative genes and enzymes of Chrysanthemum morifolium cv. ′Hangju′ were analyzed. The expression of CHS and the content of CHS presented the trend of first rising and after downward with the increase of flowering degree. The content of anthocyanins、the expression of DFR and the activity of DFR presented the trend of first downward and after rising with the increase of flowering degree. There was a positive correlation among anthocyanins，DFR gene and DFR. However there was no significant correlation among anthocyanins，CHS gene and CHS. Flood stress has significant effects on anthocyanins synthesis with relative genes and enzymes of Ch. morifolium cv. ′Hangju′，but don′t change the patterns of genes expression and anthocyanins and enzymes accumulation. DFR and DFR are the key gene and key enzyme of anthocyanins synthesis.

[Key words] Chrysanthemum morifolium cv.′Hangju′； DFR； CHS； anthocyanins

藥用菊花為菊科植物菊花Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥頭狀花序，按照藥材產地和加工方法不同，分為“亳菊”、“滁菊”、“貢菊”、“杭菊”、“懷菊”[1]。杭菊Ch. morifolium cv.′Hangju′作為傳統藥用菊花，具有散風，清熱，平肝明目，清熱解毒的功效，主要化學成分包括黃酮類、揮發油類、綠原酸類等[2]。其花色苷作為黃酮類化合物的一種，多被研究其對植物花、果實顏色的形成的影響。近年來，花色苷的藥理作用逐漸受到關注。丁樂等[3]研究發現桑葚花色苷對小鼠常的壓缺氧和心肌缺血的實驗具有保護作用。有研究證明花色苷能夠通過降低血糖、增加胰島素分泌，改善胰島功能起到治療多種糖尿病的作用[4-5]?；ㄉ盏暮铣墒怯啥嗷蛘{控、多種酶參與、多步驟完成的[6-8]。通?；ㄉ蘸铣上嚓P基因可分為結構基因和調控基因兩大類，查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）、二氫黃酮醇還原酶 （dihydroflavonol 4-reductase，DFR）是花色苷合成途徑上的結構基因[9-10]。結構基因的表達模式通常會隨著植物的生長發育而改變，通常伴隨著開花、葉片伸展、果實成熟等生理過程而變化。

藥用菊花是一種對水淹非常敏感、缺乏有效耐澇機制的物種[11]，而受亞熱帶季風氣候的影響，長江流7—8月份陰雨的天氣多發，往往造成杭菊階段性淹水災害，對杭菊的產量和品質都有影響。本實驗通過研究淹水脅迫對杭菊花色苷合及其合成相關基因和酶的影響，為進一步研究杭菊花色苷合成機制和調控機制提供依據。

1 材料

實驗材料采自于浙江桐鄉藥用菊花種質圃，于2014年6月定植于南京農業大學藥用菊花種質圃，經南京農業大學中藥材研究所郭巧生教授鑒定為杭菊Ch. morifolium cv.′Hangju′；8月25日花芽開始分化對材料進行淹水脅迫處理，具體方法如下：將盆栽杭菊放入塑料桶內，加水使水面沒過盆栽土壤表面5 cm，處理組和對照組各設6個重復。3 d后解除脅迫，設置空白對照組。參照郭巧生等[12]藥用菊花頭狀花序開放程度標準見表1，圖1。將杭菊開花期分為5個時期，分別采摘各時期頭狀花序，-80 ℃保存備用。

2 方法

2.1 RNA提取與cDNA合成 利用Trizol法提取總RNA。提取后用瓊脂糖膠電泳檢測RNA的質量，并使用核酸檢測儀檢測所提RNA的濃度和純度。取10 μL RNA作為模板，按照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄得到cDNA第一鏈。

2.2 引物特異性檢測 根據杭菊CHS，DFR基因設計熒光定量PCR引物CHSq-F：5′-TCGTTGGTCAAGCTTTGTTC-3′和CHSq-R：5′-CTCCCTCCGAGTCTGGTAAG-3′；DFRq-F：5′-GACATTATGGAAGGCGGATT-3′和DFRq-R：5′-GTGGCAACATGAAACACTC-3′；內參基因引物為actin-F：5′-ACAACTGCTGAACGGGAAAT-3′和actin-R：5′-TCATAGACGGCTGGAAAAGG-3′。反應體系如下：cDNA 2 μL；10×Taq buffer 2 μL；ExTaq 0.2 μL；Mg2+ （25 mmol·L^-1） 2 μL；dNTP（2.5 mmol·L^-1）2 μL；引物，各0.5 μL；ddH2O 15.8 μL；總體積25 μL。反應條件為：預變性94 ℃ 3 min，94 ℃變性，30 s 58 ℃退火，1 min，72 ℃延伸，1 min 30 s，循環30次，72 ℃補充延伸，5 min。PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收和純化。

2.3 杭菊CHS，DFR基因表達量的測定 用SYBRPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒進行qPCR；PCR反應體系為：SYBR Premix Ex TaqTM（2×）10 μL；primer-F和primer-R均為（10 μmol·L^-1）0.4 μL（10 μmol·L^-1）；cDNA模版2 μL；ROX Reference Dye（50×）0.4 μL；ddH2O（滅菌蒸餾水）6.8 μL。設3個重復，以ROX作為熒光校正；預變性95 ℃，30 s后95 ℃，5 s，59 ℃，30 s，40個循環；熔解曲線為95 ℃，15 s，60 ℃，60 s，95 ℃，15 s，每升高0.3 ℃，采集1次熒光信號，重復3次。

2.4 花色苷的提取與測定 參照Mehrtens[13]的方法進行杭菊花色苷的提取。取300 mg杭菊頭狀花序，加入4 mL鹽酸-甲醇溶液（1∶99），室溫條件下溫和振蕩24 h后，12 000 r·min^-1離心10 min，取上清即為花色苷。取上清液分別在波長530，657 nm處測定吸光度，并計算花色苷含量，做3個生物重復。

2.5 CHS酶的提取和含量的測定 分別取對照組和處理組不同開放程度的新鮮的杭菊頭狀花序加入5 mL PBS緩沖液（pH 7.2～7.4，濃度為0.01 mol·L^-1）研磨充分，冷凍離心20 min，上清液即為粗酶液。采用植物物查爾酮合酶（CHS）酶聯免疫分析（ELISA）試劑盒測定CHS酶含量，做3個生物重復。

2.6 DFR酶的提取和活性測定 取0.3 g杭菊頭狀花序于液氮中研磨成粉末，加入1.8 mL預冷的丙酮，4 ℃，13 000 r·min^-1，離心15 min。棄上清，再加入1.8 mL 預冷的丙酮，4 ℃，13 000 r·min^-1，離心15 min。棄上清，加入1.5 mL，硼酸鹽緩沖液（內含8 μL抗壞血酸），4 ℃，12 000 r·min^-1，離心15 min。取上清液，即為DFR酶提取液。每個樣品設置1個對照品，各加入酶提液600 μL，1 mmol·L^-1的二氫槲皮素20 μL，0.3 mmol·L^-1的 NADPH 40 μL，pH 7.4 的Tris-HCl 340 μL。樣品管30 ℃水浴加熱1 h；對照管沸水中煮10 min。所有離心管冷卻至室溫，加入1 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩器振蕩20 s靜置分層。上清液再加入1 mL乙酸乙酯，重復3次，合并上清液在真空干燥器中干燥后加入3 mL正丁醇-HCl，95 ℃水浴加熱15 min，以對照管為空白對照，550 nm下測定吸光度，做3個生物重復。

3 結果與分析

3.1 RNA提取質量 利用Trizol法從杭菊頭狀花序中提取總RNA，經凝膠電泳檢測結果顯示28S rRNA和18S rRNA條帶清晰，見圖2。且前者亮度約為后者2倍，說明所提取RNA完整性較好；經吸光度A檢測顯示A260/A280=1.96，A260/A230=2.04，說明RNA純度較高，已達到RT-PCR擴增和qPCR要求。

3.2 引物特性檢測 對杭菊不同開放程度頭狀花序的cDNA進行CHS，DFR及內參actin的目的片段擴增，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果顯示3條基因均呈現單一條帶且條帶明亮、邊緣整齊。說明物特異性良好且不含有二聚體，達到做熒光定量PCR的要求，見圖3。

3.3 淹水脅迫對杭菊頭狀花序CHS基因和DFR基因表達量的影響 對照組和處理組杭菊頭狀花序

CHS表達量均隨花序開放程度的增加而呈現先增高后降低的趨勢，增高的趨勢大于降低的趨勢。處理組各時期表達量均明顯高于對照組。時期Ⅰ CHS表達量均達到最低值，時期Ⅲ CHS表達量均為最高值，見圖4。由圖4（b）可看出對照組和處理組杭菊頭狀花序DFR基因表達量隨頭狀花序開放程度的增加均出現先下降再上升的趨勢，下降的幅度大于上升的幅度，時期Ⅴ較時期Ⅳ表達量出現微量上升，但差異不顯著。處理組各時期表達量均顯著低于對照組。時期Ⅰ DFR表達量均達到最高值，時期Ⅲ DFR表達量均為最低值。

3.4 淹水脅迫對杭菊頭狀花序CHS酶含量及DFR酶活性的影響 對照組和處理組杭菊頭狀花序CHS酶含量均隨花序開放程度的增加而呈現先增高后降低的趨勢，且處理組各時期CHS酶含量均顯著高于對照組，見圖5。對照組和處理組CHS酶含量在時期Ⅲ達到最高值0.36，0.43 ng·g^-1，而在時期Ⅰ為最低值0.25，0.27 ng·g^-1。對照組時期Ⅱ 較時期Ⅰ CHS酶含量無顯著變化，而處理組同時期CHS酶含量明顯增加。由圖5（b）可看出對照組和處理組杭菊頭狀花序DFR酶活性隨頭狀花序開放程度的增加均出現先顯著下降，再緩慢上升的趨勢，且各時期處理組DFR酶活性均顯著低于對照組。時期Ⅰ對照組和處理組DFR酶活性均達到最高值，分別為54.5，33.3 U·g^-1（FW）；時期Ⅲ DFR酶活性均為最低值，分別為17.5，8.8 U·g^-1（FW）。對照組和處理組DFR酶活性下降的幅度均大于升高的幅度，期時Ⅴ對照組DFR酶活性明顯增加，而處理組增加不顯著。

3.5 淹水脅迫對杭菊頭狀花序花色苷含量的影響 對照組和處理組杭菊頭狀花序花色苷含量隨頭狀花序開放程度的增加均出現先下降再上升的趨勢，時期I花色苷含量均達到最高值，質量分數分別為5.5，3.1 mg·g^-1，時期Ⅲ花色苷含量均為最低值，質量分數分別為1.9，1.0 mg·g^-1。處理組各時期花色苷含量均顯著低于對照組。對照組和處理組花色苷含量下降的幅度均大于上升的幅度。時期Ⅳ和時期Ⅴ花色苷含量逐漸升高，對照組時期Ⅴ較時期Ⅲ花色苷含量顯著增加，而處理組時期Ⅲ、時期Ⅳ和時期Ⅴ花色苷含量無顯著差異，見圖6。

3.6 花色苷與其合成相關基因和酶的相關性分析 對照組杭菊花色苷含量與DFR基因和DFR酶呈極顯著和顯著正相關，而與CHS基因和CHS酶無顯著相關性。CHS基因與DFR基因、CHS酶與DFR酶也無顯著相關性。處理組杭菊花色苷含量與DFR基因和DFR酶呈極顯著正相關，而與CHS基因和CHS酶無顯著相關性。說明淹水脅迫不改變花色苷與其合成相關基因和酶的相關性，見表2，3。

4 討論

花色苷是植物在次生代謝過程中產生的一類類黃酮物質，它是一類水溶性的天然植物色素[14]，廣泛存在于植物的花、果實、種子、莖、葉和根的細胞液中[15]?；ㄉ詹粌H能夠控制植物花、果實等的顏色，還有一定的藥理作用，對人體有保健租用。花色苷的合成是一個復雜的過程，受到多種因素的調控。內部因素主要是受到一些花色苷合成相關基因和酶的調控。外部因素主要有光照、溫度、水分等。而這些因素對花色苷的影響大多也是通過影響花色苷合成途徑關鍵酶和基因來調控花色苷的合成。

CHS基因最早是從歐芹中分離獲得的[16]，是花色苷合成途徑中的第一個酶，它催化合成查爾酮，然后通過不同分支途徑轉變成為各種黃酮類化合物，而花色苷途徑正是其中的一條途徑。DFR是花色苷合成后期的關鍵酶，不同物種中或者相同物種中不同DFR成員往往催化不同的二氫黃酮醇生成不同的花青素苷并決定3種花色苷的含量和比例[17-19]。第一個DFR基因是從玉米和金魚草中采用轉座子標簽法分離到的[20]。

實驗結果表明杭菊頭狀花序CHS基因和DFR基因的表達量均隨頭狀花序開放程度的增加而改變，說明杭菊CHS基因和DFR基因的表達量存在時間上的差異性。這可能是因為花色苷合成相關基因的表達模式會隨花瓣的生長發育有所改變[21]。胡可[22]研究菊花花色苷合成途徑的結構基因發現舌狀花中大部分結構基因在花朵開放的初期表達量最高；隨著花朵開放程度的增加，表達量逐漸降低；開放末期表達量顯著上調。孟祥春[23]研究非洲菊時發現CHS基因在非洲菊花發育后期表達豐富。而在對蘋果的研究中發現CHS基因在花發育早期達到表達高峰[24]。本實驗中杭菊頭狀花序CHS基因表達量隨開放程度的增加呈現先上升后下降的趨勢，這可能是因為CHS基因的表達受到某些轉錄子等的調控以及外在條件的影響，如光照、溫度、激素等。胡可等[25]研究發現瓜葉菊花中DFR的表達量隨花序開放程度不同而改變，開放初期，DFR表達量豐度最高，隨著開放程度的增加DFR表達量逐漸下降，后期又有明顯上調。這與本實驗研究結果一致，實驗結果表明杭菊未開放時頭狀花序DFR表達量最高，開放初期頭狀花序DFR表達量顯著下降，后期又緩慢回升，頭狀花序完全開放時，表達量仍顯著低于未開放時期。開放前期DFR表達量下降可能某些轉錄因子受到抑制有關，后期DFR表達量又出現上升，很可能是由于DFR基因是光誘導基因，后期頭狀花序開放程度增大，接受光照面積增大，從而誘導DFR基因表達量的升高。

實驗發現DFR基因、DFR酶和花色苷三者呈顯著正相關，說明DFR酶確實為杭菊花色苷合成的關鍵酶，DFR基因確實為杭菊花色苷合成的關鍵基因。Honda等[26]在對3種不同品種蘋果的DFR花青苷積累關系的研究中發現，花青苷含量與DFR基因表達水平有一定的相關性。這與本實驗研究結果一致。實驗發現CHS基因和CHS酶雖然參與了花色苷的合成，但與花色苷含量并無顯著相關性，CHS基因和CHS酶是否為杭菊花色苷合成的關鍵基因和關鍵酶還有待進一步研究。

淹水脅迫是植物遭受的主要的非生物脅迫之一，它和干鹽堿、干旱、極端天氣等脅迫一樣都會引起植物生理生態和化學成分的改變。淹水脅迫下杭菊頭狀花序花色苷含量顯著降低，各時期均低于對照組，但隨開放成增加而變化的趨勢并沒有改變。淹水脅迫同樣使杭菊頭狀花序DFR基因的表達量和DFR酶活性顯著低于對照組，但隨開放程度而變化的趨勢沒有改變。相反，CHS基因表達量和CHS酶含量在淹水脅迫下顯著高于對照組，而隨開放程度增加而變化的趨勢不變。這表明淹水脅迫對杭菊花色苷含量及其合成相關酶活性好含量以及基因的表達量的均有顯著的影響，但并不改變它們在頭狀花序開放過程中的合成和表達模式。CHS基因表達量和CHS酶含量在淹水脅迫下顯著升高很可能是因為植物在受到逆境脅迫下會產生更多的次生代謝物，例如黃酮類化合物，CHS基因作為黃酮類化合物合成的關鍵基因可能受到某些次生代謝物的誘導或某些轉錄因子的誘導而大量表達，從而催化生成更多的次生代謝產物。而DFR基因表達量和DFR酶活性以及花色苷含量在淹水脅迫下均顯著降低很可能是由于淹水脅迫抑制了某些轉錄因子的表達從而抑制DFR基因的表達，使DFR酶活性受到抑制并最終導致了花色苷含量的降低。

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[責任編輯 呂冬梅]