中國沙棘葉黃酮類成分與生態因子相關性及其生態適宜性研究

蘇錦松+趙彩云+文檢+劉川+謝彩香+張藝

[摘要] 為了解決野生藏藥資源日益瀕危問題，推動藏藥野生資源保護與適宜區的發展和提供人工栽培種植新方法，該文采用HPLC對不同產地中國沙棘葉中槲皮素、山柰素、異鼠李素進行含量測定，應用偏最小二乘回歸法（PLSR），分析不同產地中國沙棘葉中黃酮類化學成分與生態因子間的相關性。該文基于Maxent模型結合運用ArcGIS軟件，對中國沙棘進行適宜區區劃研究。分析得出不同產地間中國沙棘葉中槲皮素、山柰素、異鼠李素含量差異明顯，且影響槲皮素積累的主導因子為海拔高度、1月份均降水量和8月份均降水量，影響山柰素含量積累的主導因子為海拔高度、最冷季度降水量、12月份均降水量和3月份均氣溫，影響異鼠李素含量積累的主導因子為8月份均降水量、1月份均降水量、最冷季度降水量和海拔高度；實驗結果表明中國沙棘在我國地區分布的適宜指數為0～0.708，適宜區面積59.05萬km2，占全國總面積的6.13%，較適宜區面積達55.25萬km2，占全國總面積的5.73%。對中國沙棘葉黃酮類成分與生態因子的相關性及中國沙棘生態適宜性研究，該法操作簡單可行、結果可靠，為藏藥資源實現可持續開發利用提供了一種新思路。

[關鍵詞] 藏藥； 中國沙棘葉； 黃酮； 生態因子； 生態適宜性； Maxent模型

[Abstract] The study aims at providing a new suitable way to promote artificial cultivation， solving the problem of resources increasingly endangered wild medicine， and protecting the wild resources of Tibetan medicine. The content of quercetin，kaempferol and isorhamnetin was determined by HPLC. The correlation between flavonoids components and ecological factors was analyzed using partial least-squares regression （PLSR）. Based on Maxent model combining using ArcGIS software， suitable regionalization for H.rhamnoides subsp. sinensis was studied.The results showed that the difference of quercetin，kaempferol and isorhamnetin content in samples from different regions were obvious. The main factors effecting quercetin content accumulation were the altitude andthe average monthly precipitation in January and August. The main factors effecting kaempferol accumulation were the altitude andthe average monthly precipitation in the coldest quarter and December. The main factors effecting isorhamnetin accumulation were the average monthly precipitation in August， January and the coldest quarter.The regional distribution suitability index for H.rhamnoides subsp. sinensis was 0-0.708. The suitable area 590 500 km2， accounting for 6.13% of the total area. The preferably suitable area was 552 500 km2， accounting for 5.73% of the total area.The methods used in the study is simple and feasible， the result is reliable which provide a new approach for Tibetan medicine resources sustainable exploitation and utilization.

[Key words] Tibetan medicine； Hippophae rhamnoides subsp. sinensis leaf； flavonoids； ecological factors； ecological suitability； Maxent model

沙棘Hippophae rhamnoides L.，又名醋柳、黑刺、酸刺，系胡頹子科Elaeagnaceae沙棘屬Hippophae Linn.灌木或喬木[1]。中國沙棘H. rhamnoides L. subsp. sinensis Rousi是我國特有種，在國內分布最廣、且用量最大，主要分布在西北、華北和東北各省[2-4] 的河流、山川以及丘陵溝谷兩岸，分布資源量大[5]。目前對于中國沙棘的研究，多集中于化學成分[6]、藥理活性、臨床應用[7]、產品開發[8]和生態環境改造[9-10]等。黃酮類對癌癥、糖尿病和心血管疾病等慢性疾病的預防和管理都有潛在的治療作用[11-13]。沙棘中含有豐富的黃酮類化合物，主要以槲皮素、異鼠李素、山柰素的苷存在[14-15]。本研究應用偏最小二乘回歸法[16-19]（PLSR）分析中國沙棘葉黃酮類成分與氣候因子相關性，并進一步對影響中國沙棘葉化學成分主導生態因子范圍進行確定。同時運用Maxent模型以及GIS技術[20-21]對中國沙棘進行適宜性區劃研究，找出影響中國沙棘分布的主要生態因子以及生態適宜區，對其進行分布預測和適生等級劃分，指導中國沙棘的野生資源保護和在適生區推廣人工種植。

1 材料

1.1 植物 樣品來源于四川省、西藏自治區、甘肅省和山西省，共17批次，實地采集新鮮葉片，用硅膠干燥，并記錄采集地海拔及經緯度，見表1。經成都中醫藥大學民族醫藥學院張藝研究員鑒定均為胡頹子科沙棘屬植物中國沙棘H. rhamnoides subsp. sinensis的干燥葉片，憑證標本保存于成都中醫藥大學民族醫藥學院標本室。

1.2 中國沙棘地理分布數據 中國沙棘在中國的分布數據，主要來源于中國數字植物標本館（http：//www.cvh.org.cn/），以及文獻整理與實地采樣調查。野外采集的中國沙棘標本，由成都中醫藥大學張藝研究員鑒定。初步收集中國沙棘分布點161個，包括物種名、經度和緯度等準確信息，主要分布于四川、甘肅、山西、青海、陜西等地區。

1.3 生態因子數據 本文所使用的氣候和高程數據來源于全球氣候數據庫（Worldclim；http：//www.worldclim.org/），由中國醫學科學院藥用植物研究所資源中心提供，包含海拔、月平均降水量、月平均氣溫等44個生態因子。

2 方法

2.1 中國沙棘葉中槲皮素、山柰素、異鼠李素的含量測定 采用高相液相色譜法（HPLC）測定中國沙棘葉黃酮類成分（槲皮素、山柰素、異鼠李素）。精密稱定樣品粉末（過3號篩）1.0 g，置具塞錐形瓶中，加入乙醇50 mL，稱重，水浴加熱（80 ℃）回流60 min，冷卻，再稱重，用乙醇補足失重，搖勻，濾過，精密量取續濾液20 mL，加鹽酸4 mL，水浴加熱（80 ℃）水解30 min，立即冷卻，濾過。取續濾液過微孔濾膜作為供試品溶液。色譜條件為：InertSustain C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，柱溫30 ℃，流速 1.0 mL·min^-1，進樣量10 μL，檢測波長370 nm，流動相甲醇-0.4%磷酸溶液（54∶46）。方法學考察結果顯示精密度、穩定性和重復性良好。

2.2 適宜性分布區域劃研究 本文從44個生態因子中初步篩選出19個貢獻率較高的生態因子，再基于Maxent模型ROC評價曲線，同時運用ArcGIS軟件，選取總貢獻率≥90%的11個生態因子作為主要生態因子，再加載到ArcMap中。加入從國家基礎地理信息系統網站下載的中國地圖，采用人工（manual）分級方法分析，劃分出中國沙棘適宜性分布區域，分為適宜區、較適宜區和不適宜區。

2.3 偏最小二乘回歸法分析 應用SIMCA-P 11.5 軟件檢驗方法進行PLSR分析，分析不同地區中國沙棘葉化學成分及其影響因子的相關變化趨勢。將有效成分作為因變量，生態因子值作為自變量建立回歸模型。各自變量縱坐標為正，則因變量與該自變量呈正相關；縱坐標為負，則表現負相關。最后通過變量投影重要性指標 （variable importance in projection，VIP）來測量，其值越大，說明自變量的重要程度越大。

3 結果與分析

3.1 不同產地中國沙棘葉中槲皮素、山柰素和異鼠李素含量比較分析 本文分為4個產地，分別是四川、西藏、甘肅和山西。不同產地間中國沙棘葉的化學成分含量存在差異。其中，各產地槲皮素平均含量大小為四川>甘肅>西藏>山西；各產地山柰素平均含量大小為甘肅>西藏>四川>山西；各產地異鼠李素平均含量大小為四川>西藏>甘肅>山西，見圖1。

3.2 中國沙棘適宜性區劃分析 根據Maxent模型預測結果，用GIS軟件空間分析工具，得到中國沙棘在我國的適宜指數為0～0.708。再根據中國沙棘資源調查以及已知的分布情況，采用人工分級方法分析，分為3個等級：適生性概率（即適合中國沙棘生長的可能性概率）0～0.2為非適宜區，適生性概率0.2～0.4較適宜區，適生性概率0.4以上為適宜區，見圖2。

由圖2可知，中國沙棘在我國分布范圍涉及山西、陜西、甘肅、寧夏、青海、四川、西藏、內蒙古、河北、遼寧10省（自治區）。適宜區主要集中于黃土高原以及青藏高原東北至東南的邊緣地區，從西南向東北方向呈帶狀分布在橫斷山脈東北側與太行山脈之間。適宜區包括四川省的阿壩藏族羌族自治州紅原、若爾蓋以及甘孜藏族自治州甘孜、德格、石渠地區；青海省的西寧、黃南藏族自治州、海北藏族自治州以及海東地區；甘肅省南部的蘭州、甘南藏族自治州、定西、臨夏、天水、隴南、平涼、慶陽地區；寧夏回族自治區的固原以及中衛、吳忠的南部地區；陜西省的榆林、延安，以及寶雞、漢中、咸陽與甘肅交界地區；

山西省中部的太原、呂梁、晉中、長治、臨汾地區；西藏自治區東部的拉薩、林芝、昌都地區。適宜區面積59.05萬km2，占全國總面積的6.13%。較適宜區域主要位于極高適生分布區域的外緣，向北延伸至河北、遼寧、內蒙古地區。較適宜區面積55.25萬km2，占全國總面積的5.73%。

3.3 生態因子與化學成分含量的PLSR分析 選取總貢獻率≥90%的11個生態因子，對不同產地的中國沙棘葉與其進行PLSR分析，其中11個生態因子包括：海拔X1、最冷季度降水量X2、最暖季度降水量X3、1月月均降水量X4、最干季度平均溫度X6、8月月均降水量X7、11月月平均氣溫X8、3月月平均氣溫X9、2月月平均氣溫X10和1月月平均氣溫X11。結果表明，中國沙棘葉中槲皮素含量（Y）與11個生態因子間的PLSR模型為：Y=0.765X1+0.297X2+0.073X3+0.504X4+0.003X5-0.006X6-0.432X7-0.002X8+0.007X9+0.026X10-0.063X11；中國沙棘葉中山柰素含量（Y）與11個生態因子間的PLSR模型為：Y =0.473X1-0.125X2+0.046X3-0.061X4-0.236X5-0.002X6+0.007X7+0.025X8-0.199X9-0.049X10+0.010X11；中國沙棘葉中異鼠李素含量（Y）與11個生態因子間的PLSR模型為：Y=0.831X1+0.273X2-0.163X3+0.640X4-0.074X5-0.004X6-0.961X7-0.034X8+0.287X9+0.133X10-0.135X11，見圖3。

由圖3（A）可以看出，海拔高度與中國沙棘葉中槲皮素含量呈極顯著正相關，其次為1月份均降水量和最冷季度降水量；8月份均降水量與槲皮素含量呈極顯著負相關。VIP直方圖結果表明：海拔高度（1.575），1月份均降水量（1.441）和8月份均降水量（1.143）的權重系數>1，是影響槲皮素含量的最主要因素；最冷季度降水量（0.998），最暖季度降水量（0.831）的權重系數>0.8，是影響槲皮素含量的次主要因素；其余6個生態因子對槲皮素含量基本不具備解釋意義。

由圖3（B）可以看出，海拔高度與中國沙棘葉中山柰素含量呈極顯著正相關，其次為最暖季度降水量；12月份均降水量與山柰素含量呈極顯著負相關，其次為3月份平均氣溫和最冷季度降水量。VIP直方圖結果表明：海拔高度（1.713），12月份均降水量（1.437），3月份平均氣溫（1.322）和最冷季度降水量（1.098）的權重系數>1，是影響山柰素含量的最主要因素；1月份均降水量（0.922），最暖季度降水量（0.885）和2月份平均氣溫（0.817）的權重系數>0.8，是影響山柰素含量的次要主要因素；其余4個生態因子對山柰素含量基本不具備解釋意義。

由圖3（C）可以看出，海拔高度與中國沙棘葉中異鼠李素含量呈極顯著正相關，其次為1月份均降水量和最冷季度降水量；8月份均降水量與異鼠李素含量呈極顯著負相關。VIP直方圖結果表明：8月份均降水量（1.858），海拔高度（1.245），1月份均降水量（1.121）和最冷季度降水量（1.077）的權重系數>1，是影響異鼠李素含量的最主要因素；3月份平均氣溫（0.957），最暖季度降水量（0.821）的權重系數>0.8，是影響異鼠李素含量的次要主要因素；其余5個生態因子對異鼠李素含量基本不具備解釋意義。

4 討論

4.1 中國沙棘葉黃酮類成分與生態因子相關性研究 在含量測定中，發現了來自四川省阿壩州紅原縣阿木鄉的1批次中國沙棘葉中異鼠李素質量數為0.62%，明顯高于其他16個批次的含量。原因可能為紅原縣海拔高，溫度常年偏低，對異鼠李素的積累有促進作用。來自山西4個批次的中國沙棘葉中槲皮素、山柰素和異鼠李素均比來自四川、西藏和甘肅的含量低，山西海拔不到1 000 m，降水，溫度均和其他3個地區有明顯差異，其含量差異也因有一定相關性。

確定了影響中國沙棘葉中槲皮素、山柰素和異鼠李素含量積累的主導生態因子具體如下：影響槲皮素積累的主導因子為海拔高度、1月份均降水量和8月份均降水量；影響山柰素含量積累的主導因子為海拔高度、最冷季度降水量、12月份均降水量和3月平均氣溫；影響異鼠李素含量積累的主導因子為8月分均降水量、1月份均降水量、最冷季度降水量和海拔高度。

采用HPLC對17批次不同產地中國沙棘葉黃酮類成分進行了分析，評價比較了其質量差異，發現來四川、西藏、甘肅等不同產區的中國沙棘葉品質存在差異性，同時也有一定的相關性。同時，結合PLSR探討了經緯度、溫度、降水等生態因子對其化學成分的影響，最終明確影響槲皮素、山柰素和異鼠李素含量積累的主導因，為藏藥中國沙棘的栽培、采收以及適宜性推廣提供了科學依據。

通過SIMCA-P分析對生態因子研究時，發現對于降水量的考察有不足之處，比如四川省阿壩州紅原縣阿木鄉等藏區，12月份時沙棘葉已經大部分凋落，此時研究雨水量對中國沙棘化學成分積累的影響就與實際情況不相符，所以應注重實際情況的考察，注重數據來源的科學性和合理性。

4.2 根據Maxent生態位模型分析結果 中國沙棘在我國地區分布的適宜指數為0～0.708，適宜區主要集中于黃土高原以及青藏高原東北至東南的邊緣地區，從西南向東北方向呈帶狀分布在橫斷山脈東北側與太行山脈之間，面積59.05萬km2，占全國總面積的6.13%，涉及山西、陜西、甘肅、寧夏、青海、四川、西藏、內蒙古、河北、遼寧10省（自治區）；較適宜區域主要位于極高適生分布區域的外緣，面積55.25萬km2，占全國總面積的5.73%，涉及河北、遼寧、內蒙古等省（自治區）。

根據Maxent生態位模型的檢驗結果，并結合課題組前期資源調查及文獻中對中國沙棘分布情況的記載，得到Maxent模型的適宜區區劃結果的可信度高，而對于分布區研究還有GARP，ENFA，Bioclim，Domain等生態位模型，后期可結合各種生態位模型綜合分析，進一步推進中國沙棘資源進行可持續開發利用。

從結果看，適宜區所涉范圍為采集的地點和標本記錄地點，然而研究者之前沒有調查過的地點，是否有沙棘還未知。Maxent生態位模型是根據已有的數據進行分析和預測，對沒有數據記錄的省無法分析和預測，在以后的研究中，會涉及多個省市，確保我們的數據包含所有中國沙棘生長區域，確保數據的全面性和科學性。

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[責任編輯 呂冬梅]