當歸炭疽病菌的生物學特性研究

楊成德，卞靜,陳泰祥,陳秀蓉*,王涵琦,楊小利，王艷

?

當歸炭疽病菌的生物學特性研究

楊成德1，卞靜1,陳泰祥1,陳秀蓉1*,王涵琦1,楊小利1，王艷2

(1.甘肅農業大學植物保護學院,甘肅 蘭州 730070;2.甘肅中醫藥大學,甘肅 蘭州 730000)

本試驗利用常規方法研究了當歸炭疽病菌(束狀炭疽菌Colletotrichumdematium)的生物學特性和營養利用能力，為明確當歸炭疽病的發生流行規律提供了依據。結果表明，菌落生長和孢子萌發最低溫度和最高溫度為10 ℃到35 ℃，最適為25 ℃；在pH 5～11間菌落可以生長，最適pH為11；在pH 8～11間產孢，最適pH為10，但中性有利于孢子萌發；該菌對碳氮源利用范圍廣，但甘露糖、D-半乳糖和氯醛糖抑制其生長；菌落生長和孢子萌發對光照不敏感；相對濕度95%以上分生孢子能萌發，水中萌發率顯著高于其他濕度條件(P<0.05)，蔗糖能夠促進孢子的萌發，但馬鈴薯汁液抑制其萌發。

當歸炭疽病菌；生物學特性；碳源；氮源

當歸(Angelicasinensis)為傘形花科多年生高山草本植物，是我國常用中藥材，其主要化學成分對機體的造血系統、循環系統、神經系統和免疫系統等多個系統具有藥理作用[1]，有補血、活血、調經、潤燥等多種功效[2]，不僅大量用于傳統中藥配方，而且是許多中成藥的重要原料和傳統出口商品。當歸喜涼爽、濕潤氣候，國內主要分布于甘肅、陜西、云南、四川和青海等海拔 1800～3000 m 山區種植[3]，尤以甘肅產量最大，但隨著種植面積的擴大以及種植年限的增長，田間炭疽病等病原菌逐年積累，造成當歸病害發病嚴重，影響當歸的品質和產量。目前國內已報道的栽培當歸病害主要有褐斑病(Septoriasp.)、腐爛莖線蟲病(Ditylenchusdestructor)、白粉病(Erysipheheraclei)、根腐病(Fusariumavenaceum)及水爛病等[4-7]，但野生當歸沒有發現病害[8]。當歸炭疽病為2012年調查發現的當歸新病害，在甘肅省岷縣、渭源和漳縣等地普遍發生[9]，但僅對該病癥狀和病原等進行了報道。本研究進一步對其病原生物學特性和碳氮源利用能力進行了測定，以期為該病害的發生流行規律深入研究及田間綜合防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試病原菌 當歸炭疽病菌束狀炭疽菌(Colletotrichumdematium)由甘肅農業大學植物病理實驗室保存。

1.1.2 供試培養基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)和察氏培養基參考文獻[10]配制。當歸汁液培養基參考文獻[9]配制。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同培養條件對菌落生長的影響 (1)溫度對菌落生長的影響，設5、10、15、20、25、30、35和40 ℃，共8個溫度條件。將病原菌活化培養后用6 mm直徑的打孔器打取菌餅，將菌餅接種到當歸浸汁液培養基上黑暗培養，觀察菌落生長情況，3 d后用十字交叉法每天測量菌落大小，直至生長最快的溫度滿皿，15 d后測定產孢量[11]。

(2)pH對菌落生長的影響，將當歸浸汁液培養基高溫滅菌后，用0.1 mol/L的HCl和0.1 mol/L的NaOH溶液在無菌條件下將培養基pH值調成4、5、6、7、8、9、10、11和12共9個梯度，將菌餅分別接種到這9種培養基上，25 ℃下黑暗培養，其他同1.2.1中(1)。

(3)碳源對菌落生長的影響，用察氏培養基作為基礎培養基，以葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、甘露糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-半乳糖、氯醛糖為碳源，以不加碳源的察氏培養基為對照，制成12種培養基，將菌餅接種在各種培養基平板上[12-13]，25 ℃下黑暗培養，其他同1.2.1中(1)。

(4)氮源對菌落生長的影響，用察氏培養基作為基礎培養基，以蛋白胨、大豆蛋白胨、尿素、硝酸銨、牛肉膏、硫酸銨、酵母浸粉、磷酸二氫銨、硝酸鈉、L-亮氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸、氯化銨、甘氨酸和碳酸銨為氮源，以不加氮源的察氏培養基為對照，制成16種培養基，將菌餅接種在各種培養基平板上[12-13]，25 ℃下黑暗培養，其他同1.2.1中(1)。

(5)光照條件對菌落生長的影響，將菌餅接種到當歸浸汁液培養基上，分別置于全光照和全黑暗的條件下，25 ℃下培養，其他同1.2.1中(1)。

1.2.2 不同培養條件對孢子萌發的影響 將保存的菌株接種到當歸浸汁液平板培養基上，于25 ℃下培養15 d，收集分生孢子進行以下試驗。

(1)溫度對孢子萌發的影響，設5、10、15、20、25、30、35和40 ℃，共8個溫度條件。將病原菌的分生孢子用無菌水配制成孢子懸浮液，懸滴法制片，3次重復，每2 h觀察1次，每個視野選擇100個孢子，記錄萌發率[13]。

(2)濕度對孢子萌發的影響，設100%，95%，90%，80%，70%，60%和50%，共7個相對濕度，在干燥器內用硫酸法控制濕度，將孢子粉撒于載玻片上，在25 ℃下培養，以蒸餾水中孢子萌發率為對照(CK)[13]，其他同1.2.2中(1)。

(3)pH值對孢子萌發的影響，設4.53、5.59、6.47、7.38、8.34和9.18[13]，共6個pH條件。用不同pH值的磷酸緩沖液配制成孢子懸浮液，懸滴法制片，3次重復，置于25 ℃下培養，其他同1.2.2中(1)。

(4)營養液對孢子萌發的影響，配制當歸汁液、當歸汁液加蔗糖溶液、蔗糖液和馬鈴薯汁液4種營養液，每種營養液3個濃度梯度，溶質∶水分別為1∶5、1∶10和1∶20。用不同營養液配制孢子懸浮液，懸滴法制片，3次重復，置于25 ℃下；以清水配制孢子懸浮液為對照；其他同1.2.2中(1)。

(5)光照條件對孢子萌發的影響，將病原菌的分生孢子用無菌水配制成孢子懸浮液，懸滴法制片，3次重復，分別置于全光照和全黑暗的條件下，其他同1.2.2中(1)。

圖1 溫度對菌落生長的影響Fig.1 The influence of temperature on colony growth標不同字母者在0.05水平差異顯著。下同。The different letters indicate significant diference at P<0.05.The same below.

圖2 pH對菌落生長的影響Fig.2 The influence of pH on colony growth

圖3 碳源對菌絲生長的影響Fig.3 The influence of carbon sources on hyphal growth1:葡萄糖Glucose;2:蔗糖Sucrose;3:乳糖Lactose;4:麥芽糖Maltose;5:甘露醇Mannitol;6:甘露糖Inannose;7:D-阿拉伯糖D-arabia sugar;8:D-木糖D-xylose;9:D-半乳糖D-galactose;10:氯醛糖Chloralose puriss;11:對照CK.

2 結果與分析

2.1 不同培養條件對菌落生長的影響

2.1.1 溫度對菌落生長及產孢量的影響 試驗結果(圖1)表明，當歸炭疽病菌在10～35 ℃下均能夠生長，其最適溫度為25 ℃，在5和40 ℃下則不能生長。在20和 25 ℃下可產孢，產孢量分別為26.1×107和2.8×107，其余溫度條件下不產孢。

2.1.2 pH對菌落生長及產孢量的影響 試驗結果(圖2)表明，當歸炭疽病菌菌落在pH值為5～12之間均能夠生長，pH 11為其最適生長酸堿度，當pH為4時基本不能生長；菌落生長速率與pH大小成正比，堿性條件更有利于其菌絲的生長，但當pH達到12時菌落生長率顯著降低。在pH 8～11能夠產生孢子，產孢量分別為0.35×106、0.85×106、13.30×107和1.20×106，pH 10時產孢量最大。

2.1.3 碳源對菌落生長的影響 試驗結果(圖3)表明，在葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、D-阿拉伯糖培養基上菌落生長顯著高于對照(P<0.05)，說明該菌能夠較好利用；在甘露糖、D-半乳糖和氯醛糖培養基上菌落生長顯著低于對照(P<0.05)，說明甘露糖、D-半乳糖和氯醛糖是其不良碳源。

2.1.4 氮源對菌落生長的影響 試驗結果表明，在供試的15種氮源培養基上，當歸炭疽病菌菌落生長速率顯著高于對照(P<0.05)，表明該菌對氮源的利用范圍非常廣泛(圖4)。

2.1.5 光照條件對菌落生長及產孢量的影響 試驗結果表明，當歸炭疽病菌在光照和黑暗條件下菌落生長差異不顯著，即菌落生長不受光照影響，但光照條件下不產生孢子，黑暗條件下產孢子量為2.8×106。

2.2 不同培養條件對孢子萌發的影響

2.2.1 溫度對孢子萌發的影響 試驗結果(圖5)表明，當歸炭疽病菌在5和40 ℃下不萌發，在10～35 ℃下均能萌發，但在35 ℃下萌發率為8%，在10 ℃下的萌發率達21%，說明其對低溫的適應能力略高于對高溫的適應能力。15～30 ℃條件下萌發率較高，其中25 ℃為其萌發的最適溫度，20和30 ℃之間無明顯差異。

圖4 氮源對菌絲生長的影響Fig.4 The influence of nitrogen sources on hyphal growth1:蛋白胨Peptone;2:大豆蛋白胨Soybean peptone;3:尿素Urea;4:硝酸銨Ammonium nitirate:5:牛肉膏 Beef extract；6：硫酸銨Ammonium sulfate;7：酵母浸粉Beef extract powder；8：磷酸二氫銨Ammonium dihydrogen phosphate；9:硝酸鈉Sodium nitirate;10:L-亮氨酸L-leucine;11:L-精氨酸L-arginine;12:L-組氨酸L-histidine;13:氯化銨Ammonium chloride;14:甘氨酸Glycine;15:碳酸銨Ammonium carbonate；16：對照 CK.

2.2.2 濕度對孢子萌發的影響 試驗結果表明，當相對濕度低于95%時孢子不萌發，在濕度達到95%和100%時，12 h后萌發率僅4%和10%，而在水中(CK)萌發率達85%。

2.2.3 pH對孢子萌發的影響 試驗結果表明，當歸炭疽病菌對酸堿度的適應范圍較廣，在pH 4.53～9.18之間均能萌發。在6.47～8.34間萌發率最高，強堿性和強酸性條件不利于孢子的萌發(圖6)。

2.2.4 營養液對孢子萌發的影響 試驗結果表明，當歸炭疽病菌在4種營養液中均能夠萌發，且不同營養液和同種營養液的不同濃度對孢子萌發的影響差異性顯著，但只有蔗糖溶液能夠促進孢子的萌發，且萌發率與蔗糖溶液的濃度成正比(表1)。

2.2.5 光照條件對孢子萌發的影響 在全光照和全黑暗條件下培養的分生孢子萌發率差異不顯著，14 h后分別為82%和86%，說明當歸炭疽病菌的分生孢子對光照不敏感。

表1 營養液對孢子萌發的影響Table 1 The effect of nutrition solution on conidial germination %

注：同營養液不同比例間標不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖5 溫度對孢子萌發的影響Fig.5 The effect of temperature on conidial germination

Note:The different proportion of nutrient solution with different letters indicate significant difference atP<0.05.

圖6 pH對孢子萌發的影響Fig.6 The effect of pH value on conidial germination

3 結論與討論

炭疽病為植物上一類重要病害，在馬鈴薯(Solanumtuberosum)[14]、紅掌(Anthuriumandraeanum)[15]和大豆(Glycinemax)[16]等植物上均有報道，但由束狀炭疽菌引起的當歸炭疽病為國內新病害[9]，該病原菌菌絲生長的最適溫度為25 ℃，低于火龍果(Hylocereusundulatus)炭疽病原菌的30 ℃[17]、油茶(Camelliaoleifera)炭疽病菌的28 ℃[18]和無花果(Ficuscarica)炭疽病菌的25～30 ℃[19]，但與南繁區棉花(Gossypiumspp.)炭疽病菌[20]及枸杞(Lyciumchinense)炭疽病菌[20]的最適溫度相一致；在pH 5～11之間均能夠生長，最適pH為11，但在pH 8～11之間才能產孢，且產孢的最適pH為10，其顯著高于其他炭疽菌[17-21]，該特點是否與寄生當歸后的適應性有關還需進一步研究；該菌對碳氮源的利用范圍非常廣，但甘露糖、D-半乳糖和氯醛糖抑制其生長，在綜合防治中有參考價值；該菌的菌絲生長和孢子萌發均不受光照和黑暗條件下的影響，與馬鈴薯炭疽菌一致[14]。孢子萌發的最適溫度為25 ℃，在5和40 ℃下則不萌發，與馬鈴薯炭疽菌一致[14]，但孢子對濕度要求極高，需在液態水中才能萌發；中性至偏堿性和酸性條件下有較高的萌發率，與火龍果炭疽菌[17]和馬鈴薯炭疽菌[14]一致；高濃度的蔗糖溶液能夠促進孢子的萌發，但高濃度的馬鈴薯溶液可以抑制其萌發。根據對束狀炭疽菌生物學特性研究結果表明，當歸栽培的土壤條件應當選擇排水良好、疏松肥沃、腐殖質豐富的砂質土壤，避免因積水造成濕度過大有利于孢子萌發和侵染而加重病害的為害程度；另外，要避免過度密植，改善通風透光條件，降低濕度；第三，雖然酸性條件有利于孢子萌發，但不利于菌落生長，特別不利于產孢，可能酸性土壤種植當歸有利于炭疽病的控制；第四，前薦種植馬鈴薯可能不利于病害的發生。本研究對當歸炭疽病病原菌束狀炭疽菌的生物學特性進行了研究，為當歸炭疽病的發生規律和綜合防治提供了一定的理論依據，但該病具體的田間防治方法還需進一步研究。

References：

[1] Li X,Zhang L H,Wang X X,etal.Research progress on chemical constituents and pharmacological effects ofAngelicasinensis.Journal of Chinese Medicinal Materials,2013,36(6):1023-1028.李曦,張麗宏,王曉曉,等.當歸化學成分及藥理作用研究進展.中藥材,2013,36(6):1023-1028.

[2] Chinese Pharmacopoeia Committee.Pharmacopoeia of the People’s Republic of China[M].Beijing:Chemical Industry Press,2005:190.國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:化學工業出版社,2005:190.

[3] Zhang H Y,Luo L,Yu Y,etal.Investigation on germplasm resources ofAngelicasinensis.Journal of Chinese Medicinal Materials,2009,32(3):335-337.張宏意,羅連,余意,等.當歸種質資源調查研究.中藥材,2009,32(3):335-337.

[4] Liu H,Li Z K,Yang J,etal.Preliminary study on angelica root-rot disease complex.Journal of Yunnan Agricultural University,2011,26(4):458-464.劉華,李正科,楊靜,等.當歸根腐病的病原初步研究.云南農業大學學報,2011,26(4):458-464.

[5] Lu J Y.Medical Plant Diseases[M].Beijing:Chinese Agriculture Press,1995.陸家云.藥用植物病害[M].北京:中國農業出版社,1995.

[6] Han J S.Diseases of Chinese Medicinal Plants[M].Changchun:Jilin Science and Technology Press,1994.韓金生.中國藥用植物病害[M].長春:吉林科學技術出版社,1994.

[7] Lv Z B,Li M Q,Hui N N.Pathogen identification of water spot disease on Chinese angelica at Dingxi City of Gansu Province and pathogenicity test.Plant Protection,2013,39(2):45-49.呂祝邦,李敏權,惠娜娜.甘肅省定西市當歸“水爛病”病原鑒定及致病性測定.植物保護,2013,39(2):45-49.

[8] Zhao R M,Chen Y,Guo F X,etal.Comparative study on distributed feature of wildAngelicasinensisresources and the difference in growth characteristics with its cultivars native to Minxian County of Gansu.Acta Prataculturae Sinica,2014,23(2):29-37.趙銳明,陳垣,郭鳳霞,等.甘肅岷縣野生當歸資源分布特點及其與栽培當歸生長特性的比較研究.草業學報,2014,23(2):29-37.

[9] Bian J,Chen T X,Chen X R,etal.Pathogen identification and occurrence regularity of a novel disease-Angelocaanthracnose.Acta Prataculturae Sinica,2014,23(6):266-273.卞靜,陳泰祥,陳秀蓉,等.當歸新病害-炭疽病病原鑒定及發病規律研究.草業學報,2014,23(6):266-273.

[10] Fang Z D.The Method of Plant Pathology Research[M].Beijing:Chinese Agricultural Press,1998.方中達.植病研究法[M].北京:中國農業出版社,1998.

[11] Wei J C.Fungi Identification Handbook[M].Shanghai:Shanghai Publishing Press,1974： 405-602.魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海:上海出版社,1974： 405-602.

[12] Wang W K,Yuan W D,Zhou Z F.Effects of different carbon and nitrogen sources on the mycelium growth ofSparassiscrispa.Journal of Zhejiang Agricultural Sciences,2007,(1):47-49.王偉科,袁衛東,周祖法.不同碳、氮源對繡球菌菌絲生長的影響研究.浙江農業科學,2007,(1):47-49.

[13] Chen X R,Nan Z B,Yang C D,etal.Morphological and biological characteristics of threeBipolarisspecies isolated from grasses in Huanxian grassland,Gansu province.Acta Prataculturae Sinica,2003,12(6):86-92.陳秀蓉,南志標,楊成德,等.3種牧草根際平臍蠕孢形態和生物學特性.草業學報,2003,12(6):86-92.

[14] Yang C D,Chen X R,Jiang H X,etal.Studies on the biological characteristics and nutrition using ability ofColletotrichumcoccodes.Plant Protection,2013,39(4):40-45.楊成德,陳秀蓉,姜紅霞,等.馬鈴薯炭疽病菌的生物學特性及培養性狀研究.植物保護,2013,39(4):40-45.

[15] Xing H M,Ding P,Wang K R,etal.Identification ofColletotrichumsp.fromAnthuriumand raeanumandits sequencing of ribosomal DNA-ITS.Acta Horticulturae Sinica,2009,36(5):743-748.邢紅梅,丁平,王克榮,等.紅掌炭疽病病原的分離鑒定及其核糖體DNA-ITS序列分析.園藝學報,2009,36(5):743-748.

[16] Lou B G,Chen W J,Lin C,etal.A new symptom type of soybean pod anthracnose and identification of its pathogen.Acta Phytophylacica Sinica,2009,36(3):229-233.樓兵干,陳吳健,林釵,等.一種新大豆豆莢炭疽病癥狀類型及其病原鑒定.植物保護學報,2009,36(3):229-233.

[17] Zhu Y Y,Li M,Gao Z Y,etal.Identification and biological characteristics of anthracnose pathogen from pitaya (Hylocereusundulates).Journal of Southern Agriculture,2016,47(1):59-66.朱迎迎,李敏,高兆銀,等.火龍果炭疽病病原菌的鑒定及生物學特性研究.南方農業學報,2016,47(1):59-66.

[18] Zhu Y Z,Liao W J,Zou D X,etal.Identification and biological characteristics of the pathogenCamelliaoleiferaanthracnose in Guangxi.Journal of Plant Protection,2015,42(3):382-389.朱英芝,廖旺姣,鄒東霞,等.廣西油茶炭疽病病原菌鑒定及生物學特性.植物保護學報,2015,42(3):382-389.

[19] Fan K,Zhang X D,Yu X M,etal.Biological characteristics ofColletotrichumgloeosporioidesand inhibitory effects of eight fungicides.Acta Phytopathologica Sinica,2013,43(1):75-81.范昆,張雪丹,余賢美,等.無花果炭疽病菌的生物學特性及8種殺菌劑對其抑制作用.植物病理學報,2013,43(1):75-81.

[20] Liu W B,Li P,Wu G L,etal.Biological characteristics ofColletotrichumgossypiiin Hainan.Chinese Journal of Tropical Agriculture,2016,36(1):51-57.劉文波,李平,鄔國良,等.南繁區棉花炭疽病菌生物學特性研究.熱帶農業科學,2016,36(1):51-57.

[21] Li J J,Zhang X R,Liu Y G,etal.Study on the biological characteristics ofColletotrichumgloeosporioidesof Chinese wolfberry in Gansu Province.Chinese Agricultural Science Bulletin,2015,31(13):176-181.李佳佳,張新瑞,劉永剛,等.甘肅省枸杞炭疽病病原生物學特性研究.中國農學通報,2015,31(13):176-181.

Biological characteristics of theAngelicasinensisanthracnose causal agent,Colletotrichumdematium

YANG Cheng-De1,BIAN Jing1,CHEN Tai-Xiang1,CHEN Xiu-Rong1*,WANG Han-Qi1,YANG Xiao-Li1,WANG Yang2

1.CollegeofPlantProtection,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China;2.GansuUniversityofChineseMedicine,Lanzhou730000,China

The biological characteristics and substrate requirements ofColletotrichumdematiumwere studied using traditional culture techniques to provide a basis for understanding the occurrence of outbreaks ofAngelicasinensisanthracnose.It was found that the temperature range over which mycelium growth and conidial germination ofC.dematiumoccurred was from 10 ℃ to 35 ℃,with an optimum temperature of 25 ℃.Mycelium growth occurred from pH 5 to pH 12,and the optimum pH value was 11.Conidia were produced from pH 8 to pH 11,and the optimum pH value for conidia production was 10,while the optimum for conidial germination was pH 7.The mycelium ofC.dematiumgrew best on media with more abundant carbon and nitrogen supply,but were inhibited by mannitol,D-galactose and chloralose.Mycelium growth and conidial germination were not sensitive to light.Conidia required a relative humidity of 95% or more for germination,and liquid water was the most suitable medium for conidial germination (P<0.05).Sucrose solution promoted conidial germination,but potato solution inhibited germination.

Colletotrichumdematium;biological characteristics；carbon source;nitrogen source

10.11686/cyxb2016295 http://cyxb.lzu.edu.cn

楊成德,卞靜,陳泰祥,陳秀蓉,王涵琦,楊小利,王艷.當歸炭疽病菌的生物學特性研究.草業學報,2017,26(6):139-144.

YANG Cheng-De,BIAN Jing,CHEN Tai-Xiang,CHEN Xiu-Rong,WANG Han-Qi,YANG Xiao-Li,WANG Yang.Biological characteristics of theAngelicasinensisanthracnose causal agent,Colletotrichumdematium.Acta Prataculturae Sinica,2017,26(6):139-144.

2016-08-17；改回日期：2016-10-19

甘肅農業大學自列項目(GSAU-ZL-2015-014)資助。

楊成德(1975-)，男，甘肅武都人，教授，博士。E-mail:yangcd@gsau.edu.cn

*通信作者Corresponding author.E-mail:chenxiurong@gsau.edu.cn