高轉(zhuǎn)化人參皂苷菌株篩選鑒定及發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

方磊，陳紅，余曉斌

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

高轉(zhuǎn)化人參皂苷菌株篩選鑒定及發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

方磊，陳紅，余曉斌

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

用含七葉苷檸檬酸鐵的平板篩選產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株；再用對(duì)硝基苯酚-β-葡萄糖苷(pNPG)為底物測(cè)定β-葡萄糖苷酶酶活，篩選出6株酶活較高的菌株。利用篩選的菌株以人參皂苷Rb1為底物進(jìn)行發(fā)酵轉(zhuǎn)化，通過(guò)薄層色譜(thinlayer chromatograph, TLC)和高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)檢測(cè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的種類(lèi)和含量，確定轉(zhuǎn)化率最高的菌株。該菌株β-葡萄糖苷酶酶活為0.803 U/mL，人參皂苷Rd轉(zhuǎn)化率為97.234 2%。對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、18S rDNA基因序列進(jìn)行分析，經(jīng)鑒定該菌株是Saccharomycopsisfibuligera。對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果是：碳源為乳糖，氮源為玉米粉，金屬離子為Ca2+。最后對(duì)誘導(dǎo)劑進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)劑對(duì)轉(zhuǎn)化率沒(méi)有顯著影響，但是蘆丁能夠誘導(dǎo)人參皂苷Rd向CK的轉(zhuǎn)化。

人參皂苷；β-葡萄糖苷酶；酵母菌；鑒定；優(yōu)化

人參(ginseng)，廣泛應(yīng)用于中藥、保健品中，其有效成分是人參多糖、人參揮發(fā)油、氨基酸和人參皂苷[1]，主要有效成分是人參皂苷[2]。目前已有180多種人參皂苷被發(fā)現(xiàn)，50多種人參皂苷被分離[3]。人參皂苷分3類(lèi)，分別是原二醇型人參皂苷、原三醇型人參皂苷和齊墩果酸型人參皂苷，其中二醇型人參皂苷Rb1占總皂苷含量的20%以上[4]。由于腸道菌的作用人參皂苷在體內(nèi)被轉(zhuǎn)化為含側(cè)鏈糖基少的人參皂苷，而側(cè)鏈糖基少的人參皂苷才能被人體腸道細(xì)胞吸收[5]。人參皂苷轉(zhuǎn)化方法主要有酸堿法，酶法和微生物法，酸堿法具有效率低，對(duì)環(huán)境有害等缺點(diǎn)[6-7]；酶法具有造價(jià)成本高，工藝復(fù)雜等缺點(diǎn)[8]；微生物法反應(yīng)要求低，成本低，有利于工業(yè)化應(yīng)用[9]。目前,對(duì)人參皂苷研究主要集中在酶轉(zhuǎn)化法和微生物法方向上[10]，但篩選1株轉(zhuǎn)化率高的無(wú)害菌株，依然是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。本課題主要是以農(nóng)村腌菜汁和大曲為樣品及實(shí)驗(yàn)室原有的益生菌菌種，進(jìn)行高轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1無(wú)害菌株的篩選并對(duì)人參皂苷發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源

取自不同地區(qū)不同種類(lèi)的腌菜和腌菜汁和大曲。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

檸檬酸鐵、正丁醇、乙腈：色譜純、甲醇：色譜純、七葉苷購(gòu)自Sigma公司；人參皂苷Rb1、Rd、CK等標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海源葉生物技術(shù)公司；真菌DNA提取試劑盒、Taq酶、溶菌酶、膠回收試劑盒購(gòu)自天根生物科技公司；硅膠板購(gòu)自德國(guó)馬克公司。

1.1.3 篩選培養(yǎng)基

含3 g/L七葉苷、0.2 g/L檸檬酸鐵的MRS培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基。

1.1.4 發(fā)酵培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基或糖度為5°P的麥汁培養(yǎng)基。

1.2 主要的儀器設(shè)備

超級(jí)恒溫水浴鍋HH-501，常州翔天實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；SB-25-12-DT超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；可見(jiàn)分光光度計(jì)721N，上海精科有限公司；安捷倫1260高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 篩選產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株

取各種泡菜擠出1 mL浸出液和1 g大曲分別加入含9 mL無(wú)菌生理鹽水的試管里，逐級(jí)稀釋?zhuān)謩e吸取稀釋度為10-1～10-6的菌懸液200 μL，涂布于篩選培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)2 d。觀察菌落的生長(zhǎng)狀況和培養(yǎng)基顏色變化。若菌落周?chē)兒冢瑒t說(shuō)明該菌能產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶，產(chǎn)酶菌株純化保藏。篩選實(shí)驗(yàn)室原有益生菌菌株，保藏顯黑菌株。

1.3.2 β-葡萄糖苷酶的酶活測(cè)定

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

稱(chēng)取對(duì)硝基苯酚13.9 mg溶于100 mL的蒸餾水里，分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于10 mL的容量瓶中，用1 mol/L Na2CO3溶液定容后混勻，以蒸餾水為對(duì)照，于400 nm處測(cè)定吸光值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)方程：Y=16.68X+0.022 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。

1.3.2.2 酶活性的測(cè)定

采用pNPG(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside)法測(cè)定β-葡萄糖苷酶的酶活[11]。將培養(yǎng)5 d的細(xì)胞培養(yǎng)液置于滅菌的EP管中，于8 000 g，4 ℃離心10 min，收集上清液。取上清液100 μL，加入200 μL的5 mmol/LpNPG(溶于pH 5.0檸檬酸鈉-磷酸氫二鈉緩存液中，P-C緩沖液)混勻，50 ℃反應(yīng)30 min，立即加入2 mL的1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，于400 nm下測(cè)定吸光值。酶活定義：每分鐘釋放1 μmol/L的對(duì)硝基苯酚所需要的酶量。酶活計(jì)算公式為:

(1)

式中：C，對(duì)硝基苯酚濃度，mmol/L；V，反應(yīng)體系的體積，mL；N，稀釋倍數(shù)；t，反應(yīng)時(shí)間，min；v，取上清液的體積，mL。

1.3.3 篩選高轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1的菌株

將1.3.1篩選菌株接種于40 mL 的種子培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h，轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，加入20 mg過(guò)濾除菌的人參皂苷Rb1，發(fā)酵96 h。然后，用水飽和的正丁醇萃取發(fā)酵液3次，每次加入水飽和正丁醇后先靜置12 h,再用超聲萃取1 h，再用分液漏斗分離，取上層的正丁醇，減壓蒸干，甲醇復(fù)溶，過(guò)濾待測(cè)。

1.3.4 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的檢測(cè)

1)薄層色譜法(thinlayer chromatograph,TLC)半定性測(cè)定人參皂苷[12]。用微孔進(jìn)樣器吸取5 μL的1.3.2中制備的待測(cè)樣品，在活化好的硅膠板上劃線(xiàn)、點(diǎn)樣，展開(kāi)，揮干溶劑，噴灑上10%的硫酸乙醇溶液，在105 ℃的烘箱中加熱5 min顯色。根據(jù)樣品遷移率和顏色的深淺初步判斷人參皂苷的濃度和種類(lèi)。

2)高效液相色譜法定量測(cè)定人參皂苷。配置濃度分別是0.25、0.5、1、1.5、2 mg/mL的人參皂苷Rd的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到標(biāo)準(zhǔn)方程：峰面積=1 868.818 02×Amt+34.972 551，RES=2.628%，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 48。色譜設(shè)備與條件：GP-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量15 μL；流速1 mL/min；流動(dòng)相水(A)-乙腈(B)；梯度洗脫：0～30 min 30%B，30～45 min 55%B，45～60 min 70%B；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm。人參皂苷Rd的生物轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式：

(2)

Rb1的摩爾質(zhì)量為1 108.6；Rd的摩爾質(zhì)量為946.6。

1.3.5 高轉(zhuǎn)化率的菌種鑒定

18S rDNA序列分析使用溶菌酶，破壁并提取DNA。以ITS1、ITS4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系ExTaq(5 U/μL)0.25 μL，buffer 5 μL，dNTP mixture 各2.5 μL，ITS1 1 μL，ITS4 1 μL，加入ddH2O至50 μL。RCR條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，54.2 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30次循環(huán)；修復(fù)延伸，72 ℃ 5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物有限公司測(cè)序。把測(cè)取序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.3.6 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

以糖度為5°P的麥汁液體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，加入蔗糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、可溶性淀粉等碳源，添加量分別為5、10、15 g/L；加入(NH4)2SO4、NH4Cl、黃豆粉、玉米漿、胰蛋白胨、酵母粉等氮源，添加量分別為質(zhì)量濃度5、10、15 g/L；加入Cu2+、Mn2+、K+、Ca2+、Fe3+、Zn2+、Mg2+、Na+等金屬離子，添加量分別為1、1.5、2 g/L；測(cè)定人參皂苷Rd的產(chǎn)量。在麥汁液體培養(yǎng)基中加入吐溫-20、吐溫-80、曲拉通、蘆丁等，添加量分別為0.5、1、1.5 g/L，測(cè)定人參皂苷Rd的產(chǎn)量。人參皂苷Rb1底物添加量為1.25 mg/mL。以糖度為5°P的麥汁培養(yǎng)基直接發(fā)酵測(cè)得人參皂苷Rd的產(chǎn)量是0.549 317 5 mg/mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株篩選

微生物轉(zhuǎn)化人參皂苷依靠的是一種或者多種酶，研究發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶是其中的關(guān)鍵酶。β-葡萄糖苷酶酶活高的菌株，人參皂苷的轉(zhuǎn)化率一般較高；酶活低的菌株，人參皂苷轉(zhuǎn)化率較低。篩選出72株有黑色圈的菌株，并測(cè)定這72株菌株的β-葡萄糖苷酶的酶活，圖1顯示其中6株酶活較高的菌株。并對(duì)這6株菌種進(jìn)行轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1的研究。對(duì)這6株分別命名為ZB0302、ZB0304、ZB0305、ZB0307、ZB0316、ZB0317。

圖1 篩選出的菌株β-葡萄糖苷酶酶活Fig.1 Enzyme activity of β-glucosidase in strains screened

2.2 高轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1菌株的篩選

2.2.1 TLC薄層色譜法分析產(chǎn)物

薄層色譜是一種準(zhǔn)確高效的鑒定產(chǎn)物的方法，可用于快速鑒定轉(zhuǎn)化菌株的產(chǎn)物。將2.1篩選的菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示。

2-菌株ZB0302；3-菌株ZB0304；4-菌株ZB0305；5-菌株ZB0307；6-Rd標(biāo)準(zhǔn)品；16-菌株ZB0316；17-菌株ZB0317；CK-人參皂苷Compound K標(biāo)準(zhǔn)品圖2 菌株對(duì)人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化的TLC法分析結(jié)果Fig.2 TLC analysis of bioconversion of ginsenosides Rb1 by strains screened

菌株ZB0302、菌株ZB0304、菌株ZB0305和菌株ZB0307能夠?qū)l(fā)酵液中底物人參皂苷Rb1化為人參皂苷Rd，菌株ZB0316和ZB0317能夠?qū)l(fā)酵液中底物人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為人參皂苷Compound K等其他皂苷。

2.2.2 HPLC高效液相色譜法分析產(chǎn)物

以β-葡萄糖苷酶較高6株菌轉(zhuǎn)化底物人參皂苷Rb1，測(cè)定發(fā)酵液中產(chǎn)物人參皂苷Rd的含量。結(jié)果如圖3所示，菌株ZB0304的人參皂苷轉(zhuǎn)化率最大，為97.234 2%。選取ZB0304菌株繼續(xù)研究。

圖3 菌株對(duì)人參皂苷Rb1的生物轉(zhuǎn)化率Fig.3 Bioconversion ratio of ginsenoside Rb1 by strains screened

2.3 菌種鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)觀察

如圖4所示,菌株ZB0304，菌落表面不光滑，邊緣不齊,邊緣有鋸齒狀，中間較厚邊緣較薄。經(jīng)過(guò)鏡檢，初步判斷為酵母菌。

圖4 人參皂苷Rd轉(zhuǎn)化率最高的菌株ZB0304Fig.4 Strain ZB0304 with the highest bioconversion ratio of ginsenoside Rd

2.3.2 菌株18S rDNA序列分析

通過(guò)18S rDNA序列分析菌株，經(jīng)過(guò)上海生工測(cè)序獲取了一個(gè)大小為630bp左右的序列。將這個(gè)序列放入GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)，選取同源性較高的菌株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，見(jiàn)圖5。該菌株和Saccharomycopsisfibuligera2232最相似，達(dá)到92%，結(jié)合顯微鏡觀察和菌落形態(tài)大小，得出結(jié)論：該菌株屬于Saccharomycopsisfibuligera。

圖5 菌株ZB0304的進(jìn)化圖Fig.5 Phylogenetic tree strain ZB0304

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.4.1 碳源對(duì)菌株轉(zhuǎn)化人參皂苷的影響

碳源對(duì)菌株轉(zhuǎn)化人參皂苷Rd和β-葡萄糖苷酶酶活的影響結(jié)果如圖6所示。在不同種類(lèi)的碳源下，對(duì)酶活和轉(zhuǎn)化產(chǎn)量的影響是不同的，同時(shí)，相同碳源不同添加量，對(duì)酶活和轉(zhuǎn)化產(chǎn)量的影響也是不同的。在基本培養(yǎng)基中加入碳源，都會(huì)增加Rd的產(chǎn)量，其中添加量為15 g/L的乳糖促使該菌株產(chǎn)酶活性和人參皂苷Rd的產(chǎn)量最大。因此選取乳糖為碳源進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。乳糖可能會(huì)促進(jìn)菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶[13]，進(jìn)而使人參皂苷Rd的產(chǎn)量提高。

圖6 不同碳源對(duì)人參皂苷Rd產(chǎn)量和β-葡萄糖苷酶酶活的影響Fig.6 Effect of different carbon sources on the production of ginsenoside Rd and β-glucosidase enzyme activity

2.4.2 氮源對(duì)菌株轉(zhuǎn)化人參皂苷的影響

氮源對(duì)菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶和對(duì)人參皂苷Rd的產(chǎn)量影響結(jié)果如圖7所示，不同種類(lèi)的氮源和不同濃度的氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶和人參皂苷Rd的產(chǎn)量不同。有機(jī)氮源對(duì)人參皂苷Rd的產(chǎn)量有促進(jìn)作用，其中，添加量為15 g/L玉米漿對(duì)β-葡萄糖苷酶和人參皂苷Rd產(chǎn)量的促進(jìn)作用最大。因此，選取玉米漿為氮源進(jìn)行后續(xù)研究。玉米漿促進(jìn)產(chǎn)酶和提高產(chǎn)量，可能是因?yàn)槠浜写罅康木S生素和其他微量元素。

圖7 不同氮源對(duì)人參皂苷Rd產(chǎn)量和β-葡萄糖苷酶酶活的影響Fig.7 Effect of different nitrogen source on the production of ginsenoside Rd and β-glucosidase enzyme activity

2.4.3 金屬離子對(duì)菌株轉(zhuǎn)化人參皂苷的影響

金屬離子對(duì)菌株產(chǎn)酶和轉(zhuǎn)化人參皂苷Rd的影響結(jié)果如圖8所示，不同金屬離子和不同添加量對(duì)產(chǎn)酶和人參皂苷Rd產(chǎn)量的影響均不同。其中，Cu2+抑制菌株產(chǎn)酶，而添加量為15 g/L的Ca2+對(duì)菌株產(chǎn)酶和人參皂苷Rd的產(chǎn)量有促進(jìn)作用且促進(jìn)作用最大。因此，在發(fā)酵液中添加適量的Ca2+會(huì)促進(jìn)產(chǎn)酶和人參皂苷Rd的轉(zhuǎn)化。

圖8 不同金屬離子對(duì)人參皂苷Rd產(chǎn)量和β-葡萄糖苷酶酶活的影響Fig.8 Effect of different metal ion on the production of ginsenoside Rd and β-glucosidase enzyme activity

2.4.4 誘導(dǎo)劑對(duì)菌株轉(zhuǎn)化人參皂苷的影響

誘導(dǎo)劑吐溫-20、吐溫-80、曲拉通對(duì)人參皂苷轉(zhuǎn)化情況和酶活性沒(méi)有顯著的影響，但是不同添加量的蘆丁對(duì)人參皂苷的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的影響很大，如圖9所示，在蘆丁添加量為0.1 mg的時(shí)候，CK(Compound K)的含量明顯多，它能促使人參皂苷Rd向人參皂苷CK的轉(zhuǎn)化，提高人參皂苷CK的產(chǎn)量。因此，發(fā)酵液中添加適量的蘆丁可作后續(xù)研究。

(a)人參皂苷CK標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜；(b)蘆丁添加量為0.1mg的HPLC圖譜；(c)蘆丁添加量為0.05mg的HPLC圖譜，(d)蘆丁添加量為0.025mg的HPLC圖譜圖9 HPLC法分析蘆丁對(duì)人參皂苷CK的影響Fig.9 Effect of rutinon ginsenoside CK by HPLC

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)含七葉苷檸檬酸鐵的平板顯色篩選出72株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株，測(cè)定酶活，選酶活較高的6株菌株，進(jìn)行人參皂苷Rb1的轉(zhuǎn)化研究，最終確定1株轉(zhuǎn)化率較高的菌株ZB0304，經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和18S rDNA基因序列分析，鑒定為Saccharomycopsisfibuligera。發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，以乳糖為碳源，玉米粉為氮源，Ca2+作為金屬離子添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，會(huì)促進(jìn)人參皂苷Rd的產(chǎn)量和β-葡萄糖苷酶酶活的提高。誘導(dǎo)劑蘆丁能夠促進(jìn)人參皂苷Rd進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其他皂苷。

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Isolation of high-conversion ginsenoside strain and optimization of fermentation medium

FANG Lei ,CHEN Hong, YU Xiao-bin

(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, JiangnanUniversity, Wuxi 214122,China)

Strains producing β-glucosidase were isolated by solid medium containing esculin and ferric. Then six strains having high β-glucosidase activity were selected withp-nitropheny l-β-D-glucopyranoside as substrate. Strain having high ginsenoside bioconversion was finally chosen with Rb1 as substrate and converted products were determined by TLC and HPLC. β-glucosidase activity of this strain was 0.803 U/mL and ginsenoside Rd conversation rate was 97.234 2%. The selected strain was identified asSaccharomycopsisfibuligerabased on the morphology and nucleotide sequence analysis of the 18S rDNA. Fermentation medium was optimized to contain lactose as carbon source and corn flour as nitrogen source, and Ca2+as metal ion. Finally inducer was optimized to promote the ginsenoside bioconversion. Results indicated that inducer had little impact on the bioconversion but rutin, a kind of inducer, could promote the bioconversion of Rd to CK. The selected strain with high ginsenoside bioconversion had good potential application.

ginsenoside; β-glucosidase; yeast; identification; optimation

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201704023

碩士研究生(余曉斌教授為通訊作者，E-mail:xbyu@jiangnan.edu.cn)。

江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(SJLX15_0546)

2016-10-08，改回日期：2016-11-29