橙皮苷對IgA腎病大鼠腎臟組織中PAI-1蛋白表達(dá)的影響

何 偉，陳明喆,2*

(1.鄂東集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院，湖北 黃石 435000； 2. 湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 黃石 435000）

橙皮苷對IgA腎病大鼠腎臟組織中PAI-1蛋白表達(dá)的影響

何 偉1，陳明喆1,2*

(1.鄂東集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院，湖北 黃石 435000； 2. 湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 黃石 435000）

目的 探討橙皮苷對IgA腎病大鼠纖溶酶原激活物抑制物（PAI-1）表達(dá)的影響。方法 60只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為正常組，模型組和橙皮苷治療組，每組20只，模型建立成功后給予相應(yīng)藥物治療，于治療4、8周后處死大鼠各半，檢測血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN），腎臟病理學(xué)，同時(shí)半定量PCR和Western Blot測定PAI-1蛋白和mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 造模期間模型組、治療組與正常組相比，大鼠第6周末開始出現(xiàn)鏡下血尿（P ＜0.05），橙皮苷治療后，有一定下降（P ＜0.05）；與正常組相比，模型組血清24 h UP、Scr、BUN、IL-2和PAF明顯升高（P ＜0.05），治療組治療4周后明顯下降（P ＜0.05），治療8周后進(jìn)一步降低；PLT和PT在治療前后沒有明顯變化；與正常組相比，模型組APTT明顯降低（P ＜0.05），治療4周后明顯升高（P ＜0.05），治療8周后進(jìn)一步升高；光鏡下正常組大鼠腎小球形態(tài)正常，模型組腎小球系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)中重度增生，橙皮苷治療后腎小球系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)增生得到明顯緩解；與正常組相比，模型組PAI-1蛋白和mRNA表達(dá)明顯降低，橙皮苷治療4周后明顯升高（P ＜0.05），治療8周后基本和治療4周后一致。結(jié)論 橙皮苷可明顯減少血尿、減輕病理改變，改善腎功能，其機(jī)制可能是橙皮苷通過增加PAI-1的產(chǎn)生而發(fā)揮作用的。

IgA 腎病； 橙皮苷； 纖溶酶原激活物抑制物

IgA腎病是原發(fā)性腎小球疾病中最為常見的一種，本病臨床中主要特點(diǎn)為免疫復(fù)合物沉積于肝臟，導(dǎo)致不易排出有毒物質(zhì)[1-2]。橙皮苷是從橙皮中提取的一類化合物，目前已有研究[3]用其治療糖尿病腎病的報(bào)道，但將其用于IgA腎病的研究還沒有文獻(xiàn)報(bào)道。本次研究筆者采用口服牛血清白蛋白、尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素 B以及皮下注射四氯化碳的復(fù)合方法制造IgAN大鼠模型，觀察橙皮苷對其是否有治療作用，并分析其治療的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 60只清潔級雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～200 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供，大鼠在購買后飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)間，每日日照和光照時(shí)間共為12 h。

1.1.2 試劑 橙皮苷購于湖北天合化工有限公司；葡萄球菌腸毒素和牛血清白蛋白購于美國Sigma公司；蓖麻油購于湖南爾康制藥公司；四氯化碳購于中國國藥公司；大鼠IL-2和PAF Elisa試劑盒購于武漢biosweap公司；ECL發(fā)光試劑盒、PVDF膜、多克隆抗體PAI-1以及單克隆抗體b-actin購于美國Santa cruz公司；相應(yīng)二抗購于北京中衫金橋公司。組織蛋白裂解液、組織蛋白提取試劑盒以及BCA蛋白定量試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與模型制作 大鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后隨機(jī)分為正常組、模型組以及橙皮苷治療組，每組20只。造模方法參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行:1)采用隔日血清白蛋白給予大鼠灌胃6周，每周灌胃400 mg/持續(xù)6周；2)大鼠每周注射1次0.5 m L蓖麻油和0.1 mL四氯化碳，共9周，分別于第6、8周給予大鼠脂多糖0.05 mg尾靜脈注射；10周后觀察大鼠是否造模成功。造模成功后，橙皮苷治療組給予橙皮苷灌胃，灌胃量10 mg/（kg.d），模型組和正常組給予生理鹽水1 m L/（kg.d）灌胃參照，分別于4、8周后處死大鼠各半。

1.2.2 標(biāo)本收集 1）尿液收集: 分別于造模6、10周，治療4、8周后將大鼠置于鼠代謝籠中收集24 h尿液，在收集尿液過程中由其自由飲食。2）血液收集：分別于治療4、8周后，用戊巴比妥麻醉大鼠，大鼠麻醉后固定于固定板上，沿其腹中線切開腹部皮膚，暴露腹腔，之后切開胸腔膜找到心臟后，用注射器沿大鼠心尖處抽取血液，血液收集后，4 000 r/min離心，后將血清置于- 80 ℃超低溫冰箱保存。3）腎臟收集：血液收集后立即分離腎臟，將腎臟組織周圍結(jié)締組織剝離后，統(tǒng)一切左腎約1/4置于中性福爾馬林溶液中保存用于檢測腎臟病理學(xué)改變，腎臟其余組織置于- 80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2.3 腎組織病理學(xué)檢查 將中性福爾馬林溶液中的腎臟組織取出，取出后用梯度乙醇脫水、脫水后用二甲苯透明并浸蠟，之后包埋、切片，最后行HE染色完成。

1.2.4 指標(biāo)學(xué)檢查方法 1)尿液檢測：大鼠24 h蛋白尿定量的測定采用磺柳酸一硫酸鈉比濁法；尿中紅細(xì)胞定量采用尿沉渣計(jì)數(shù)法檢測法。2)血液腎功能和高凝狀態(tài)指標(biāo)檢測：血清收集后交由黃石市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科完成。3)血清中IL-2和PAF的測定嚴(yán)格按照試劑盒進(jìn)行，測試方法為雙抗體夾心法。

1.2.5 腎組織PAI-1 mRNA的檢測 采用半定量RTPCR法進(jìn)行，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 PAI-1蛋白表達(dá)的檢測 采用Western Blot法進(jìn)行，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)學(xué)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，組間比較采用單因素方差分析，2組間比較采用LSD檢驗(yàn)，P ＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 正常組大鼠飲食和飲水均完全正常，同時(shí)精神良好，活潑好動，毛發(fā)有明顯光澤，造模成功后，模型組和橙皮苷組均有不同程度的食欲降低，同時(shí)精神萎靡，毛發(fā)明顯雜亂發(fā)黃，橙皮苷治療4周后，上述癥狀均有一定的好轉(zhuǎn)，治療8周后，進(jìn)一步好轉(zhuǎn)，但和正常組比較仍有一定的差異。

2.2 尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 見表1。

表1 治療4、8周后大鼠腎功能基本指標(biāo)評價(jià)尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(x±s，n=20）

2.3 腎功能相關(guān)指標(biāo)比較 見表2。

2.4 大鼠高凝狀態(tài)指標(biāo)比較 見表3。

2.5 血清IL-2和PAF的測定比較 見表4。

表2 治療4、8周后大鼠腎功能基本指標(biāo)評價(jià)(x±s，n=20）

表3 治療4、8周后各組大鼠高凝狀態(tài)指標(biāo)學(xué)統(tǒng)計(jì)(sx±，n=20）

表4 治療4、8周后大鼠血清中IL-2以及PAF含量變化(sx±，n=20）

2.6 HE染色 HE染色可見，正常組大鼠細(xì)胞形態(tài)正常，同時(shí)細(xì)胞系膜沒有增生，而模型組腎則有明顯的腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)增生，同時(shí)細(xì)胞間有纖維化的存在，治療組治療后，其腎小球系膜增生反應(yīng)有明顯改善，但是較正常組仍然差異較大。

2.7 腎臟組織中PAI-1蛋白和mRNA表達(dá) 見表5。

表5 治療4、8周后大鼠腎臟組織中PAI-1蛋白和mRNA相對表達(dá)量(sx±，n=20）

3 小結(jié)

研究[5-9]表明，腎組織纖溶酶原激活物（PA）和其抑制物（PAI-1）蛋白與凝血系統(tǒng)障礙密切相關(guān)，其可能在IgA腎病和其他相關(guān)腎小球疾病中發(fā)揮著重要的作用[10]。雖然PA在腎臟細(xì)胞中分泌較多，但體內(nèi)有一種抑制物可與其結(jié)合，造成PA失活，在所有的抑制物中以PAI-1 的作用最為突出[11-12]。研究[13]顯示，當(dāng)IgA腎病發(fā)生后，腎小球中PAI-1的表達(dá)會明顯降低，這種降低造成了PA活性的增加，最終造成了血尿的發(fā)生。

研究[14-15]顯示，橙皮苷對維持患者的滲透壓、增強(qiáng)毛細(xì)血管的韌性、降低膽固醇以及糖尿病和心腦血管的輔助治療方面也具有很好的療效。本次研究采用橙皮苷治療IgA腎病大鼠，結(jié)果顯示：橙皮苷可明顯減少IgA腎病大鼠血尿、減輕腎臟病理改變，改善其腎功能，其機(jī)制可能與其可以增加PAI-1的分泌有關(guān)。

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Effect study of hesperidin to PAI-1 protein expression of IgA nephropathy rats

HE Wei1, CHEN M ingzhe1,2*
(1.The Geriatrics Department of Huangshi Central Hospital, Huangshi 435000, Hubei Province, China ; 2 . Hubei Polytechnic University Affi liated Hospital, Huangshi 435000, Hubei Province, China )

Objective To investigate the effects of hesperidin to fi brinolytic enzyme original activators inhibitor (PAI-1) protein expression in IgA nephropathy of rats.Methods 60 male SD rats were random ly divided into the normal group, model group and hesperidin treatment group, each group were 20. After successful establishment of the model, the corresponding drugs were given. Half of the rats were sacrifi ced at 4 and 8 weeks after treatment, and to detected the serum creatinine (Scr), urea nitrogen (BUN), kidney pathology exam ination, using RT-PCR and Western Blot to detected the PAI-1 protein and mRNA expression.Results During the period of building models, model group and hesperidin treatment group compared w ith normal group rats began to appear m icroscopic haematuria from 6 week (P<0.05), after hesperidin treatment, which have a certain degree decreased (P<0.05); Compared w ith normal group, 24 hUP, Scr, BUN, IL-2 and PAF levels were increased signifi cantly in model group (P<0.05), after 4 weeks treatment significantly decreased (P<0.05), after 8 weeks treatment further reduce; PLT and PT did notchange signifi cantly before and after the treatment; Compared w ith normal group, APTT was signifi cantly decrease in model group (P<0.05), after 4 weeks treatment it was signifi cantly increased (P<0.05), after 8 weeks treatment it was further increase; Under light m icroscope, glomerular morphology of normal rats was normal, and mesangial cells and mesangial matrix of the model group had moderate and severe hyperplasia, the proliferation of glomerular mesangial cells and mesangial matrix was relieved after treatment w ith hesperidin; Compared w ith the normal group, the expression of PAI-1 protein and mRNA in the model group was signifi cantly reduced, and the level was signifi cantly increased after 4 weeks of treatment (P<0.05), A fter 8 weeks of treatment, the effect was consistent w ith the effect after treatment for 4 weeks.Conclusion: Hesperidin can obviously reduce the hematuria and alleviate pathological changes, improve renal function, the mechanism may be related w ith increase production of PAI-1.

IgA nephropathy; hesperidin; Fibrinolytic enzyme original activators inhibitor

R285.5

A

2095-6258（2017）03-0355-03

2016-05-01）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.03.004

云南省衛(wèi)生廳立項(xiàng)，黃石市中心醫(yī)院自籌項(xiàng)目“橙皮苷對IgA腎病大鼠的作用研究”（2014HS023）。

何 偉（1981-），男，碩士研究生，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療腎病的研究。

*通信作者：陳明喆，女，碩士,電話 -13669046312，電子信箱- kunhua6631@126.com