甲基戊糖梭菌膜整合焦磷酸酶提高轉基因煙草的抗旱性

劉延娟 楊玉梅 劉嫻 高艷秀 袁航 龔明 鄒竹榮

（云南師范大學生命科學學院 云南省生物質能源和環境生物技術重點實驗室 教育部生物質能源持續發展和應用工程研究中心，昆明 650500）

甲基戊糖梭菌膜整合焦磷酸酶提高轉基因煙草的抗旱性

劉延娟 楊玉梅 劉嫻 高艷秀 袁航 龔明 鄒竹榮

（云南師范大學生命科學學院 云南省生物質能源和環境生物技術重點實驗室 教育部生物質能源持續發展和應用工程研究中心，昆明 650500）

由焦磷酸（PPi）驅動的膜整合焦磷酸酶（PPase）在生物適應逆境方面可能起著重要作用，包括H+-PPase、Na+-PPase和Na+，H+-PPase三個亞家族。相比于H+-PPase，其它兩個亞家族PPase近年來才在原核生物（特別是動物腸道菌）中被發現，有關它們的應用研究更是匱乏。通過兩輪巢式PCR從人腸道宏基因組中擴增得到甲基戊糖梭菌膜整合焦磷酸酶（CmPP）全長基因。序列分析表明該基因含有一個完整的ORF（長2 100 bp，編碼一個699 aa的蛋白質，G+C含量為59.9 %，堿基分布均衡）。膜拓撲學結構預測CmPP是一個由16個跨膜α螺旋組成的膜蛋白，與目前已鑒定過的膜PPase跨膜結構相符。序列比對分析推測CmPP屬于K+依賴型Na+，H+-PPase亞家族成員。另外，通過農桿菌轉化獲得了CmPP轉基因煙草。對其子一代植株的抗旱分析發現，在干旱脅迫條件下CmPP轉基因株系的干物質含量、總葉綠素含量和根系活力均下降，而其葉片MDA含量和電解質滲透率均升高，但相同脅迫下的變化程度都顯著低于野生型煙草。這些結果表明CmPP基因的導入能夠有效提高煙草的抗旱能力。

甲基戊糖梭菌；膜整合焦磷酸酶；基因克隆；轉基因煙草；抗旱性

地球早期生命和逆境條件下的現世生物似乎依賴焦磷酸（PPi）而不是腺苷三磷酸（ATP）作為主要能源來維持生存。其中，由PPi驅動的膜整合焦磷酸酶（PPase）可能作為主要的H+、Na+泵產生跨膜電化學離子梯度，推動ATP生成、物質運輸以及其它相關的生物學過程［1-3］。根據被轉運離子（Na+、H+或兩者）的特異性，膜PPase可分為3個同源亞家族Na+-PPase、H+-PPase、Na+，H+-PPase。系統發生分析顯示H+-PPase和Na+，H+-PPase是由其共同前身Na+-PPase獨立進化形成［1］。所有膜PPase都形成一個同源二聚體功能形式，并在膜拓撲結構（16-17個跨膜α螺旋）和關鍵氨基酸殘基上具有高度的保守性［1，4］。另外，根據某個特定位置的氨基酸殘基是Ala或Lys，膜PPase還可分為K+依賴型或K+非依賴型［5］。

具有H+泵活性的膜H+-PPase廣泛存在于包括古生菌、真細菌、植物和原生動物在內的生物三界中，發現最早和研究得最多，特別是近十幾年來在構建抗逆生物尤其是植物方面的應用已十分矚目［3，6，7］。過表達同源或異源H+-PPase的各種轉基因植物在諸多逆境條件（如高鹽、干旱、氮磷鉀營養虧缺、重金屬污染等）下都表現出增強的抗性或耐受性［8-13］。相比較，其它兩個亞家族PPase（Na+-PPase和Na+，H+-PPase）最近幾年才僅在原核生物（主要是一些高鹽、缺氧等極端環境下的古生菌和細菌，難以分離培養）中發現［14，15］，而且宏基因組分析顯示人腸道許多厭氧微生物中含有Na+，H+-PPase和/或Na+-PPase基因（其中一些已得到鑒定）［15］，這不僅深度暗示出它們對原始生物體應對早期地化環境（當世還有遺存）的重要性，同時也反映出H+-PPase對現世植物適應逆境的關鍵作用。對它們的生化研究表明這兩者都具有Na+泵活性，Na+，H+-PPase和低Na+條件下的Na+-PPase還具有H+泵活性［15，16］。不過，目前還沒有任何關于它們用于提高植物抗逆性的研究報道。

本研究選定甲基戊糖梭菌的膜整合PPase（CmPP，推測是Na+，H+-PPase亞家族成員）［15］，通過PCR直接從人腸道宏基因組中克隆其基因，并對其轉基因煙草進行抗旱分析，以檢驗它在植物中的抗逆作用。

1 材料與方法

表1 本研究中所用引物

1.1 材料

大腸桿菌菌株DH5α、農桿菌菌株LBA4404以及載體pET32a（+）、pBI121均為本實驗室保存。限制性內切酶（Nde I、Sac I、Nco I、EcoR V和Sma I）、T4 DNA連接酶、DreamTaq 和Pfu DNA聚合酶購自Thermo Scientific公司；糞便基因組、質粒和植物基因組DNA提取試劑盒以及DNA凝膠純化試劑盒購自北京Tiangen公司；PCR mix、DNA分子量標準為北京Transgene公司產品；其它生化試劑均為國產分析純。引物（表1）合成和DNA測序均由北京華大基因公司完成。

1.2 方法

1.2.1 CmPP的基因克隆 根據NCBI GenBank中已有的甲基戊糖梭菌菌株DSM 5476重疊群（contig C_methylpentosum-1.0.1_Cont6.6） 序 列（ 登 錄 號ACEC01000124），設計兩對引物（CmPP-Fw/CmPP-Rv、CmPP-5Nd/CmPP-3Sc），從人腸道中擴增和克隆甲基戊糖梭菌膜整合焦磷酸酶基因CmPP。參照Tiangen公司的糞便基因組DNA提取試劑盒說明書提取新鮮糞便的宏基因組DNA。取1 μL作模板，使用引物CmPP-Fw和CmPP-Rv和DreamTaq DNA聚合酶進行第一輪PCR，程序為：95℃ 5 min；（94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 2 min）×30；72℃ 10 min。 然后，直接取0.5 μL第一輪PCR產物作模板，使用引物CmPP-5Nd和CmPP-3Sc和DreamTaq DNA聚合酶進行第二輪PCR，程序為：95℃ 5 min；（94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 2.5 min）×1；（94℃ 30 s，58℃30 s，72℃ 2.5 min）×30；72℃ 10 min。CmPP PCR產物純化后先用酶Nco I和EcoR V進行鑒定，然后用Nde I和Sac I雙酶切，再與經同樣雙酶切的載體pET32a（+）片段連接，構建成其大腸桿菌表達載體pET（CmPP）。重組克隆用CmPP基因本身上下游引物CmPP-5Nd、CmPP-3Sc通過菌落PCR鑒定，并使用載體上靶基因兩側的T7啟動子通用引物和T7終止子下游引物Tt7Dw-Rv進行雙向測序。

1.2.2 CmPP的生物信息學分析 DNA和蛋白質序列分析采用Vector NTI 11.0 軟件。蛋白質跨膜拓撲結構預測采用在線程序TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM）。DNA和蛋白質的序列比對在NCBI網絡服務器（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）上進行。

1.2.3 CmPP的植物表達載體構建及其煙草遺傳轉化 以質粒pET（CmPP）DNA為模板，利用高保真的Pfu DNA 聚合酶和引物CmPP-5Sm、Tt7Dw-Rv將CmPP基因重新擴增出來。目的PCR片段經純化后通過Sac I酶切，然后與經Sma I、Sac I雙酶切的載體pBI121大片段連接，構建成其植物表達載體pBI（CmPP）。重組克隆用載體上游引物35SPro-Fw和CmPP基因下游引物CmPP-3Sc通過菌落PCR鑒定。載體pBI（CmPP）通過凍融法轉化農桿菌LBA4404，轉化菌落通過PCR鑒定（使用引物35SPro-Fw、CmPP-3Sc）。然后，按照常規的農桿菌葉盤侵染法轉化煙草。使用試劑盒提取CmPP轉化再生煙草植株的基因組總DNA，然后以其為模板通過兩對交叉引物（35SPro-Fw/CmPP-mRv、CmPP-mFw/NosTer-Rv）進行PCR鑒定，得到CmPP的陽性轉基因煙草植株。

1.2.4 CmPP轉基因煙草植株的抗旱性分析 選取長勢一致的煙草幼苗（包括CmPP轉基因株系和野生型），停止澆水5 d后，進行干旱處理：對照（正常澆水）、中度干旱脅迫（土壤含水量為其最大持水量的40%，即40% FWC）、重度干旱脅迫（20% FWC），每天監測土壤含水量，并采用定量灌溉維持各干旱處理的持水量水平。每個處理設兩個重復，植株生長30 d后取樣測定以下指標：（1）將處理苗洗凈晾干后分開根、莖、葉，稱取各部分重量即為鮮重（FW），然后將各部分在115℃烘箱內殺青15 min后于70℃烘至恒重，稱取各部分重量即為干重（DW），并因此計算出各部分的干重比（%）。（2）參考王學奎［17］的方法測定處理苗的葉片總葉綠素含量（mg·g-1DW）和根系活力（mg·g-1·h-1DW）。（3）分別采用硫代巴比妥酸（TBA）法和電導儀法測定處理苗的葉片丙二醛（MDA）含量（μmol·g-1DW）和電解質滲透率（%）［17］。數據統計分析采用軟件SPSS 11.5，作圖采用軟件SigmaPlot 12.0。

2 結果

2.1 CmPP的基因克隆

以新鮮糞便中提取的人腸道宏基因組總DNA作為模板，經第一輪PCR擴增后，沒有檢測到預期大小（約2.3 kb）的目的PCR條帶，但有非特異性較小片段。直接取第一輪PCR產物0.5 μL作模板進行第二輪PCR（巢式擴增），發現有明亮的、大小正確（約2.1 kb）的目的基因擴增產物CmPP。而且，CmPP的 PCR片段純化后分別用Nco I和EcoR V酶切鑒定，結果也與預期完全一致；接著將它通過Nde I和Sac I雙酶切克隆到載體pET32a（+）中，獲得了其陽性重組載體pET（CmPP）。

2.2 CmPP的生物信息學分析

對重組質粒pET（CmPP）進行測序，結果（圖1）表明擴增到的CmPP基因含有一個完整的、長2 100 bp的開放閱讀框（ORF），編碼一個699 aa的蛋白質（理論分子量為72.3 kD，等電點為6.14）。與GenBank數據庫已有對應序列（登錄號ACEC01000124）進行比對分析，發現擴增的CmPP基因序列有13個堿基點突變（絕大多數為T?C、A→G），但僅造成2個非關鍵氨基酸的改變（T365C→L122S、A880T→N294Y）。該基因的G+C含量為59.9 %，堿基分布較均衡。

通過在線程序TMHMM對CmPP蛋白進行膜拓撲結構預測分析，發現CmPP是一個由16個跨膜α螺旋組成的膜蛋白，其N端沒有信號肽序列，而且兩個短末端凸出在外，但背向細胞質側即外側（圖2），這與目前已經鑒定過的膜PPase的一致結構相符合［1，4］。

圖1 CmPP基因的核苷酸序列及其推導的蛋白序列

以CmPP蛋白序列為檢索序列，對NCBI中非冗余蛋白質數據庫Nr進行Blastp比對，發現跟CmPP親緣關系最近的直系同源物是與甲基戊糖梭菌共存于人腸道的厭氧柔嫩梭菌（Clostridium leptum）的膜整合焦磷酸酶（登錄號ZP_02078667），它已被鑒定為Na+，H+-PPase［15］。由此推測，CmPP很可能屬于Na+，H+-PPase亞家族成員。另外，CmPP蛋白中第474位（圖1）是對應于羧熱產氫菌（Carboxydothermus hydrogenoformans）H+-PPase第460位的Ala殘基，說明CmPP是K+依賴型膜PPase［5］。

2.3 CmPP轉基因煙草植株的獲得

CmPP基因通過引物對CmPP-5Sm/Tt7Dw-Rv從質粒pET（CmPP）模板重新擴增出來后，經酶切克隆到植物載體pBI121中，構建成其植物表達載體pBI（CmPP）。由于上游引物CmPP-5Sm中引入了翻譯增強元件——kozak序列，理論上應該可以使CmPP在其轉基因植株中得到有效表達。

通過農桿菌葉盤侵染法，對植物載體pBI（CmPP）進行了煙草轉化，并獲得了大量的再生煙草植株。通過基因組PCR對其中17株進行鑒定，發現兩對引 物（35SPro-Fw/CmPPm-Rv、CmPPm-Fw/ NosTer-Rv）的交叉鑒定結果完全一致：3號、7號、15號植株與野生型煙草一樣都沒有特異性擴增產物；而其他14株均有明亮的PCR主條帶，且大小正確：引物對35SPro-Fw/CmPPm-Rv和CmPPm-Fw/ NosTer-Rv分別能擴增出約1.2 kb（圖3-A）和1.6 kb（圖3-B）的DNA條帶。這表明17個CmPP轉化再生植株中有14個為陽性轉基因植株，CmPP農桿菌轉化煙草的陽性率達到了82%以上。

2.4 CmPP提高轉基因煙草的抗旱性

干旱會破壞植物光合系統、造成細胞膜損傷和影響根吸收能力從而抑制植物的生長發育。本研究選取了9號、11號、12號這3個CmPP轉基因煙草株系（分別命名為CmPP-9、CmPP-11、CmPP-12），對其子一代植株進行了抗旱性分析，測定其多個相關生理指標，包括干重比、總葉綠素含量、根系活力、MDA含量和電解質滲漏率。

圖2 在線程序TMHMM預測的CmPP蛋白膜拓撲結構

圖3 CmPP轉基因煙草植株的PCR鑒定

由圖4可以看出，3個CmPP轉基因株系和野生型（WT）煙草的根、莖、葉干物質含量在正常澆水（對照）條件下各自差異很小，而在干旱脅迫條件下均下降，且隨脅迫強度增加而愈加明顯，但相同脅迫條件下轉基因株系的下降程度顯著低于野生型煙草。在中度干旱（40% FWC）脅迫條件下，3個轉基因株系（CmPP-9、CmPP-11、CmPP-12）相比野生型煙草的根干重比依次高出79.3%、69.1%、70.4%，莖干重比依次高出27.4%、22.4%、16.6%，葉干重比依次高出79.3%、78.9%、70.4%；而在重度干旱（20% FWC）脅迫條件下，3個轉基因株系與野生型煙草的根、莖、葉各部分干物質含量相比對照條件下普遍下降了一半以上，但前者仍然比后者的根干重比依次高出68.3%、67.3%、58.8%，莖干重比依次高出1.2倍、1倍、98.3%，葉干重比依次高出1倍、79.8%、77.8%。

由圖5看出，3個CmPP轉基因株系和野生型（WT）煙草的總葉綠素含量和根系活力在正常澆水（對照）條件下幾無差異，而在干旱脅迫條件下均降低，且隨脅迫強度增加而愈加嚴重，但相同脅迫條件下轉基因株系的下降程度顯著低于野生型煙草。在中度干旱（40% FWC）脅迫條件下，3個轉基因株系（CmPP-9、CmPP-11、CmPP-12）相比野生型煙草的總葉綠素含量依次高出36.1%、26.2%、18.9%，根系活力依次高出29.3%、24.2%、12.1%；而在重度干旱（20% FWC）脅迫條件下，3個轉基因株系與野生型煙草的總葉綠素含量和根系活力分別下降到不及對照條件下的10%和60%，但前者仍比后者的總葉綠素含量依次高出1.4倍、1.3倍、1.1倍，根系活力依次高出84.3%、68.7%、47.1%。

由圖6可以看出，3個CmPP轉基因株系和野生型（WT）煙草的葉片MDA含量和電解質滲透率在正常澆水（對照）條件下沒有明顯差異，而在干旱脅迫條件下均升高，且隨脅迫加劇而呈增加趨勢，但相同脅迫條件下轉基因株系的升高程度顯著低于野生型煙草。在中度干旱（40% FWC）脅迫條件下，3個轉基因株系（CmPP-9、CmPP-11、CmPP-12）相比野生型煙草的MDA含量分別低出25%、18.1%、11.5%，盡管兩者的電解質滲透率接近；而在重度干旱（20% FWC）脅迫條件下，3個轉基因株系與野生型煙草的葉片MDA含量和電解質滲透率分別已升高到對照條件下的2倍和1.2倍以上，但前者仍然比后者的MDA含量依次低出28.8%、25.7%、20.2%，電解質滲透率依次低出14.5%、16.8%、7%。

另外，3個CmPP轉基因株系在中度和重度干旱脅迫條件下的生長均要好于野生型煙草，但隨干旱程度加劇受抑制越明顯；而對照（正常澆水）條件下兩者的生長狀況相似，且都好于干旱脅迫條件下（結果未顯示）。結合上面抗旱生理測定結果，可以推定CmPP能夠顯著提高其轉基因煙草植株的抗旱能力。

圖4 CmPP轉基因煙草和野生型煙草在干旱脅迫下的干物質含量比較

圖5 CmPP轉基因煙草和野生型煙草在干旱脅迫下的總葉綠素含量和根系活力比較

3 討論

膜整合PPase與生物適應逆境密切相關，其一個進化分支形成的H+-PPase亞家族在提高植物諸多抗逆性方面（如抗鹽、干旱、磷氮鉀營養缺乏、重金屬污染等）功效均十分突出［6-13］；比較其另外兩個亞家族Na+-PPase、Na+，H+-PPase由于發現較晚，研究得少，還沒有用于提高植物抗逆性的報道。

當前，各種環境生物已廣被用來挖掘新的抗逆基因［18-21］，而人或其它動物的腸道宏基因組可能是獲得Na+-PPase、Na+，H+-PPase基因的理想來源［15］。本研究選定源自甲基戊糖梭菌的膜整合PPase（CmPP），通過PCR直接從人腸道宏基因組中成功克隆到了其全長基因。生物信息學分析顯示CmPP是一個具有16個跨膜α螺旋結構并屬于K+依賴型的Na+，H+-PPase亞家族成員，具備膜PPase的保守結構特性和Na+-轉運PPase共有對K+的依賴特性［1，4］。但是，可能由于人腸道微生物的多樣性和不均一性［22，23］，擴增CmPP基因絕對需要兩輪巢式PCR才能成功，這與我們先前從水體宏基因組中擴增一藍藻基因類似［20］。另外，由于人類宏基因組具有大陸和民族特異性，并受飲食、藥物等攝入因子的影響［22］，因此本研究擴增到的CmPP基因與GenBank中的對應核苷酸序列（登錄號ACEC01000124）有一定程度的差異（但只有2個非關鍵氨基酸的改變）是可以理解的。

還有，CmPP基因的G+C含量為59.9%，堿基分布較均衡，不像許多其他類似的膜PPase基因含有高比例AT堿基和容易出現真核基因的聚腺苷化信號。這樣，不僅有利于基因擴增，而且也適合于對高等植物的轉基因研究。事實上，本研究獲得的CmPP轉基因煙草具有顯著提高的抗旱性，應該是CmPP基因導入表達發揮了作用。

干旱是影響農業生產的重要逆境因子，目前已通過遺傳、分子和生化等研究手段鑒定出許多關鍵基因，功能涉及到脅迫應答轉錄調節、RNA轉錄后修飾和蛋白翻譯后修飾、滲透保護劑代謝、抗氧化系統、分子伴侶等方面，調控植物在形態和生理水平上對干旱的應答以及抗旱性形成［24，25］。在這些基因相關的植物抗旱遺傳工程研究中，H+-PPase占據重要一席［6-13］，目前公認由其介導的植物抗旱性與其酶活性調節液泡滲透功能以及促進生長素極性運輸和根系發育有關［7］。生化研究表明已鑒定的Na+，H+-PPase和低Na+條件下的Na+-PPase都具有H+泵活性［15，16］，而屬于Na+，H+-PPase家族的CmPP理應具有H+泵活性和與H+-PPase相似的功效。因此，本研究中CmPP基因導入促進煙草抗旱性的提高是合乎預期的。而且，我們發現CmPP也能顯著增強其轉基因煙草的抗鹽性，具備H+-PPase的同樣特性［6，8，10］，這部分結果將在另文報道。我們計劃下一步檢驗CmPP轉基因煙草是否具有提高的抗營養（氮、磷或鉀）貧瘠性。總之，本研究中得到的CmPP基因可為植物尤其是農作物抗逆基因工程研究提供一個新的功能基因選擇。

圖6 CmPP轉基因煙草和野生型煙草在干旱脅迫下的MDA含量和電解質滲透率比較

4 結論

本研究通過PCR直接從人腸道宏基因組中擴增得到甲基戊糖梭菌膜整合焦磷酸酶基因CmPP。生物信息學分析顯示該基因含有一個完整的ORF，推導蛋白CmPP（699 aa）是一個具有由16個α螺旋組成的跨膜結構、并且屬于K+依賴型的Na+，H+-PPase亞家族成員；另外，通過對其轉基因煙草植株的抗旱性分析驗證了CmPP基因具備提高植物抗旱性的潛力。

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（責任編輯 李楠）

Membrane-bound Pyrophosphatase of Clostridium methylpentosum Increases the Drought Resistance of Its Transgenic Tobacco

LIU Yan-juan YANG Yu-mei LIU Xian GAO Yan-xiu YUAN Hang GONG Ming ZOU Zhu-rong
（Engineering Research Center of Sustainable Development and Utilization of Biomass Energy，Ministry of Education；Key Laboratory of Biomass Energy and Environmental Biotechnology of Yunnan Province；School of Life Sciences，Yunnan Normal University，Kunming 650500）

Pyrophosphate（PPi）-energized membrane-bound pyrophosphatases（PPases）are composed of three subfamilies including H+-PPase，Na+-PPase and Na+，H+-PPase，and may play important roles in stress adaptation of organisms. In contrast to H+-PPase，other two PPase subfamilies were recently detected only in prokaryotes（especially animal gut microbial），certainly with scarce application researches. In this study，through two rounds of nested PCR，we amplified the full-length gene of the membrane-bound PPase of Clostridium methylpentosum（CmPP）from human gut metagenome. As indicated by sequence analysis，the CmPP gene contained an entire ORF of 2100 bp encoding a protein of 699 aa，with the G+C percentage of 59.9 % and balanced base distribution. Topological prediction showed CmPP as a multi-spanning membrane protein consisting of 16 transmembrane α-helix segments，in accordance with the membrane topological model of those known membrane PPases. Furthermore，sequence alignment analysis implicated CmPP as a K+-dependent member of Na+，H+-PPase subfamily. In addition，we obtained the CmPP transgenic tobacco plants through Agrobacterium transformation. Under drought stress conditions，the F1plants of CmPP transgenic lines had decreased values in dry matter content，total chlorophyll content and root activity，but increased values in leaf MDA content and electrolyte permeability. However，all these changes in transgenic lines were significantly lower than those in wildtype tobacco under the same stress. Conclusively，our results indicated that introduction of the CmPP gene efficiently improved the drought resistance in tobacco.

Clostridium methylpentosum；membrane-bound pyrophosphatase；gene cloning；transgenic tobacco；drought resistance

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1208

2017-01-09

國家自然科學基金項目（31160169，31460067）

劉延娟，女，碩士研究生，研究方向：植物逆境生物學；E-mail：2271937509@qq.com

鄒竹榮，男，博士，教授，研究方向：植物逆境生物學；E-mail：zouzr09@sina.com