四種芽孢桿菌對蒜薹灰葡萄孢霉抑制作用的時效性研究

魏倩張娜張平李明剛閻瑞香

（1. 國家農產品保鮮工程技術研究中心，天津市農產品采后生理與貯藏保鮮重點實驗室，天津 300384；2. 南開大學生命科學學院，天津 300071）

四種芽孢桿菌對蒜薹灰葡萄孢霉抑制作用的時效性研究

魏倩2張娜1張平1李明剛2閻瑞香1

（1. 國家農產品保鮮工程技術研究中心，天津市農產品采后生理與貯藏保鮮重點實驗室，天津 300384；2. 南開大學生命科學學院，天津 300071）

旨在對保存的4種芽孢桿菌菌株種屬水平做初步鑒定并研究其在離體條件下對蒜薹灰葡萄孢霉的抑制作用以及活體條件下對蒜薹保鮮的時效性。采用平板對峙法和菌絲生長法進行離體實驗，采用有傷接種法在不同時間段進行預防和治療活體實驗。結果表明，離體條件下，與對照相比，4種芽孢桿菌對灰葡萄孢霉菌落擴展和菌絲體生長都有顯著的抑制作用且效果HB-2＞B579＞B1＞B001（P＜0.05）。20℃活體實驗中，4種芽孢桿菌的預防處理均能較好地控制蒜薹灰葡萄孢霉病斑擴展，且效果好于治療處理，但是不同芽孢桿菌最佳的預防時間有所不同。其中，HB-2和B579預防處理能較好地保持蒜薹的可溶性固形物、維生素C以及可滴定酸含量。綜合來說，芽孢桿菌HB-2比其他3種芽孢桿菌能更有效地預防蒜薹灰霉病。

芽孢桿菌；灰葡萄孢霉；蒜薹保鮮；時效性

蒜薹即抽薹大蒜的花莖，不但營養豐富，鮮嫩可口，還含有大量具有氧化、殺菌、抗癌、抗動脈硬化的硫化物，因此深受國內外消費者的青睞［1］。目前，蒜薹是我國蔬菜冷藏業中貯藏量最大、貯藏期最長的蔬菜品種之一［2］。但由于其生產具有季節性、區域性等特點，且鮮蒜薹含水量高，采后呼吸作用旺盛，易受到老化、霉變、氣體傷害等多種原因影響而引起貯藏期蒜薹大量腐爛變質，損失率高達30%-40%，其中，致病菌的侵染是導致蒜薹貯藏過程中腐爛損失的主要原因，成為蒜薹采后保鮮工作的重點［3］。蒜薹致病菌中致病力較強的是葡萄孢屬，特別是灰葡萄孢霉，發病率為100%，造成蒜薹灰霉病［4］。貯藏過程中，控制蒜薹病害的主要手段是使用化學殺菌劑，包括可菌靈，抑菌靈，敵霉靈，多霉靈和速克靈等［5］。然而，傳統的化學保鮮劑會使病原菌產生抗藥性問題，并且使用量過大或殘留量過多也會對人體和環境產生一定的危害。因此，迫切需要開發綠色、安全的生物防治方法。

芽孢桿菌（Bacillus）是一類好氧、內生芽孢的革蘭氏陽性細菌，在自然界中廣泛存在，其營養簡單、生長快，芽孢能忍受極端的外部環境而長期存活，因此有利于生防菌劑的生產、加工及在環境中的存活、定殖與繁殖，而且批量生產工藝簡單，成本較低，施用方便，儲存期長，是一種理想的生防微生物［6，7］。目前，芽孢桿菌已在水稻、小麥、玉米、棉花、黃瓜、辣椒等農作物采前病害的防治上應用，并顯現出很好的效果［8］。同時大量的研究表明，芽孢桿菌可以控制采后水果的多種疫病，如蘋果霉心病、柑橘青霉病、油桃褐腐病、香蕉枯萎病、炭疽病、蘋果梨青霉病、黑斑病及金花梨果腐病［9］。關于芽孢桿菌對果蔬采后灰葡萄孢霉的抑制作用相關研究也很多，如草莓、葡萄、番茄的灰霉病等［10-12］。但芽孢桿菌應用于蒜薹采后病害防治及其作用時效性的研究相對較少，因此研究利用芽孢桿菌來控制蒜薹采后病害對綠色生態農業的發展具有重要意義。本研究初步鑒定保存的4種芽孢桿菌，并探究其對蒜薹灰葡萄孢霉在離體條件下的抑制作用，以及20℃活體條件下4種芽孢桿菌對灰葡萄孢霉抑制作用的時效性和對蒜薹保鮮效果的影響，從而為蒜薹灰霉病的生物防治提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 廣饒蒜薹采收（2016年5月20-25日）后運到國家農產品保鮮工程技術研究中心，置于0℃冷庫預冷，剔除有機械傷、病蟲害及細弱的蒜薹，除去薹莖上的葉鞘，以1 kg每把捆扎，用0.045 cm PVC（聚氯乙烯）硅窗袋裝好，于0±0.5℃貯藏備用。

1.1.2 供試菌株 病原菌由本試驗室從感病的蒜薹上分離獲得，經純化、回接及DNA鑒定，確定為灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）。芽孢桿菌HB-2、B001、B579由天津市植物保護研究所提供，芽孢桿菌B1為本實驗室保存菌種。

1.1.3 培養基 NA培養基：牛肉膏3 g，蛋白胨8 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.0-7.2；PDB 培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH值；PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH值。

1.2 方法

1.2.1 芽孢桿菌的分類鑒定

1.2.1.1 形態特征 將4種芽孢桿菌在NA 固體平板上30℃培養2 d，根據性狀、顏色、透明度等菌落形態進行觀察，并進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體形態進行初步鑒定［13］。

1.2.1.2 16S rDNA 序列測定及同源性比對 采用常規CTAB法［14］用DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）分別提取4種芽孢桿菌基因組DNA。選用細菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'） 和 1492R（5'-TACGGHTACCTTGTTACGACTT-3'） 擴 增16S rDNA 基因序列。PCR 反應體系（50 μL）為：模板 10×PCR buffer 5 μL、dNTP（10 mmol/L）4 μL、MgCl2（25 mmol/L）5 μL、模板5 μL、Taq DNA 聚合酶0.1 μL、引物各2 μL，ddH2O 26.9 μL。反應條件為：94℃預變性2 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環，最后72℃延伸10 min。純化后的PCR 產物送上海生工生物化學有限公司進行測序。將測序結果與GenBank 數據庫中的已知序列進行BLAST 比對分析，尋找具有較高同源性的16S rDNA 序列，并利用MEGA 5.0軟件的Neighbor-Joining進行系統發育分析，構建系統發育樹。

1.2.2 四種芽孢桿菌對灰葡萄孢霉病原菌菌落擴展的抑制作用 4種芽孢桿菌在NA培養基中活化48 h，將PDA平板上培養5 d的灰葡萄孢霉打成直徑6 mm的菌餅，接種于PDA培養皿中央，在其周圍2.5 cm處等距離放4片滅菌濾紙片（直徑為8 mm），分別滴加20 μL：（1）活菌液：芽孢桿菌菌液（2）過濾液：菌液8 000 r/min 離心10 min，上清過0.22 μm濾膜后的液體（3）熱處理液：加熱煮沸15 min后冷凍30 min滅活的菌液（4）無菌水。置于20±0.5℃條件下培養，觀察菌落發展變化并于5 d后拍照統計抑菌圈直徑。實驗重復3次。

1.2.3 四種芽孢桿菌對灰葡萄孢霉病原菌菌絲體的抑制作用 用直徑為8 mm的打孔器打取6塊灰葡萄孢霉的菌餅放入裝有50 mL PD液體培養基的150 mL的已滅菌三角瓶中，同時加入2 mL NA培養基中活化48 h的芽孢桿菌菌液，對照三角瓶中加入等量體積的無菌水，搖勻后牛皮紙密封，放入水浴振蕩器中震蕩培養（20±0.5℃，100 r/min）7 d后，將培養液用中性濾紙過濾，得到的菌絲體再用滅菌后的蒸餾水沖洗3次，然后在赤紅外水分測定儀中105℃條件下烘干至恒重。各處理設3個重復，實驗重復3次。

1.2.4 四種芽孢桿菌對灰葡萄孢霉病原菌菌絲體形態的影響 挑取平板上生長在芽孢桿菌菌株邊緣的灰葡萄孢霉菌絲和對照中正常生長的灰葡萄孢霉菌絲于OLYMPUS BX51 顯微鏡下對比觀察菌絲形態特征。

1.2.5 四種芽孢桿菌的時效性實驗 蒜薹用75%乙醇進行表面消毒，每根用無菌針刺破3個傷口。

治療處理：已消毒的蒜薹在第0 d全部接種灰葡萄孢霉菌餅，并分別于第0、1、2、3、4 d在傷口接種30 μL已活化48 h的4種芽孢桿菌，以第0 d只接種灰葡萄孢霉菌餅的蒜薹作為對照。每個處理5根蒜薹設3個重復。

預防處理：取已活化48 h的4種芽孢桿菌，在蒜薹的每個傷口加入30 μL。分別于第0、1、2、3、4 d在傷口接種灰葡萄孢霉菌餅，以第0 d只接種灰葡萄孢霉菌餅的蒜薹作為對照。每個處理5根蒜薹設3個重復。

處理后的蒜薹置于20±0.5℃下貯藏。在接種灰葡萄孢霉后第7 d、9 d、11 d、13 d、15 d測量病斑直徑，并在第15 d取各個處理的5根整根蒜薹作為一個整體，測量每個處理3個重復的蒜薹品質指標。實驗重復3次。

1.2.6 指標測試 用游標卡尺測量抑菌圈直徑和病斑大小；通過便攜式糖度計測定可溶性固形物含量；采用碘量法測定Vc含量［15］；采用NaOH滴定法測定可滴定酸含量［16］。

1.2.7 數據分析 采用SPSS 統計軟件對實驗數據進行顯著性分析，差異顯著性水平為0.05。

2 結果

圖1 四種芽孢桿菌的16S rDNA基因擴增產物電泳圖譜

2.1 四種芽孢桿菌的分類鑒定結果

2.1.1 芽孢桿菌的形態特征 形態觀察結果顯示：芽孢桿菌B579、B001在NA培養基上呈圓形，乳白色或微黃色，半透明，表面光滑濕潤稍隆起，邊緣整齊，革蘭氏染色呈陽性，菌體呈桿狀；芽孢桿菌B1和HB-2在培養基平板上呈圓形，乳白色，半透明，表面濕潤，周圍光滑，中央凸起，革蘭氏染色呈陽性，菌體呈桿狀。

2.1.2 16SrDNA 序列測定及系統發育分析 16S rDNA 純化產物的1%瓊脂糖凝膠電泳（圖1），其中大部分PCR 產物條帶清晰且單一。對4種芽孢桿菌的16S rDNA 序列相似性進行比對分析，構建系統發育樹（圖2）。菌株B579與Bacillus subtilis（EU221345.1）和Bacillus subtilis（EU221334.1）的親緣關系最近，可初步鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；菌株B001與Bacillus subtilis（KC121041.1）和Bacillus subtilis（KM365462.1）的進化距離最接近，可鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。菌株HB-2與 Bacillus amyloliquefaciens（JF899255.1） 的相似性最高，初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）；B1與 Bacillus amyloliquefaciens（JF412546.1）和Bacillus amyloliquefaciens（KJ12371-5.1）最相近，鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

圖2 基于16S rDNA的系統發育樹

圖3 四種芽孢桿菌對灰葡萄孢霉病原菌菌落擴展的抑制效果

2.2 四種芽孢桿菌對灰葡萄孢霉病原菌菌落擴展的抑制作用

離體實驗結果表明4種芽孢桿菌對灰葡萄孢霉病原菌菌落擴展均具有抑制作用（圖3）。4種芽孢桿菌都是滴加活菌液的濾紙片周圍產生明顯的透明抑菌圈，而滴加過濾液、熱處理液和無菌水的濾紙片周圍均沒有觀察到抑菌圈的產生。同時，通過對平板上灰葡萄孢霉的生長形態觀察發現，靠近抑菌圈邊緣的病原菌菌絲都出現不同程度的被抑制現象，表現如下：菌絲向上生長且扭曲成結，菌絲變粗，顏色變深變暗。而對照菌落表現為菌落邊緣生長比較規整，平鋪生長，菌絲在平板上分布均勻，無纏繞現象。4種芽孢桿菌對灰葡萄孢霉抑菌圈直徑的影響，見表1。芽孢桿菌B001、B1、HB-2、B579周圍形成的抑菌圈的直徑分別為8.967 mm、16.167 mm、31.033 mm、23.433 mm，抑菌圈直徑越大，說明芽孢桿菌對灰葡萄孢霉的抑制效果越明顯。通過顯著性差異分析表明，4種芽孢桿菌對抑制灰葡萄孢霉的菌落擴展作用顯著且效果HB-2＞B579＞B1＞B001（P＜0.05）。

表1 四種芽孢桿菌對灰葡萄孢霉病原菌菌落擴展的抑制作用

2.3 四種芽孢桿菌對灰葡萄孢霉病原菌菌絲體的抑制作用

4種芽孢桿菌對灰葡萄孢霉病原菌菌絲體生長具有一定的抑制作用，如表2所示，加入芽孢桿菌B001、B1、HB-2、B579的灰葡萄孢霉的菌絲體干重顯著小于空白對照組，對菌絲生長的抑制率分別為21.36%、37.77%、77.16%和54.70%。通過顯著性差異分析表明，4種芽孢桿菌對灰葡萄孢霉菌絲體生長的抑制作用顯著且效果HB-2＞B579 ＞B1＞B001（P＜0.05）。

表2 四種拮抗菌對灰葡萄孢霉病原菌菌絲體的抑制作用

2.4 四種芽孢桿菌對灰葡萄孢霉病原菌菌絲體形態的影響

實驗中4種芽孢桿菌均能夠影響灰葡萄孢霉病原菌菌絲體形態。如圖4所示，在光學顯微鏡下，空白對照的灰葡萄孢霉菌絲細長且粗細均勻，表面光滑，分支少，間節長，頂端漸尖，原生質分布均勻；而拮抗菌處理組抑菌圈邊緣的灰葡萄孢霉菌絲呈現明顯的形態異常：菌絲扭曲且粗細不均，分支多，節間縮短、變粗，頂端膨大，原生質收縮，出現空泡。

圖4 顯微鏡下不同處理的灰葡萄孢霉菌絲形態（100×）

2.5 四種芽孢桿菌的活體時效性實驗

蒜薹活體接種灰葡萄孢霉之后，隨著貯藏時間的延長，病斑直徑逐漸增大。使用4種芽孢桿菌對其進行預防和治療試驗時，均能夠使灰葡萄孢霉病斑直徑增長速度減慢，甚至不再增大，4種芽孢桿菌對蒜薹灰霉病的預防效果均好于治療效果。具體結果如圖5所示，B001：和灰葡萄孢霉同時接種組與只接種灰葡萄孢霉的對照組相比，病斑直徑無顯著差異，而治療和預防各組相對于對照組病斑直徑顯著減小，其中，提前3 d進行預防的效果顯著好于其余各組；B1：各處理組相對于對照組都顯著減小了病斑直徑，其中，前3 d和前4 d預防組的病斑直徑顯著小于其余各組；HB-2：治療各組、預防各組以及同時接種組相對于對照組都顯著減小了病斑直徑，其中，提前3 d進行預防的效果較好；B579：同時接種組與對照組的病斑直徑無顯著差異，其余各處理組均顯著減小但相互之間差異不顯著，前3 d和前4 d預防組的效果較好。

圖5 四種芽孢桿菌對蒜薹病斑擴展的時效性效果圖

蒜薹感染灰葡萄孢霉后品質下降，從表3、4和5可以看出：B001處理的各組與對照組相比，可溶性固形物、維C含量以及可滴定酸含量都顯著下降；B1處理的各組蒜薹可溶性固形物、維C含量以及可滴定酸含量比對照組也顯著減少；HB-2預防處理的各組與對照組相比，可溶性固形物、維C含量以及可滴定酸含量無顯著差異，其余各組3者含量均顯著下降；B579預防各組蒜薹的可溶性固形物、維C以及可滴定酸含量與對照組無顯著差異，其余各組3者含量都顯著減少。

表3 四種芽孢桿菌不同處理后對蒜薹可溶性固形物含量（%）的影響

表4 四種芽孢桿菌不同處理后對蒜薹Vc含量（mg/100g）的影響

表5 四種芽孢桿菌不同處理后對蒜薹可滴定酸含量（%）的影響

3 討論

經過鑒定，本研究中所用菌株B579、B001為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；B1和HB-2為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。芽孢桿菌的生物防治作用機制多種多樣，主要包括競爭作用、拮抗作用、溶菌作用、誘導植物產生抗性及促進植物生長5個方面［17］。本研究離體實驗中，觀察到4種芽孢桿菌的活菌體周圍產生抑菌圈，而過濾液、熱處理液、和無菌水對照濾紙片周圍沒有抑菌圈產生。這表明芽孢桿菌活菌菌體對灰葡萄孢霉的擴展產生了抑制作用，而經過加熱之后死亡的菌體沒有抑制作用。另外，過濾液對灰葡萄孢霉擴展沒有抑制作用，可能是由于濾液中芽孢桿菌的分泌物對灰葡萄孢霉沒有抑制作用，或者由于本實驗中過濾液中含有的抑菌活性物質濃度較低，不能形成明顯的抑制作用。因此，芽孢桿菌分泌物對灰葡萄孢霉是否有抑制作用，還需要進一步的驗證。通過深入研究影響芽孢桿菌分泌活性物質的條件因素以及活性物質的成分和抑菌活性，最終明確4種芽孢桿菌對灰葡萄孢霉的作用機制。通常絲狀真菌的生長表現為頂端生長，但本研究在光學顯微鏡下觀察發現，4種芽孢桿菌抑菌圈邊緣的灰葡萄孢霉菌絲頂端膨大變形，這就阻礙了菌絲繼續生長，從而形成了對峙培養時的拮抗圈。而抑菌圈邊緣的菌絲扭曲且粗細不均，原生質收縮，出現空泡，則可能是芽孢桿菌對灰葡萄孢霉產生了溶菌作用。溶菌作用是拮抗微生物通過吸附在病原真菌的菌絲上，并隨著菌絲生長而生長，消解菌絲體，使菌絲畸形發生斷裂、解體、細胞質消解，有的還會促使菌絲原生質凝結［17］。Liu等［18］發現枯草芽孢桿菌B.916使Rhizoctoniasolani 菌絲頂端腫大、破裂。黃現青等［19］研究發現枯草芽孢桿菌fmbJ對點青霉孢子具有溶解作用。因此推斷本研究中4種芽孢桿菌主要通過溶菌作用對灰葡萄孢霉菌絲體的生長產生抑制作用。4種芽孢桿菌中，HB-2對灰葡萄孢霉菌落擴展和菌絲體生長的抑制作用更加顯著。

本研究活體實驗中，4種芽孢桿菌預防組相對于只接種病原菌的對照組皆顯著減小了病斑直徑并減緩了病斑的擴展速度，而且效果好于治療各組。這可能是由于預防處理的芽孢桿菌能在蒜薹上提前繁衍和定殖，形成競爭優勢，從而抑制了后來接種的灰葡萄孢霉的生長；而治療效果不好的原因可能是先接種灰葡萄孢霉使之形成了生長優勢，隨后使用芽孢桿菌治療則競爭不過病原菌，所以效果不佳。4種芽孢桿菌抑制蒜薹病斑擴展的時效性有所不同：B001和HB-2提前3 d進行預防最好，B1提前3 d和4 d效果佳，而B579的各種預防處理效果無差異，提前3 d和提前4 d預防的效果都較好。這可能與不同芽孢桿菌的生長特點，對灰葡萄孢霉抑制能力以及兩者之間形成的微環境不同有關。芽孢桿菌HB-2和B579也對蒜薹品質的保持產生了作用。可溶性固形物含量是反映果蔬貯藏期間的營養品質指標，主要包括可溶性糖以及其他一些可溶性有機質；蒜薹中維生素 C 含量豐富，其含量的高低是衡量營養成分的重要指標；可滴定酸也對蒜薹品質有著重要影響［20］。HB-2和B579預防各組蒜薹的可溶性固形物、維C含量以及可滴定酸含量與對照組無顯著差異，表明芽孢桿菌HB-2和B579可以有效地減緩蒜薹中可溶性固形物，Vc和可滴定酸的減少，從而保證了蒜薹的營養品質。劉璐等［21］研究發現使用膠凍樣芽孢桿菌能有效提高赤霞珠葡萄的光合特性，增強果實品質；肖嫩群等［22］研究接種芽孢桿菌B13能夠改良白菜的生物性狀，還能提高白菜的產量和品質，都與本研究結果一致。

本實驗中的4種芽孢桿菌在離體條件下對蒜薹灰葡萄孢霉均具有較好的抑菌效果，并且HB-2和B579對活體蒜薹也有較好的保鮮作用。本研究的4種芽孢桿菌活體實驗針對的是少量單獨的蒜薹進行的，但對成袋批量的蒜薹抑菌能力是否和前者相同，抑制效果是否受其他因素影響，對實驗以外的病原菌是否有抑制作用，以及能否增加蒜薹的抗病性，都仍需進一步研究驗證。

4 結論

本研究對保存的4種芽孢桿菌菌株種屬水平做初步鑒定并利用它們進行離體實驗和活體實驗，檢測了它們對蒜薹灰葡萄孢霉的抑菌作用以及對蒜薹保鮮的時效性。解淀粉芽孢桿菌HB-2在離體實驗中對灰葡萄孢霉菌落擴展和菌絲體生長的抑制作用更加顯著，并且芽孢桿菌HB-2和B579活體實驗中的預防處理也能較好地保持蒜薹的品質，具有潛在的開發價值。

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（責任編輯 朱琳峰）

Timeliness of Four Bacillus Strains Against Botrytis cinerea of Garlic Sprouts

WEI Qian2ZHANG Na1ZHANG Ping1LI Ming-gang2YAN Rui-xiang1
（1. National Engineering and Technology Research Center for Preservation of Agricultural Products，Tianjin Key Laboratory of Post-harvest Physiology and Storage of Agricultural Products，Tianjin 300384；2. College of Life Science，Nankai University，Tianjin 300071）

The aim of this work is to identify the four strains of Bacillus at the species level and study their inhibitory effects on Botrytis cinerea in vitro and their timeliness of fresh-keeping garlic sprouts in vivo. The plate-to-plate method and the mycelial growth method were used for in vitro experiments，and the injury inoculation method was for prevention and therapy treatment in vivo experiments in different periods. Results showed that four Bacillus strains in vitro presented significant inhibitory effects on colonization and mycelial growth of Botrytis cinerea in contrast to the control，and in the order of HB-2 ＞ B579 ＞ B1＞ B001（P ＜ 0.05）. In vivo experiments under 20℃ showed that preventive treatments with four Bacillus strains effectively controlled the expansion of B. cinerea lesion，and the effect was better than that of therapy treatment，but the optimal preventive time of various Bacillus varied. Among them，the preventive treatment with Bacillus HB-2 and B579 better maintained the soluble solids，vitamin C and titratable acid content of garlic sprouts. In conclusion，Bacillus HB-2 is more effective than the other three strains of Bacillus to prevent garlic mold of garlic sprouts.

Bacillus；Botrytis cinerea；garlic sprouts fresh-keeping；timeliness

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1216

2017-01-13

國家科技支撐項目（2015BAD16B07），河南省科技開發合作計劃項目（152106000060）

魏倩，女，碩士研究生，研究方向：生物技術與新藥；E-mail：weiqianweiq@163.com

閻瑞香，女，博士，研究員，研究方向：采后生理與貯藏保鮮；E-mail：yrxan@163.com