大鼠NeuroD2基因的克隆、真核表達載體的構建及其在小鼠MSCs細胞中的表達

姬菩忠趙興緒秦文宋學文張勇趙紅斌

（1. 甘肅農業大學生命科學技術學院，蘭州 730070；2. 蘭州軍區蘭州總醫院骨科研究所，蘭州 730050）

大鼠NeuroD2基因的克隆、真核表達載體的構建及其在小鼠MSCs細胞中的表達

姬菩忠1，2趙興緒1秦文2宋學文2張勇1趙紅斌1，2

（1. 甘肅農業大學生命科學技術學院，蘭州 730070；2. 蘭州軍區蘭州總醫院骨科研究所，蘭州 730050）

克隆大鼠NeuroD2基因，旨在構建pIRES2-AcGFP1-ND2真核表達載體并檢測其在小鼠MSCs中的表達。采用RTPCR技術克隆大鼠NeuroD2基因，分析該蛋白質結構、功能域、細胞定位及與其他物種同源性；構建pIRES2-AcGFP1-ND2表達載體并轉染小鼠骨髓間充質干細胞（MSCs）；采用Real-time PCR、免疫熒光及Western blot技術檢測重組質粒在小鼠MSCs中的表達。結果表明，大鼠NeuroD2基因CDS區全長1 149 bp，共編碼382個氨基酸，屬于bHLH家族，二級結構以α-螺旋和無規卷曲為主，空間結構呈現近似“螺旋-環-螺旋（HLH）”結構，主要分布在細胞核，氨基酸序列與家鼠（99%）、羅猴（98%）、人（97.7%）同源性較高；Real-time PCR結果表明轉染組NeuroD2基因表達量顯著高于對照組（P＜0.05）；免疫熒光及Western blot結果顯示轉染組NeuroD2蛋白表達量顯著高于對照組（P＜0.05）。成功克隆大鼠NeuroD2基因并構建了pIRES2-AcGFP1-ND2真核表達載體。

NeuroD2；基因克隆；生物信息學分析；pIRES2-AcGFP1-ND2

大鼠神經源性分化蛋白（Neurogenic differertiation，NeuroD）屬于II類堿性螺旋-環-螺旋（Basic helix-loop-helix，bHLH）蛋白家族成員［1-3］，其基因位于2q32，是一種含bHLH結構域并結合E-box的轉錄因子，在神經分化過程中起重要作用［4］，其中NeuroD亞類（NeuroD，Nex-1［Math-2］，Math-3，and NeuroD2［NDRF］）大部分在神經發育過程中表達［5］。NeuroD2基因主要表達于大腦組織中，是控制神經分化的關鍵基因，其表達可從胚胎第11天開始持續到成年，Farah等［6］通過上調NeuroD2的表達使來源于小鼠胚胎的P19細胞獲得神經元樣形態并表達神經特異性蛋白β-tubulin III。

本研究通過對大鼠NeuroD2基因的CDS區進行克隆并分析其序列，構建重組表達載體pIRES2-AcGFP1-ND2，轉染小鼠MSCs并檢測其表達情況，以期為后續研究該載體誘導MSCs向神經元樣細胞分化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 取4只清潔級成年Wistar大鼠，體重（150±10 g），雌雄不限，頸動脈處死后迅速取其大腦組織，于液氮中儲存備用。質粒、菌株及細胞真核表達載體 pIRES2-AcGFP1、克隆載體pMD20-T vector及E. coli DH5α均購自TaKaRa公司；小鼠骨髓間充質干細胞D1細胞株購自美國ATCC公司（CRL-10915）。

1.1.2 主要試劑 高保真聚合酶、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis試劑盒、SYBR?Green熒光定量試劑及DNA Marker均購自TaKaRa公司；質粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；限制性內切酶Nhe I和Bam HI購自New England Biolabs；T4連接酶購自Therom Fisher公司；瓊脂糖、瓊脂粉、胰蛋白胨、酵母浸出粉、氨芐青霉素、IPTG和X-Gal均購自上海生工公司；卡那霉素購自上海麥克林生化科技有限公司；NeuroD2抗體購自Abcam公司；胎牛血清購自浙江天杭科技有限公司；D-MEM/F12培養基購自Gibco；Trizol、Lipofectamine2000和Opti-MEM Medium購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據NCBI數據庫收 錄 的Norway大 鼠NeuroD2基 因mRNA序 列（NM_019326.1），采用Primer Premier5.0 軟件針對CDS區設計一對引物，并在引物上下游分別插入Nhe I和Bam HI酶切位點及相應保護堿基（下劃線所示）。F：5'-CGGCTAGCCGCATGCTGACCCGCCTG TT-3'，R：5'-CGGGATCCCGGGCCGGACAAAGGCAA AG-3'。

1.2.2 總RNA提取及RT-PCR 使用Trizol法提取大鼠大腦總RNA，紫外分光光度計測定濃度及純度后，于-80℃冰箱保存備用。按反轉錄說明書步驟將總RNA反轉錄后進行PCR擴增，PCR反應條件：98℃ 10 s，63.6℃ 5s，72℃ 1 min，30個循環，PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 大鼠NeuroD2基因的克隆PCR產物 通過1%瓊脂糖凝膠電泳回收純化后，取1 μL PCR產物、1 μL pMD20-Tvector和3 μL滅菌蒸餾水混勻后，加入5 μL Ligation Mighty Mix，輕輕混勻，16℃ 30 min進行連接。連接后將產物導入E.coli DH5α感受態培養并篩選陽性克隆菌落，通過Nhe I和Bam HI雙酶切鑒定后，送北京擎科生物技術有限公司進行測序。

1.2.4 大鼠NeuroD2基因的生物信息學分析 使用在線軟件ProtParam（http://web.expasy.org/ protpar am/）、SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy. org/）、Predictprotein（http://www.predic- tprotein. org）、SOPMA（http://nhjy.hzau.edu.cn/kech/swxxx/ jakj/dianzi/Bioinf7/Expasy/Expasy 8.htm）、MotiFinder（http://quasimotifinder.tau.ac.il/）、TMHMM（http://www. cbs.dtu.dk/ services /TMHMM/）、PSORT II Prediction（http://psort.hgc.jp/ form.html）預測NeuroD2蛋白的結構、功能域及亞細胞定位。通過軟件MegAlign和BLAST對牛（NM_001205958）、黑猩猩（XM_511456）、人（NM_006160）、羅猴（NM_001265801）、熱帶爪蟾（NM_001079018）、斑馬魚（NM_131082）、挪威鼠（NM_019326）、家鼠（NM_010895）進行同源性分析。

1.2.5 真核表達載體pIRES2-AcGFP1-ND2的構建 將克隆質粒pMD20-ND2和pIRES2-AcGFP1載體用Nhe I和Bam HI雙酶切后，回收目的基因和表達載體片段，T4連接酶16℃過夜連接，將連接產物轉化至E.coli DH5α感受態細胞，并篩選陽性克隆菌落。

1.2.6 小鼠MSCs的培養及轉染 將小鼠MSCs按0.25×104個/孔接種于6孔板中，培養于含10%胎牛血清的D-MEM/F-12完全培養基中，37℃ 5% CO2，待細胞貼壁率達70%-90%時開始轉染。轉染分為實驗組（pIRES2-AcGFP1-ND2）和對照組（pIRES2-AcGFP1），每組重復3次。用無血清Opti-MEM培養基清洗細胞3次后，按Lipofectamine2000說明書配置轉染體系，轉染6 h更換完全培養基，培養24 h后在熒光顯微鏡下觀察AcGFP1的表達。隨意挑選5個高倍鏡視野（×400），每個視野分別計數200個細胞并計算表達AcGFP1蛋白的陽性細胞比例。

1.2.7 Real-time PCR檢測重組質粒 在小鼠MSCs中的表達轉染24 h后提取細胞總RNA，反轉錄后根據NeuroD2基因（NM_019326.1）設計引物：F：5'-CCTGCTACTCCAAGACGCAGAA-3'，R：5'-CAGAGTCTGCACGTAGGACACCA-3'。以小鼠GAPDH基因為內參：F：5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，R：5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'。Realtime PCR反應體系20 μL，SYBR?Green 10 μL，上下游引物各0.6 μL，Rox 0.8 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL；反應條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 31 s，40個循環；每組重復4次，所得結果采用2-ΔΔCt法進行計算分析。

1.2.8 免疫熒光和Western blot法檢測重組質粒在小鼠MSCs中的表達 在含無菌蓋玻片的培養皿中轉染小鼠MSCs 72 h，待細胞貼壁率在70%-90%時棄去培養基，爬片經4%多聚甲醛固定、0.01 mol/L PBS清洗、0.5% TritonX-100作用后，5% BSA封閉30 min，滴加稀釋后的NeuroD2一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜，0.01 mol/L PBS清洗3次，滴加FITC標記的二抗（1∶200），37℃避光孵育1 h，PBS清洗3次，滴加濃度為5 mg/mL DAPI染色5 min，蒸餾水沖洗3次，緩沖磷酸甘油封片，熒光顯微鏡觀察結果。

轉染72 h后的細胞，通過RIPA裂解液裂解并收集，4℃ 12 000 r/min離心30 min，收集上清。對提取的總蛋白進行定量和變性，按20 μg/孔上樣并進行SDS-PAGE電泳分離，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，濃度為NeuroD2（1∶500）和β-actin（1∶1 000）的一抗中4℃孵育過夜。0.01 mol/L TBST洗膜后加HRP標記的羊抗兔二抗（1∶10 000），37℃孵育2 h，0.01 mol/L TBST清洗4次，ECL顯影曝光，使用Ipwin 32軟件對條帶進行灰度值掃描。

1.2.9 結果統計分析 實驗數據采用SPSS18.0進行統計學分析，以x±s表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義，圖表采用GraphPad Prism 5軟件進行繪制。

2 結果

2.1 NeuroD2基因的擴增與克隆

RT-PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見一條1 200 bp左右條帶，與目的基因大小相符（圖1-A）；克隆后的陽性質粒，采用限制性內切酶Nhe I和Bam HI酶切后可見2 500 bp和1 200 bp左右條帶，結果與預期大小相近（圖1-B）。

圖1 大鼠Neuro D2基因RT-PCR產物和pMD20-ND2雙酶切凝膠電泳圖

2.2 pIRES2-AcGFP1-ND2表達載體的構建

重組后的質粒pIRES2-AcGFP1-ND2進行Nhe I和Bam HI雙酶切，得到兩條片段，長度分別約5 300 bp和1 200 bp，與預期NeuroD2基因和表達載體片段大小一致（圖2）。

2.3 生物信息學分析

2.3.1 NeuroD2基因序列及氨基酸結構分析 通過BLAST比對確定測序所得序列為大鼠NeuroD2基因，利用ORF Finder軟件對所得序列分析結果表明，該基因CDS區長為1 149 bp，編碼382個氨基酸（圖3）。Protparam軟件預測該蛋白質分子式為C18O6H2981N589O532S6，分子質量為4.16 kD，理論等電點為10.74。SOPMA分析發現其二級結構主要以α-螺旋與無規卷曲為主，其中α-螺旋占37.43%、無規卷曲46.07%、β-折疊占6.58%（圖4-A）。利用SWISS-MODEL對該蛋白的三維結構進行預測，結果顯示主要由位于122-180位的氨基酸構成“螺旋-環-螺旋”（bHLH）結構（圖4-B），有12個位點的氨基酸與bHLH結構的保守位點相符。通過PSORT在線分析，得知NeuroD2蛋白主要存在于細胞核中（圖4-C），可信度為99。

圖2 重組質粒雙酶切凝膠電泳圖

圖3 NeuroD2基因CDS區及其編碼蛋白的序列

圖4 NeuroD2基因編碼蛋白的二級結構預測及其細胞中的定位

2.3.2 NeuroD2蛋白結構及功能域分析 使用Predictprotion與MotifFinder對NeuroD2蛋白結構與功能域進行預測，得出RNA結合位點位于第104、106-109、122-123、127、131位，DNA結合位點位于第107-109、123、129位（圖5-A）；180-310位氨基酸形成Neuronal helix-loop-helix 轉錄因子，74-147位的氨基酸有可能參與形成60S核糖體亞基形成，81-145氨基酸可能形成CDC45蛋白（圖5-B）。

圖5 NeuroD2蛋白的結構及功能域

圖6 NeuroD2同源性分析圖

2.3.3 同源性分析 通過MegAlign比對發現Wistar大鼠NeuroD2氨基酸序列與家鼠、羅猴、人、黑猩猩、牛、Norway鼠、熱帶爪蟾、斑馬魚同源性分別為99%、98%、97.7%、97.7%、97%、93.9%、70.8%和57.1%（圖6-A）；通過MEGA6構建的NeuroD2系統發生樹顯示，Wistar大鼠、Norway鼠和家鼠的親源性最近（圖6-B）。

圖7 轉染后AcGFP1蛋白表達

2.6 NeuroD2蛋白在小鼠MSCs中的表達

通過對轉染72 h后細胞NeuroD2蛋白進行Western blot分析，結果顯示實驗組與對照組相比，在41 kD左右位置有明顯的深色條帶（圖9-A），通過Ipwin 32軟件對條帶灰度值進行掃描，統計后發現實驗組NeuroD2蛋白表達量顯著高于對照組（P＜0.05）（圖9-B）。對轉染細胞爬片進行免疫熒光染色后發現，實驗組中NeuroD2蛋白表達呈陽性（圖9-C），對照組未見明顯表達（圖9-D）。

3 討論

2.4 轉染后MSCs中熒光表達

轉染24 h后，通過熒光顯微鏡觀察發現，實驗組中83%的細胞有綠色熒光蛋白AcGFP1的表達（圖7-A），對照組中有57.5%的細胞有AcGFP1綠色熒光蛋白表達（圖7-B）。

2.5 NeuroD2基因在小鼠MSCs中的表達

轉染24 h后，Real-time PCR結果顯示，實驗組與對照組均有NeuroD2基因的表達，但實驗組NeuroD2基因表達水平顯著高于對照組（P＜0.05）（圖8）。

圖8 NeuroD2轉染后mRNA表達結果

bHLH轉錄因子作為一種調控蛋白，是真核生物中的一個大家族，其成員從1989年至今已有1 000多條并在不同生物中已得到驗證，在生物的生長發育調控過程中起著極為重要的作用，它們參與調控神經元發生、肌細胞生成、血細胞生成、性別決定和組織發育等［7-9］。

Atchley等［10］對392種蛋白bHLH氨基酸的組成進行統計分析發現，bHLH家族氨基酸序列具有19個保守位點，以此建立了bHLH序列的預測基序，并將判斷是否屬于bHLH家族的標準初步定于19個保守位點中有11個以上位點的氨基酸與預測基序相符。本研究發現，Wistar大鼠NeuroD2蛋白氨基酸序列中有12個氨基酸與保守位點基序相符，通過生物信息學軟件對該蛋白不同結構、表達部位、功能位點及同源性分析，推測Wistar大鼠NeuroD2基因所編碼蛋白屬于bHLH家族。

bHLH轉錄因子因其所調控基因的功能不同而分為45個家族，根據它們所作用的DNA元件和自身結構特點又被分成6個組［7］，包括在視網膜細胞命運中起決定作用的NeuroD家族［11］、在內耳發育中起重要作用的Atonal家族［12］以及與大腦皮質祖細胞分化有密切關系的Ngn家族［13］等。作為bHLH家族中的一員，NeuroD2基因的正常表達可形成正常的神經結構，誘導神經分化，調高神經元生存率［14-16］。NeuroD2水平的降低可導致運動失調，癲癇發作閾值降低和過早死亡［14］。

隨著對干細胞研究的不斷深入，通過干細胞治療神經損傷有可能成為神經修復的新途徑。Qian等［17］研究顯示小鼠MSCs可促進軸突再生并有助于星形細胞中組織纖溶酶原活性的提高。Nakano和Lin等［18，19］將SD大鼠MSCs注入腦脊液用于中樞神經損傷（SCI）研究，結果顯示在亞急性和急性SCI中，MSCs可以提高大鼠運動功能，也可以促進軸突再生。本課題組在研究紅景天苷誘導大鼠MSCs的分化過程中，發現誘導之后細胞均有β-Tubulin Ⅲ、NSE、MAP2、巢蛋白和GFAP等神經相關蛋白的表達［20］。本研究構建含NeuroD2基因的重組質粒并轉染小鼠MSCs，通過Real-time PCR、Western blot和免疫熒光等方法對NeuroD2基因及蛋白表達量測定發現，與對照組相比，此次構建的重組質粒上調小鼠MSCs中NeuroD2基因及蛋白的表達，可為后續進一步誘導小鼠MSCs分化為神經元樣細胞的研究奠定基礎。

圖9 轉染后NeuroD2蛋白表達結果

4 結論

本研究從大鼠大腦中克隆了NeuroD2基因，其CDS區全長1 149 bp，編碼382個氨基酸，屬于bHLH家族，該蛋白位于細胞核，其序列具有較高保守性。構建的真核表達載體pIRES2-AcGFP1-ND2在轉染小鼠MSCs后得以表達，Real-time PCR、Western blot和免疫熒光結果充分證明，該重組質粒可上調NeuroD2在小鼠MSCs中的表達量。

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（責任編輯 狄艷紅）

Cloning and Construction of Eukaryotic Expression Vector for NeuroD2 in Rat，and Its Expression in Mouse MSCs

JI Pu-zhong1，2ZHAO Xing-xu1QIN Wen2SONG Xue-wen2ZHANG Yong1ZHAO Hong-bin1，2
（1. College of Life Sciences，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070；2. Institute of Bone Injury，Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command of Chinese PLA，Lanzhou 730050）

This work aims to clone NeuroD2 gene，construct the eukaryotic expression vector pIRES2-AcGFP1-ND2，and analyze its expression in mouse MSCs. The rat NeuroD2 gene was cloned by RT-PCR，and the protein structure，functional domain，cell localization and homology with other species were analyzed. The constructed pIRES2-AcGFP1-ND2 expression vector was transfected to mouse bone marrow mesenchymal stem cells（MSCs）. The expression of the recombinant plasmid in the mouse MSCs was detected by real time-PCR，Western blot and immunofluorescence. The results showed that，the length of CDS in rat NeuroD2 gene was 1149 bp，and it encoded 382 amino acids，belonging to bHLH family. The secondary structure mainly composed of the α-helices and random coil. Tertiary structure of NeuroD2 was a“helix-loop-helix” structure and mainly localized in nucleus. The NeuroD2 protein of the experimental rat（Rattus norvegicus）shared 99%，98% and 97.7% homology with Mus musculus，Macaca mulatta and Homo sapiens，respectively. The results of real-time PCR，Western blot and immunofluorescence indicated that the expression levels of NueorD2 mRNA and protein in transfected group were significantly higher than that in control group（P ＜ 0.05）. In conclusion，the eukaryotic expression vector pIRES2-AcGFP1-ND2 was constructed successfully.

NeuroD2；gene cloning；bioinformatics；pIRES2-AcGFP1-ND2

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1087

2016-11-29

國家自然科學基金面上項目（81470087），全軍十二五面上項目（CWS11C228）

姬菩忠，男，碩士研究生，研究方向：生物化學與分子生物學；E-mail：jipuzhong@163.com

趙興緒，男，博士，研究方向：發育生物學；E-mail：zhaoxx@gsau.edu.cn