四種新型農(nóng)藥對斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性效應(yīng)

吳玉瓊陳瑩胡永樂左正宏王重剛

（1. 武夷學(xué)院茶與食品學(xué)院，武夷山 354300；2. 廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廈門 361005）

四種新型農(nóng)藥對斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性效應(yīng)

吳玉瓊1陳瑩2胡永樂1左正宏2王重剛2

（1. 武夷學(xué)院茶與食品學(xué)院，武夷山 354300；2. 廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廈門 361005）

為了研究4 種農(nóng)藥（腈苯唑、吡唑醚菌酯、惡霜靈、戊菌隆）單獨(dú)及聯(lián)合作用對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響，設(shè)計(jì)7個(gè)實(shí)驗(yàn)組（空白組、溶劑組、4種農(nóng)藥單獨(dú)暴露組及聯(lián)合暴露組）對斑馬魚胚胎暴露72 h，結(jié)果顯示，濃度50 ng/L的4種農(nóng)藥單獨(dú)暴露導(dǎo)致心包囊和卵黃囊水腫比率、脊柱彎曲率均顯著高于對照組；腈苯唑、惡霜靈及聯(lián)合暴露導(dǎo)致斑馬魚仔魚心率顯著下降，出現(xiàn)顯著的心律不齊；斑馬魚胚胎的Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性被顯著誘導(dǎo)，而聯(lián)合暴露表現(xiàn)出顯著的抑制作用。結(jié)果說明，環(huán)境濃度的農(nóng)藥暴露對魚類胚胎發(fā)育具有明顯的毒性。

腈苯唑；吡唑醚菌酯；惡霜靈；戊菌隆；聯(lián)合暴露；斑馬魚；胚胎發(fā)育

農(nóng)藥是化學(xué)品中毒性較高、降解緩慢的一種物質(zhì)［1］，其易隨降雨、徑流及灌溉水等進(jìn)入地表水、地下水和土壤等不同區(qū)域［2］。農(nóng)藥進(jìn)入水體后，易對水中的生物造成影響，嚴(yán)重時(shí)可引起水生生物急性中毒，即使未導(dǎo)致生物死亡，也可在生物體內(nèi)富集，通過食物鏈危害人群健康［3］。隨著人們環(huán)境保護(hù)意識的增強(qiáng)和生活質(zhì)量的提高，農(nóng)藥功用逐漸從殺死轉(zhuǎn)為調(diào)控，品種不斷更新，全面進(jìn)入高效化時(shí)代。據(jù)報(bào)道，不同農(nóng)藥在不同環(huán)境生物條件下降解速度、生物活性、環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)等均存在差異［4］。新型農(nóng)藥的開發(fā)被認(rèn)為是提高效率、減少用量的綠色化學(xué)之路［5］，對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境保護(hù)具有重要意義。

腈苯唑（Fenbuconazole）屬于唑類農(nóng)藥。唑類農(nóng)藥作為殺菌劑具有高效、廣譜、低毒、持續(xù)時(shí)間長等特點(diǎn)，自1976年以來數(shù)10種唑類農(nóng)藥被推向市場［6］，2003-2004年銷售額年增長率為47.7%，在所有農(nóng)藥類別中高居第一位［7］。吡唑醚菌酯（Pyraclostrobin）屬于甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，該類殺菌劑活性高，殺菌譜廣，作用機(jī)制獨(dú)特，對環(huán)境友好，是繼三唑類殺菌劑之后一個(gè)新的里程碑［8］。惡霜靈（Metoxazon）屬于酰胺類農(nóng)藥。酰胺類除草劑在市場中所占份額極大，2009年，我國酰胺類除草劑交易額達(dá)15億元，占我國農(nóng)用除草劑總金額的18%［9］。研究發(fā)現(xiàn)部分酰胺類農(nóng)藥殘效期較長，且具有明顯的致突變性［10，11］。戊菌隆（Pencycurone）屬于脲類新型農(nóng)藥，由日本特殊農(nóng)藥公司和德國拜耳公司聯(lián)合開發(fā)的脲類殺菌劑，無內(nèi)吸性，其具有良好的保護(hù)和持效活性［12］。在法國的河流表面水中，唑類農(nóng)藥，包括腈苯唑，檢出的濃度從幾納克水平到最大的微克水平（丙環(huán)唑1.75 μg/L，Propiconazole）［13］。吡唑醚菌酯在美國加利福尼亞的一個(gè)河口被頻繁檢出，每升濃度從幾十到兩百多納克［14］。我國福建省九龍江流域水中農(nóng)藥污染，監(jiān)測結(jié)果顯示存在82種農(nóng)藥，普遍的污染濃度達(dá)到幾十納克甚至100納克以上，最高的為腐霉利（Procymidone）（3 904 ng/L）［15］。孫廣大［16］于2008年在九龍江口及廈門西海域表層水和沉積物中，檢測出除傳統(tǒng)的有機(jī)磷和有機(jī)氯農(nóng)藥，苯胺類、酰胺類、唑類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類、苯胺基嘧啶等“新型”農(nóng)藥也被大量檢出，說明農(nóng)業(yè)地區(qū)流域的水環(huán)境中存在多種類農(nóng)藥復(fù)合污染狀況。

研究農(nóng)藥的急性、亞慢性與慢性毒性一般利用水中食物鏈的代表生物如藻類、蚤與魚類等，并用得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)評價(jià)農(nóng)藥對水生生物的影響［17］。斑馬魚（Danio rerio）具有體型小、繁殖速度快、飼養(yǎng)管理簡便、其胚胎的整個(gè)發(fā)育過程透明可見等優(yōu)點(diǎn)，多數(shù)國際組織和國家已將斑馬魚作為制定環(huán)境毒性標(biāo)準(zhǔn)的模式動物［18-20］。經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）于1996已制定了詳細(xì)的操作指南［21］。

有研究認(rèn)為斑馬魚胚胎比成魚對有毒化合物更加敏感，用斑馬魚胚胎為受試生物進(jìn)行急性毒性研究更為適宜［22］。近年來關(guān)于農(nóng)藥對斑馬魚胚胎發(fā)育影響的報(bào)道不為少見［23，24］，其中關(guān)于唑類農(nóng)藥對斑馬魚的發(fā)育毒性有較深入的研究［25，26］。但是新型農(nóng)藥在環(huán)境濃度下的毒性作用比較鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究腈苯唑、吡唑醚菌酯、惡霜靈、戊菌隆對斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性作用，通過分析相同濃度分別單獨(dú)作用及4種農(nóng)藥聯(lián)合暴露后斑馬魚胚胎的存活率、孵化率、畸形發(fā)生率、ATP酶活性以及心臟功能各生理指標(biāo)，比較常見的4種農(nóng)藥的毒性，為新型農(nóng)藥的合理使用提供科學(xué)依據(jù)，也為完善農(nóng)藥對水環(huán)境污染效應(yīng)評估標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 戊菌隆（純度≥96%）、吡唑醚菌酯（純度≥96%）、腈苯唑（純度≥96%）、惡霜靈（純度≥96%）購于Sigma-Aldrich公司；先以丙酮為助溶劑溶解配制濃度為50 μg/L儲備液，4℃避光保存。蛋白含量測定及ATP 酶活性測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純試劑。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)用魚和魚卵收集 斑馬魚（WT-U系）喂養(yǎng)根據(jù)Westerfield［27］的方法進(jìn)行，飼養(yǎng)于廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院斑馬魚養(yǎng)殖中心。循環(huán)養(yǎng)殖水，水溫26±1℃，光照周期14 h光照/10 h黑暗，每天喂食新鮮孵化的豐年蟲（Artemia nauplii）2-3次。

實(shí)驗(yàn)前1 d晚上，將雌雄魚按照2∶1比例放置在孵化槽中，并用隔板將雌雄分開，第2天早上9點(diǎn)左右打開隔板，開燈給予光照刺激使其交配產(chǎn)卵。0.5-1 h內(nèi)收集魚卵，用斑馬魚養(yǎng)殖液清洗并在顯微鏡下觀察，選取受精胚胎用于暴露實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 暴露實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前將農(nóng)藥儲備液用培養(yǎng)液（3.5 g/L NaCl，0.05 g/L NaHCO3，0.05g/L KCl，0.05 g/L CaCl2）分別配制終濃度為50 ng/L的單種農(nóng)藥曝污液及4種農(nóng)藥混合曝污液（即4種農(nóng)藥分別為12.5 ng/L，總濃度為50 ng/L），共5個(gè)曝污組，并設(shè)空白組和對照組（丙酮濃度為0.1%。丙酮作為助溶劑適宜濃度為≤0.1%［28］），每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)5個(gè)平行組。分別置于直徑 90 mm 培養(yǎng)皿中，注入曝污培養(yǎng)液30 mL，每皿培養(yǎng)100枚斑馬魚胚胎。實(shí)驗(yàn)期間28±0.5℃恒溫培養(yǎng)，每隔 12 h 更換等量等濃度的培養(yǎng)液并清理死亡胚胎。

1.2.2 相關(guān)形態(tài)學(xué)指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)及計(jì)算 分別于斑馬魚胚胎12、24、36、48、72 hpf（Hour postfertilization）時(shí)，觀察胚胎的存活（肉眼觀察胚胎變白或者顯微鏡下觀察胚胎絮狀凝結(jié)、心臟不跳動即可判定死亡），統(tǒng)計(jì)存活率。48 hpf時(shí)，統(tǒng)計(jì)孵化率（胚胎出膜并能游動視為已孵化），72 hpf時(shí)統(tǒng)計(jì)畸形率（主要指心包囊水腫、卵黃囊水腫和脊柱彎曲）。

存活率（%）=存活胚胎數(shù)/總胚胎數(shù)×100%

孵化率（%）=已孵化胚胎數(shù)/總胚胎數(shù)×100%

畸形率（%）=畸形胚胎數(shù)/存活胚胎數(shù)×100%

1.2.3 心率及相關(guān)功能指標(biāo)的分析 根據(jù)Incardona等［29］、Chen等［30］的方法測量及計(jì)算。將斑馬魚仔魚（每個(gè)處理組設(shè)5個(gè)平行，每個(gè)平行隨機(jī)取3條），固定于6%的甲基纖維素中，并于28±0.5℃下靜置5-10 min，直到仔魚心跳穩(wěn)定后于顯微鏡下對20 s內(nèi)心房和心室的搏動次數(shù)進(jìn)行記錄并攝影，分別測量心室舒張/收縮末期的長軸（a），短軸（b）長，記錄胚胎20 s內(nèi)心跳次數(shù)，計(jì)算1 min心率（HR）、心室舒張/收縮容積（EDV/ESV）、每搏輸出量（SV）、心輸出量（CO）。采用Incardona［29］的方法，記錄一個(gè)完整心跳所經(jīng)歷的時(shí)間幀數(shù)，每條仔魚測3次，取3次所得到的數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差作為這條仔魚的心律參數(shù)，獲得它們的心律參數(shù)分析心律不齊。

1.2.4 ATP 酶活性測定 選擇 72 hpf 的仔魚以超純水蕩洗后用液氮速凍，保存于-80℃冰箱。實(shí)驗(yàn)前將樣品于冰盒上解凍，按1∶4的比例加入生理鹽水，在勻漿器內(nèi)仔細(xì)研磨。準(zhǔn)備好的勻漿液在冷凍離心機(jī)上，4℃下，4 000 r/min 離心10 min，取上清液測定蛋白含量和酶活性。

蛋白含量測定、Na+/K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性的測定均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒。計(jì)算酶活力時(shí)，定義每小時(shí)每毫克組織蛋白的組織中ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1 μmoL 無機(jī)磷的量為一個(gè)ATP 酶活力單位，即微摩爾磷/毫克蛋白/小時(shí)（μmol Pi/mg pro/h）。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（Mean±SE）表示，單因素方差分析（one-way ANOVA）的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間數(shù)據(jù)用Tukey HSD法進(jìn)行顯著性水平分析，設(shè)定P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 四種農(nóng)藥暴露對斑馬魚胚胎存活率及孵化率的影響

斑馬魚胚胎分別經(jīng)4種農(nóng)藥單獨(dú)暴露及聯(lián)合暴露72 h，胚胎的存活率與溶劑對照組相比無顯著性差異（結(jié)果未顯示）。胚胎孵化率，惡霜靈、腈苯唑及聯(lián)合暴露組與溶劑對照組相比顯著下降，吡唑醚菌酯、戊菌隆組無顯著差異（圖1）。

圖1 暴露48 h對斑馬魚胚胎孵化率的影響

2.2 四種農(nóng)藥暴露對斑馬魚仔魚囊腫率及脊柱彎曲率的影響

圖2、圖3顯示，各暴露組的脊柱彎曲率顯著上升，其中腈苯唑作用最明顯。囊腫率在各農(nóng)藥單獨(dú)暴露組也表現(xiàn)出明顯上升，在戊菌隆、惡霜靈和腈苯唑組出現(xiàn)顯著差異，但聯(lián)合暴露組與對照組無顯著差異。

2.3 四種農(nóng)藥暴露對斑馬魚仔魚心臟功能指標(biāo)的影響

除惡霜靈與對照組無差異，其他各暴露實(shí)驗(yàn)組顯示心率顯著下降（圖4）；從心室容量的變化而言，惡霜靈及聯(lián)合作用導(dǎo)致EDV顯著上升，戊菌隆、吡唑醚菌酯和腈苯唑沒有產(chǎn)生顯著的影響，而ESV在惡霜靈組及聯(lián)合作用組與溶劑對照相比無差異，戊菌隆、吡唑醚菌酯和腈苯唑暴露使ESV下降（圖5-A）；惡霜靈暴露及聯(lián)合暴露導(dǎo)致每搏輸出量（SV）顯著上升（圖5-B）；心輸出量CO在惡霜靈組顯著增加，在吡唑醚菌酯、戊菌隆和腈苯唑組顯著下降，聯(lián)合作用組與對照組無顯著差異（圖5-C）。各農(nóng)藥暴露組均導(dǎo)致仔魚出現(xiàn)心律不齊，惡霜靈、腈苯唑及聯(lián)合暴露組呈現(xiàn)心律不齊效應(yīng)顯著（圖6）。

2.4 四種農(nóng)藥對斑馬魚仔魚ATP酶活性的影響

斑馬魚胚胎經(jīng)惡霜靈暴露72 h，其仔魚組織的Na+/K+-ATP酶活性表現(xiàn)出顯著上升，在聯(lián)合作用組則出現(xiàn)顯著降低，其它暴露組均與對照組無差異；Ca2+-ATP酶活性在吡唑醚菌酯、惡霜靈、腈苯唑暴露組顯著上升，而聯(lián)合作用組為顯著下降（圖7）。

圖2 暴露72 h對斑馬魚仔魚脊柱彎曲率的影響

圖3 暴露72 h對斑馬魚仔魚囊腫率（含心包囊腫和卵黃囊腫）的影響

圖4 胚胎暴露72 h對斑馬魚仔魚心率的影響

3 討論

魚類是對化學(xué)污染物較敏感的脊椎動物之一，其胚胎發(fā)育階段更為敏感，生理和器官形成方面更易受到外界環(huán)境影響［31］。心包囊腫、脊柱彎曲等是斑馬魚胚胎毒性檢測實(shí)驗(yàn)中常出現(xiàn)的毒性反應(yīng)［32］。已有研究表明，甲草胺、乙草胺、丙草胺、丁草胺等農(nóng)藥誘導(dǎo)斑馬魚胚胎出現(xiàn)心包囊水腫、軀干彎曲等癥狀［23］；戊唑醇、烯唑醇、異丙甲草胺、阿特拉津等農(nóng)藥在高濃度時(shí)對斑馬魚胚胎發(fā)育顯著表現(xiàn)出心包囊腫和脊柱彎曲［33］；斑馬魚胚胎在β-氯氰菊酯暴露后幼魚體軸表現(xiàn)出嚴(yán)重致畸效應(yīng)［34］；還有表面活性劑［35］、四溴聯(lián)苯醚［36］、四氯二苯并-p-二噁英［37］、重金屬銅、鎘、汞［38，39］等都會引起斑馬魚胚胎發(fā)育畸形。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各農(nóng)藥暴露組對斑馬魚仔魚出現(xiàn)顯著的心包囊和卵黃囊水腫、脊柱彎曲等反應(yīng)，表明4種農(nóng)藥對斑馬魚胚胎具有發(fā)育毒性。

Ca2+-ATP酶是質(zhì)膜上鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中最重要的部分，可利用ATP水解的能量維持細(xì)胞內(nèi)外鈣離子濃度［40］。Na+/ K+-ATP 酶在水生生物體內(nèi)普遍存在，是橫跨質(zhì)膜的一種固有蛋白，也是組成Na+/ K+泵活性的主要部分，對維持細(xì)胞內(nèi)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)以及能量代謝有著重要作用［40］。體軸的彎曲通常是由于體軸肌肉組織損壞，包括肌肉細(xì)胞壞死及肌纖維受損，或脊椎骨自身發(fā)生畸形所致［41］。此外，Ca2+通道功能紊亂也會導(dǎo)致脊柱彎曲［41］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，斑馬魚胚胎在各農(nóng)藥暴露后Ca2+-ATP酶、Na+/ K+-ATP酶活性上升，聯(lián)合作用中兩種ATP酶活性下降，兩種ATP酶活性的上升或下降引起Ca2+通道功能紊亂都引起脊柱彎曲［41］。所以，Na+/ K+-ATP 酶和Ca2+-ATP酶活性的改變可能是農(nóng)藥導(dǎo)致斑馬魚胚胎脊柱彎曲的原因之一。ATP 酶活性作為生態(tài)毒理學(xué)指標(biāo)可以作為水體農(nóng)藥監(jiān)測的生物標(biāo)志物［42］。

圖5 暴露72 h對斑馬魚仔魚心室容量（舒張/收縮容量）（A）、每搏輸出量（B）、心輸出量（C）的影響

圖6 暴露72 h導(dǎo)致斑馬魚仔魚心律不齊

圖7 暴露72 h對斑馬魚仔魚Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性的影響

心臟作為胚胎發(fā)育過程中最早發(fā)揮功能的器官，其完善的循環(huán)功能對于胚胎正常發(fā)育起關(guān)鍵作用。斑馬魚發(fā)育過程中心血管在20 hpf 開始形成，能夠收縮但尚未與發(fā)育中的血液循環(huán)系統(tǒng)相連，發(fā)育至30 hpf時(shí)心臟分化出心室和心房，36 hpf 時(shí)開始規(guī)律心跳［43］。正常生長條件下，48 hpf 時(shí)主要的器官系統(tǒng)完成形態(tài)發(fā)生并開始破膜孵化，此時(shí)心臟功能已相對比較完善，是斑馬魚胚胎發(fā)育進(jìn)程的一個(gè)重要轉(zhuǎn)折點(diǎn)。心率易受外界因素如溫度、污染等影響，有研究表明化學(xué)污染物暴露會使斑馬魚心率上升或下降［44］。心律不齊是心血管疾病危害的病癥之一，而引起心律不齊的原因很多，研究表明K+和Ca2+失調(diào)在心律不齊中有重要影響［45］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示4種農(nóng)藥單獨(dú)暴露后表現(xiàn)心率下降趨勢，心室容量有不同程度的上升或下降，致使每搏輸出量及心輸出量出現(xiàn)上升或下降，從而使各暴露組表現(xiàn)出心律不齊。4種農(nóng)藥的暴露均可致斑馬魚胚胎心臟功能異常。

生物處于脅迫條件下時(shí)，酶活性會隨之變化，可表現(xiàn)為抑制或誘導(dǎo)，還能反映能量代謝的變化［46］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中各農(nóng)藥單獨(dú)暴露組Na+/ K+-ATP酶和Ca2+-ATP 酶的活性被誘導(dǎo)，聯(lián)合作用則抑制了兩種ATP酶活性，提示雖然農(nóng)藥的濃度相同，聯(lián)合暴露對這兩種ATP酶活性的影響更大。ATP酶在細(xì)胞內(nèi)具有重要功能［47］，在離子平衡和滲透壓穩(wěn)態(tài)的維持方面具有重要作用［48］。K+和Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)相互協(xié)調(diào)和制約共同維持心肌細(xì)胞動作電位的穩(wěn)定［49］，Ca2+-ATP 酶活性的改變會影響心臟功能［50，51］，所以Na+/ K+-ATP 酶和Ca2+-ATP酶活性的改變也是農(nóng)藥暴露影響魚類胚胎心臟功能的原因。

4 結(jié)論

通過對腈苯唑、吡唑醚菌酯、惡霜靈、戊菌隆等4種新型農(nóng)藥在相同濃度下斑馬魚胚胎的暴露實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，在低濃度下4種農(nóng)藥單獨(dú)作用均可導(dǎo)致斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性，尤其心臟發(fā)育受毒性影響較敏感；從導(dǎo)致脊柱彎曲及心律不齊效應(yīng)來看腈苯唑毒性最強(qiáng)；Na+/ K+-ATP 酶和Ca2+-ATP酶是功能較廣泛的酶，聯(lián)合暴露抑制這兩種ATP酶的活性，可能對斑馬魚許多生理活動產(chǎn)生不利的影響。

［1］ 陳會柱, 聶文芳. 南漪湖農(nóng)藥污染現(xiàn)狀分析及治理對策探討［J］. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào), 2008, 14（13）：182-183.

［2］ 盧桂寧, 黨志, 陶雪琴, 等. 農(nóng)藥污染土壤的植物修復(fù)研究進(jìn)展［J］. 土壤通報(bào), 2006, 37（1）：189-193.

［3］單正軍, 陳祖義. 農(nóng)藥對水生生物的污染影響及污染控制技術(shù)［J］. 農(nóng)藥科學(xué)與管理, 2007, 28（10）：18-20, 14.

［4］唐夢齡, 王丹, 傅柳松, 等. 手性農(nóng)藥毒性機(jī)制的對映體選擇性［J］. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 13（4）：335-340.

［5］李朝陽, 張燁, 羅湘南, 等. 手性有機(jī)磷農(nóng)藥在土壤中對映體選擇性降解特征［J］. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 2009, 18（4）：1247-1250.

［6］李進(jìn)壽, 等. 多效唑暴露對褐菖鮋脾臟抗氧化防御系統(tǒng)的影響［J］. 廈門大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2013, 52（2）：267-272.

［7］張一賓. 2004年世界農(nóng)藥品種市場概況及2009年各類農(nóng)藥市場趨向［J］. 農(nóng)化新世紀(jì), 2006, 10：11-12.

［8］ 思彬彬, 楊卓. 甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑作用機(jī)理研究進(jìn)展［J］. 世界農(nóng)藥, 2007, 29（6）：5-9.

［9］ 劉錚錚. 環(huán)境中酰胺類除草劑的危害及檢測方法［J］. 南方農(nóng)業(yè), 2015, 9（27）：176-177.

［10］李龍雪, 鄭晶, 徐藝華, 等. 乙草胺對大鼠肝臟氧化性應(yīng)激狀態(tài)的影響［J］. 中華疾病控制雜志, 2016, 20（1）：54-57.

［11］張璇, 等. 手性除草劑異丙甲草胺毒理研究進(jìn)展［J］. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2015, 43（1）：152-158.

［12］徐妍, 劉蘋蘋, 等. 29%吡蟲啉·戊菌隆懸浮種衣劑高效液相色譜分析［J］. 農(nóng)藥科學(xué)與管理, 2006, 27（7）：5-7, 45.

［13］Institut Fran?ais de l’Environnement（IFEN）. Pesticides in Water［R］. Fifth Annual Report, 2001：1-67.

［14］Smalling KL, Kuivila KM, Orlando JL, et al. Environmental fate of fungicides and other current-use pesticides in a central California estuary［J］. Marine Pollution Bulletin, 2013, （73）：144-153.

［15］Zheng SL, Chen B, Qiu XY, et al. Distribution and risk assessment of 82 pesticides in Jiulong River and estuary in South China［J］. Chemosphere, 2016, 144：1177-1192.

［16］孫廣大. 九龍江口及廈門西海域水環(huán)境中103種農(nóng)藥污染狀況及其初步風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)［D］. 廈門：廈門大學(xué), 2009.

［17］Sanchez M. Physiological perturbations in several generations of Daphnia magna straus exposed to diszinon［J］. Ecotoxicol Environ Saf, 2000, 46：87-94.

［18］Schulte C, Nagel R. Test acute toxicity in the embryo of Zebrafish, Brachy Danio rerio, as an alternative to the acute fish test：Preliminary results［J］. ATLA, 1994, 22：12-19.

［19］Oberemm A. The use of a refined Zebrafish embryo bioassay for the assessment of aquatic toxicity［J］. Lab Animal, 2000, 29（7）：32-40.

［20］OECD. Draft proposal for a new guideline fish two generation test guideline［Z］. Washington, PDMVF, 2002.

［21］OECD. Guideline for testing of chemicals：Fish, embryo toxicity test with the Zebrafish（Danio rerio）［S］. Paris：OECD, 1996：62-76.

［22］Nagel R, Dar T. The embryo test with the Zebrafish（Danio rerio）general model in ecotoxicology and toxicology［J］. Altex, 2001, 19：38-48.

［23］劉迎, 胡燕, 姜蕾, 等. 5種酰胺類除草劑對斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性效應(yīng)［J］. 農(nóng)藥, 2014, 53（11）：806-808, 811.

［24］劉小寧. 煙嘧磺隆對斑馬魚胚胎孵化的影響［J］. 渭南師范學(xué)院學(xué)報(bào), 2013, 28（12）：130-132.

［25］Mu X, Chai T, Wang K, et al. Occurrence and origin of sensitivity toward difenoconazole in zebrafish（Danio rerio）during different life stages［J］. Aquat. Toxicol. 2015, 160：57-68.

［26］Mu XY, Pang S, Sun XZ, et al. Evaluation of acute anddevelopmental effects of difenoconazole via multiple stage zebrafish assays［J］. Environ Pollut, 2013, 175：147-157.

［27］Westerfield M. The Zebrafish Book. A guide for the laborstory use of zebrafish（Danio rerio）［M］. Eugene：University of Oregon Press, 2000.

［28］ 王思鋒, 等. 有機(jī)助溶劑對血管生成斑馬魚模型的適用性研究［J］. 實(shí)驗(yàn)動物與比較醫(yī)學(xué), 2008, 28（4）：238-242.

［29］Incardona JP, Carls MG, Day HL, et al. Cardiac arrhythmia is the primary response of embryonic Pacific Herring（Clupea pallasi）exposed to crude oil during weathering［J］. Environ Sci Techonl, 2009, 43：201-207.

［30］Chen ZY, Huang W, Dahme T, et al. Depletion of Zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct nechanisms［J］. Cardiovasc Res, 2008, 79：97-108.

［31］Peterson RE, Theobald HM, Kimmel GL. Developmental reproductive toxicity of dioxins and related compoumds：Cross species comparisons［J］. Crit Rev Toxicol, 1993, 23：283-335.

［32］Walker MK, Peterson RE. Aquatic toxicity of dioxins and related chemicals［M］. A. Schecter. Dioxins and Health. New York：Springer US, 1994：347-387.

［33］ 周炳, 趙美蓉, 黃海鳳. 4種農(nóng)藥對斑馬魚胚胎的毒理研究［J］. 浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 36（2）：136-140.

［34］ 徐永學(xué), 劉麗麗, 等. β-氯氰菊酯對斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性［J］. 中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志, 2013, 27（2）：256-262.

［35］劉迎, 胡燕, 姜蕾, 等. 6種表面活性劑對斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性效應(yīng)［J］. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2014, 9（6）：1091-1096.

［36］Lema SC, Schultz IR, Scholz NL, et al. Neural defects and cardiac arrhythmia in fish larvae following embryonic exposure to 2, 2’, 4, 4’-tetrabromodiphenyl ether（PBDE 47）［J］. Aquat Toxicol, 2007, 82（4）：296-307.

［37］Yamauchi M, Kim EY, Iwata H, et al. Toxic effects of 2, 3, 7, 8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin（TCDD）in developing red seabream（Pagrus major）embryo：an association of morphological deformities with AHR1, AHR2 and CYP1A expressions［J］. Aquat Toxicol, 2006, 80（2）：166-179.

［38］Johnson A, Carew E, Sloman KA. The effects of copper on the morphological and functional development of zebrafish embryos［J］. Aquat toxicol, 2007, 84（4）：431-438.

［39］陳玉翠, 陳錦云. 重金屬Cu2+、Cd2+、Hg2+對斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性效應(yīng)［J］. 南方水產(chǎn)科學(xué). 2016, 12（3）：35-42.

［40］韓春艷, 何曉琳, 李安文, 等. 酸堿脅迫對奧尼羅非魚幼魚鰓組織結(jié)構(gòu)及Na+/ K+-ATP酶活力的影響［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 44（11）：273-276.

［41］Cheng SH, Wing KWA, Hung SC, et al. Cellular and molecular basis of cadmium-induced deformities in Zebrafish embryos［J］. Environ Toxicol Chem, 2000, 19：3024-3031.

［42］ 衛(wèi)濤濤. 質(zhì)膜鈣離子ATP 酶［J］. 生物物理學(xué)報(bào), 2012, 28（7）：549-564.

［43］ Barrionuevo WR, Burggren WW. O2consumption and heart rate in developing zebrafish（Danio rerio）：Influence of temperature and ambient O2［J］. Am J Physiol, 1999, 276（2）：505-513．

［44］ Limas CJ, Olivari MT, Goldenberg IF, et al. Calcium uptake by car-diac sarcoplasmic reticulum in human dilated cardiomyopathy［J］. Carkiovasc Res, 1987, 21（8）：601-605.

［45］李云, 沈盎綠. 懸沙脅迫下熊本牡蠣的損傷及恢復(fù)［J］. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2012, 19（1）：138-144.

［46］張玉, 張建明, 劉海濤, 等. 內(nèi)蒙古不同水質(zhì)湖泊瓦氏雅羅魚Na+、K+-ATP 酶活性的研究［J］. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 34（1）：1-4.

［47］Yadwad VB, Kallapur VL, et al. Inhibition of gill Na+K+-ATPase activity in dragonfly larva, Pantala flavesens, by endosulfan［J］. Bull Environ Contam Toxicol, 1990, 44：585-589.

［48］Richards JG, Semple JW, Bystriansky JS, et al. Na+/K+-ATPase aisoform switching in gills of rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）during salinity transfer［J］. J Exp Bio, 2003, 206：4475-4486.

［49］Xu Y, Zhang Z, et al. The effects of intracellular Ca2+on cardiac K+channel expression and activity：novel insigyts from genetically altered mice［J］. J Physiol, 2005, 562（3）：745-758.

［50］Kodde IF, Vander SJ, Smolenski RT, et al. Metabolic and genetic regulation of cardiac energn substrate preference［J］. Comp Biochem Physiol A, 2007, 146：26-39.

［51］Dash R, Frand KF, Carr AN, et al. Gender influences on sarcoplasmic reticulum Ca2+-handling in failing human myocardium［J］. J cell Cardiol, 2001, 33（7）：1345-1353.

（責(zé)任編輯 李楠）

Toxic Effects of Four Currently-used Pesticides on Zebrafish Embryonic Development

WU Yu-qiong1CHEN Ying2HU Yong-le1ZUO Zheng-hong2WANG Chong-gang2
（1. College of Tea and Food Science，Wuyi University，Wuyishan 354300；2. School of life Sciences，Xiamen University，Xiamen 361005）

In order to study the effects of four pesticides（fenbuconazole，pyraclostrobin，metoxazon，and pencycurone），either individually or jointly，on the development of zebrafish embryos，seven experiments（blank control，solvent control，individual of 4 pesticides，and jointly combined four pesticides）were designed to treat zebrafish embryos for 72 h. The results showed that individual exposure to any of 4 pesticides at 50 ng/L led to the significant elevation on the rate of pericardial and yolk sac edema and the frequency of dorsal curvature in the larvae compared to the control. The exposure to fenbuconazole，metoxazon，and combined four pesticides resulted in a significant reduction in the heart rate and a significant increase in cardiac arrhythmia in the zebrafish larvae. The activities of Na+/K+-ATPase and Ca2+-ATPase of the embryos were significantly induced by the individual exposure to 4 pesticides，while the both activities were remarkably inhibited by the combined exposure. The results confirmed that these pesticides at environmental relevant concentration presented the clear toxicity to the development of fish embryo.

fenbuconazole；pyraclostrobin；metoxazon；pencycurone；combined exposure；Zebrafish；development of embryo

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0032

2017-01-20

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41376118），福建省2011協(xié)同創(chuàng)新中心（閩教科［2015］75號）

吳玉瓊，女，副教授，研究方向：環(huán)境毒理、食品營養(yǎng)與安全；E-mail：wyq93042@163.com