酵母抽提物對CHO細胞生長及抗體表達的影響

胡冬冬 趙亮 范里 劉旭平 鄧獻存 繆仕偉 譚文松

（華東理工大學 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237）

酵母抽提物對CHO細胞生長及抗體表達的影響

胡冬冬 趙亮 范里 劉旭平 鄧獻存 繆仕偉 譚文松

（華東理工大學 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237）

為了深入認識酵母抽提物在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞生長及單克隆抗體表達過程中所發(fā)揮的作用，綜合考察了傳代培養(yǎng)和批式培養(yǎng)過程中，不同濃度酵母抽提物條件下CHO細胞生長、抗體表達以及營養(yǎng)物代謝的情況。傳代培養(yǎng)過程中，低濃度（1 g/L）的酵母抽提物能夠顯著促進CHO細胞的生長，高濃度（5-10 g/L）的酵母抽提物則會顯著抑制CHO細胞的生長；同時，傳代過程中添加酵母抽提物不會影響種子細胞在批式培養(yǎng)中的表現(xiàn)。批式培養(yǎng)過程中，抗體比生成速率隨酵母抽提物濃度的提高而升高，濃度為10 g/L時獲得最高抗體產量。通過采用細胞生長階段低濃度、產物表達階段高濃度的添加策略，酵母抽提物在動物細胞培養(yǎng)過程中可發(fā)揮巨大的應用價值。

動物細胞培養(yǎng)；CHO細胞；酵母抽提物；單克隆抗體；氨基酸代謝

抗體類藥物以其高特異性、高親和力且對人體低毒害性等優(yōu)點，已成為當今醫(yī)藥產業(yè)的主流研發(fā)產品。動物細胞培養(yǎng)技術以其生產的抗體類蛋白結構穩(wěn)定且具有正確的糖基化結構而被產業(yè)界廣泛接受［1］。作為動物細胞培養(yǎng)的關鍵要素，培養(yǎng)基及其添加劑在抗體類藥物生產工藝中的作用毋庸置疑。蛋白水解物以其成本低廉、無毒害且效果顯著等優(yōu)勢，被廣泛作為血清替代物或營養(yǎng)增強劑添加于細胞培養(yǎng)基中［2，3］。

作為蛋白水解物中的一個大類，酵母抽提物（YE）因具有顯著促進重組蛋白表達的作用，在動物細胞培養(yǎng)領域獲得了廣泛的應用，且其批次間具有組分差異小、效果穩(wěn)定等優(yōu)點［4，5］。YE是以發(fā)酵得到的面包酵母或釀酒酵母為原料，經細胞自溶、酶解等過程將胞內蛋白、核酸等降解為多肽、氨基酸以及核苷酸等小分子，再通過超濾及干燥而得到的產品［6］。其中富含多肽、氨基酸、核苷酸、維生素以及微量元素等營養(yǎng)物質［7］。盡管YE在細胞培養(yǎng)領域的應用很多，但系統(tǒng)性地研究其在動物細胞培養(yǎng)過程中的作用以及使用策略的報道仍十分有限。因此，深入認識YE在動物細胞培養(yǎng)過程中如何發(fā)揮作用及其對關鍵參數(shù)的影響特性，將有助于YE乃至其他蛋白水解物在動物細胞培養(yǎng)領域的應用推廣。

為此，本研究以表達單克隆抗體的CHO細胞為研究對象，綜合考察了不同濃度YE對連續(xù)傳代、批式培養(yǎng)以及長期連續(xù)傳代后批式培養(yǎng)等過程中的細胞生長、代謝及產物表達的影響，旨為YE在動物細胞培養(yǎng)的生物制藥產業(yè)的應用以及高效無血清培養(yǎng)基的開發(fā)提供借鑒和依據(jù)。

1.2.1.2 批式培養(yǎng) 取指數(shù)生長期的種子細胞，經1 000 r/min離心5 min，棄上清，用新鮮BM培養(yǎng)基進行重懸。以1.0×106cells/mL左右的活細胞密度接種于50 mL細胞培養(yǎng)管，接種體積為20 mL。根據(jù)實驗設計額外添加所需的YE濃縮液（200 g/L）。將細胞培養(yǎng)管置于37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行懸浮培養(yǎng)，搖床轉速為220 r/min。每組實驗重復3次。培養(yǎng)過程中自第0天起每天取樣600 μL進行細胞計數(shù)，經10 000 r/min離心5 min后取上清液于-80℃保存，用于抗體產量和營養(yǎng)物及代謝物的檢測。

1.2.2 實驗方案 本研究所涉及的細胞實驗分為采用不同濃度YE的BM培養(yǎng)基對細胞進行連續(xù)傳代后接種于BM培養(yǎng)基進行批式培養(yǎng)和采用BM培養(yǎng)基對細胞進行連續(xù)傳代后接種于不同濃度YE的BM培養(yǎng)基進行批式培養(yǎng)兩大部分（圖1）。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用細胞株為表達單克隆抗體的重組CHO細胞株。實驗所用的基礎培養(yǎng)基（BM）為實驗室自主開發(fā)，所用的YE購自Kerry Group公司。其他培養(yǎng)基配制所用試劑均購自Sigma-Aldrich公司。培養(yǎng)基配制完后經0.22 μm微孔濾膜（Millipore）過濾除菌后使用。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

1.2.1.1 種子細胞傳代培養(yǎng) CHO細胞從細胞庫中復蘇后，采用基礎培養(yǎng)基重懸并接種于50 mL細胞培養(yǎng)管（瑞士TPP AG公司），接種體積為20 mL，置于37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行懸浮培養(yǎng)，搖床轉速為220 r/min。每48小時進行種子細胞傳代擴增，傳代后活細胞密度控制在（4-6）×105cells/mL。

圖1 細胞傳代培養(yǎng)和批式培養(yǎng)實驗流程示意圖

1.2.3 分析方法

1.2.3.1 細胞計數(shù) 細胞密度采用細胞計數(shù)儀（CounterStar）進行計數(shù)，并利用臺盼藍拒染法確定細胞的活性。

1.2.3.2 抗體濃度檢測 抗體濃度采用親和色譜的方法［8］進行檢測，色譜柱為POROS Protein A affinity column，4.0×50 mm（Applied Biosystems）。

1.2.3.3 葡萄糖、乳酸和氨的檢測 葡萄糖、乳酸和氨的濃度測定分別采用葡萄糖試劑盒（上海科欣生物技術研究所）、乳酸測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）和 Berthelot 尿素氮測定試劑盒（上海科欣生物技術研究所，不使用脲酶，改用NH4Cl作為銨離子標準液），操作按照試劑盒說明書進行。

1.2.3.4 培養(yǎng)上清中氨基酸的檢測 氨基酸檢測采用高效液相色譜法（安捷倫1260 HPLC）測定。樣品經OPA按說明書設置程序在線柱前自動衍生，經反相色譜柱（ZORBAX Eclipse AAA）分離后，采用DAD紫外檢測器（激發(fā)波長：338 nm，發(fā)射波長：390 nm）進行檢測。氨基酸標準品購自美國Thermo Fisher公司。

1.2.3.5 數(shù)據(jù)分析 比生長速率μ通過以下公式計算：

XV為活細胞密度（106cells/mL），t為培養(yǎng)時間（day）。抗體的比生成速率qp通過以下公式進行計算：

其中qp為抗體的比生成速率（mg/109cells/day或pg/cell/day）；P為抗體濃度（mg/L）；IVCD為活細胞密度對時間的積分（109cells·day/L）。

上清中營養(yǎng)物及代謝物的比生成/消耗速率參考抗體的比生成速率計算公式進行計算或采用濃度與IVCD進行線性擬合求斜率的方法獲得。

2 結果

2.1 連續(xù)傳代過程中YE對CHO細胞生長的影響

為了研究細胞傳代過程中YE的添加對CHO細胞生長的影響，分別考察了0、1、2、5和10 g/L YE濃度條件下CHO細胞的傳代情況。

圖2-A是CHO細胞在不同YE濃度條件下的細胞傳代曲線。結果表明，單獨的BM培養(yǎng)基以及不同YE濃度條件下CHO細胞均能以穩(wěn)定的比生長速率進行生長和連續(xù)傳代。同時，不同濃度的YE對細胞生長具有不同的影響。通過公式計算得到細胞平均比生長速率如圖2-B所示。當培養(yǎng)基中不含YE（0 g/L）時，細胞的比生長速率維持在0.78±0.04/d。隨著YE添加量的提高，細胞的比生長速率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。其中，當YE濃度為1 g/L時，細胞比生長速率達到最高，為0.86±0.03/d；YE濃度為2 g/L時，細胞比生長速率與未添加YE組基本一致，為0.76±0.05/d；當YE濃度繼續(xù)增加，細胞生長開始受到抑制，比生長速率顯著低于未添加YE組（P＜0.05），并于10 g/L時達到最低值，為0.53±0.06/d。

圖2 CHO細胞在不同YE濃度下的傳代曲線（A）以及比生長速率（B）

2.2 添加YE的基礎培養(yǎng)基長期傳代對CHO細胞的影響

通過以上連續(xù)傳代實驗可知YE會顯著影響CHO細胞在傳代過程中的生長情況。為了研究經YE長期傳代后的種子細胞在批式培養(yǎng)過程中的表現(xiàn)，采用BM培養(yǎng)基對上述連續(xù)傳代12-13次的CHO細胞進行批式培養(yǎng)。

2.2.1 細胞生長和產物表達 圖3-A所示為經不同YE濃度條件下連續(xù)傳代的CHO細胞接種至BM培養(yǎng)基中進行批式培養(yǎng)的細胞生長曲線。由圖可知，不同來源的CHO種子細胞經離心接種后在相同培養(yǎng)基（BM）中的生長情況基本一致，最大活細胞密度均在（4.9-5.2）×106cells/mL之間。圖3-B為批式培養(yǎng)過程中抗體的表達曲線。同細胞生長情況類似，不同實驗組中抗體表達也基本一致，均于第10天培養(yǎng)結束時達到最大產物濃度，約為200 mg/L。

圖3 不同YE濃度下長期傳代的CHO細胞在BM培養(yǎng)基中批式培養(yǎng)的生長（A）及抗體表達（B）情況

2.2.2 營養(yǎng)物和副產物代謝 表1所示為不同YE濃度下長期傳代的CHO細胞在批式培養(yǎng)過程中葡萄糖（Gluc）、乳酸（Lac）和氨（Amm）的代謝數(shù)據(jù)。總體而言，與細胞生長和產物表達類似，不同培養(yǎng)基傳代獲得的種子細胞在批式培養(yǎng)過程中的代謝特征基本一致，乳酸代謝同樣呈現(xiàn)先生成后消耗的趨勢。其中，在批式培養(yǎng)前期（0-2 d）乳酸對葡萄糖的得率系數(shù)（YLac/YGluc）呈現(xiàn)一定趨勢，隨著YE濃度的提高，YLac/YGluc從單純BM條件下的1.67降低至10 g/L YE時的0.99。

以上結果表明，CHO細胞連續(xù)傳代過程中YE的添加對其生長具有顯著影響。低濃度（1 g/L）的YE促進細胞生長，高濃度（5-10 g/L）的YE抑制細胞生長。CHO種子細胞在含YE的培養(yǎng)基中長期傳代對細胞在批式培養(yǎng)中的生長、產物表達及營養(yǎng)物代謝基本無影響。其中，僅YLac/YGluc隨YE濃度增加而降低。

2.3 YE對CHO細胞批式培養(yǎng)的影響

為了繼續(xù)研究YE作為培養(yǎng)基添加物在細胞批式培養(yǎng)過程中的影響，分別采用YE濃度為0、1、2、5和10 g/L的BM培養(yǎng)基進行CHO細胞批式培養(yǎng)實驗。

表1 不同YE濃度下長期傳代的CHO細胞在批式培養(yǎng)過程中葡萄糖、乳酸和氨的代謝情況

2.3.1 細胞生長和產物表達 圖4-A所示為CHO細胞在不同YE濃度的BM培養(yǎng)基中進行批式培養(yǎng)的細胞生長曲線。由圖可知，細胞在不同YE濃度的BM培養(yǎng)基中的生長情況存在較大差異。與傳代實驗中細胞生長情況相似，隨著YE濃度的提高，批式培養(yǎng)所能達到的最大活細胞密度呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。當YE濃度為1 g/L 時，批式培養(yǎng)所能達到的最大活細胞密度最高，為4.7×106cells/mL。隨著YE濃度的進一步提高（≥2 g/L），培養(yǎng)過程所能達到的最大活細胞密度逐漸下降。當YE濃度為10 g/L時，批式培養(yǎng)所能達到的最大活細胞密度下降到1.7×106cells/mL，細胞生長被顯著抑制。

抗體的表達同樣呈現(xiàn)出較大差異（圖4-B）。未添加YE時，產物終濃度最低。隨著YE濃度的提高，產物終濃度逐漸增加。當YE濃度為10 g/L時，產物終濃度最高，達到了330.4±5.4 mg/L。通過計算發(fā)現(xiàn)，產物比生成速率在不同YE濃度條件下同樣具有顯著差異且隨著YE濃度的提高而升高（圖4-C）。當YE濃度為10 g/L時，產物比生成速率最大，達到了25.8±0.2 pg/cell/d，為無YE條件下的4.3倍。

圖4 CHO細胞在不同濃度YE的BM培養(yǎng)基中批式培養(yǎng)的生長（A）、抗體表達（B）以及產物比生成速率（C）情況

2.3.2 營養(yǎng)物和副產物代謝 CHO細胞在不同YE濃度的BM培養(yǎng)基中進行批式培養(yǎng)的葡萄糖、乳酸和氨的代謝情況如表2所示。總體來說，葡萄糖、乳酸及氨的比消耗/生成速率均隨著培養(yǎng)基中YE濃度的提高而增加。其中，當YE濃度為10 g/L時，葡萄糖比生成速率最大，為2.24±0.01 mmol/109cells/d。同時，10 g/L條件下批式培養(yǎng)前期和后期的乳酸比生成和比消耗速率也均為最大，分別 達 到 了 4.20±0.02和0.73±0.01 mmol/109cells/ day；氨的比生成速率則達到了0.246±0.002 mmol/109cells/d，為無YE條件下的2.2倍。由于葡萄糖和乳酸比生成/消耗速率均隨著YE濃度提高而增加，最終計算得到的各YE濃度下批式培養(yǎng)前期和后期YLac/YGluc均基本一致。

YE中富含大量的小分子多肽及游離氨基酸。這些物質被認為是蛋白水解物中影響細胞生長及產物表達的主要有效成分［2］。因此，檢測培養(yǎng)體系中氨基酸的代謝情況有助于了解YE中這些營養(yǎng)物質在批式培養(yǎng)過程中所發(fā)揮的作用。圖5所示為批式培養(yǎng)過程中必需氨基酸（EAA，圖5-A）和非必需氨基酸（NAA，圖5-B）的代謝情況。當YE濃度在0-5 g/L之間時，除Gly和Ala呈生成狀態(tài)外，絕大多數(shù)氨基酸比消耗速率均隨著YE濃度的提高而增加。當YE達到10 g/L時，氨基酸代謝表現(xiàn)出較大差異。其中，Asn和Gln的比消耗速率顯著高于其他實驗組，Gly和Ala的比生成速率也顯著高于其他實驗組。必需氨基酸中Val、Ile和Lys出現(xiàn)了凈生成的狀態(tài)。同時，許多其他氨基酸，如Thr、Trp、His、Arg、Tyr以及Cys等，比消耗速率也出現(xiàn)了明顯下降，而由2.3.1的結果可知10 g/L條件下產物比生成速率卻是最高的。因此，猜測該條件下細胞可能更多地利用多肽中的氨基酸進行代謝和物質合成。

以上結果表明，批式培養(yǎng)過程中添加YE能夠顯著影響細胞生長、產物表達和營養(yǎng)物代謝。低濃度（1 g/L）的YE促進細胞生長，高濃度（10 g/L）的YE抑制細胞生長。產物比生成速率隨著YE濃度的提高而升高。綜合細胞生長與產物比生成速率隨YE濃度的變化情況，10 g/L的添加量使得最終的產物濃度最高。同時，YE的添加能夠提高細胞對營養(yǎng)物質的利用，尤其是降解和利用YE中的多肽組分。

表2 CHO細胞在不同YE濃度的批式培養(yǎng)過程中葡萄糖、乳酸和氨的代謝情況

圖5 CHO細胞在不同YE濃度的批式培養(yǎng)過程中必需氨基酸和非必需氨基酸的代謝情況

3 討論

在細胞長期連續(xù)傳代方面，YE的添加對細胞比生長速率影響顯著，低濃度（1 g/L）的YE有利于CHO細胞的生長，而高濃度（5-10 g/L）的YE則會抑制細胞的生長。YE源自于酵母細胞的自溶和酶解，其中包含多肽、氨基酸、寡糖、核苷酸、維生素以及微量元素等多種物質［7］。諸多文獻報道，非葡萄糖碳源［9］、寡肽［10，11］、核苷酸［12，13］及微量元素［14］等物質的添加均能促進細胞的生長。因此，低濃度的YE可能彌補了基礎培養(yǎng)基中缺乏的部分營養(yǎng)物，從而有利于細胞的生長。YE中同時富含高比例的小分子有機物和無機鹽類，1 g/L的添加量會使得培養(yǎng)體系的滲透壓提高6-10 mOsm/Kg［5］。本研究中YE濃度為5-10 g/L時，培養(yǎng)體系滲透壓達到了360-420 mOsm/Kg，故而過高的滲透壓可能是抑制細胞生長的主要原因［15］。將在不同濃度YE的基礎培養(yǎng)基中長期傳代后的CHO細胞進行批式培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)，傳代過程中YE的添加量對細胞在批式培養(yǎng)過程中的生長及產物表達均無顯著影響。這說明YE可安全應用于種子細胞擴增階段的培養(yǎng)基中。營養(yǎng)物代謝方面，總體而言影響不顯著，僅乳酸對葡萄糖的得率系數(shù)（YLac/YGluc）隨YE添加量的提高而降低。這表示消耗單位葡萄糖生成的乳酸減少，進入TCA循環(huán)的比例提高，其物質代謝效率更高，能夠為細胞供應更多能量。

在細胞批式培養(yǎng)方面，YE對細胞生長的影響同連續(xù)傳代類似，低濃度（1 g/L）促進細胞生長，高濃度（10 g/L）抑制細胞生長。抗體的比生成速率則隨著YE濃度的提高而增加。YE對重組蛋白表達的促進作用已有諸多報道［4，16，17］。研究發(fā)現(xiàn)，YE對蛋白表達的促進作用可能與mRNA轉錄水平的提高相關［5］。因YE中化學成分復雜，僅能結合相關研究猜測其中發(fā)揮效用的物質可能為有機酸，如丁酸［18］、戊酸［19］，活性多肽［10］或者其他小分子物質［20］等。同時，高濃度的YE能夠顯著提升培養(yǎng)體系的滲透壓，而高滲條件有利于CHO細胞對胞內重組蛋白的分泌［21］。因此，借助于高滲效應，YE對CHO細胞表達重組蛋白的促進作用更加突出。在營養(yǎng)物代謝方面，YE的添加能夠提高細胞對葡萄糖的攝取速率，促進了細胞對葡萄糖的利用。同時YLac/YGluc基本維持一致，即消耗單位葡萄糖進入TCA循環(huán)的比例相近，物質代謝效率相似。因此，高YE濃度條件下細胞對葡萄糖比消耗速率較高，單位細胞分解葡萄糖獲取能量的速率較大，充裕的能量供給同樣有助于重組蛋白的表達。這一現(xiàn)象在文獻中也有所報道［22，23］。高濃度（10 g/L）的YE條件下，多種必需氨基酸出現(xiàn)了凈生成的情況。而細胞無法通過其他物質自行合成這些氨基酸，可能的解釋是細胞利用了YE中的多肽并將其降解成了游離氨基酸［24］。這一現(xiàn)象說明YE中的多肽在過程中被細胞利用，也為文獻中所提及的細胞更傾向于利用水解物中寡肽的觀點提供了一個實例［25，26］。

傳代擴增和批式培養(yǎng)是CHO細胞表達重組蛋白生產工藝中的兩個典型培養(yǎng)過程。傳代擴增階段，細胞比生長速率的高低是其過程優(yōu)劣的重要指標；而在批式培養(yǎng)過程中，較高的產物比生成速率往往意味著更高的體積產率和高效的產能。總體而言，這兩大過程的目標和需求具有一定的“矛盾性”。本研究發(fā)現(xiàn)，YE可同時滿足這兩大過程的需求，但需要采用不同的添加策略。這也為以往研究文獻中YE添加濃度的差異［4，5，17］提供了合理的解釋。綜上所述，通過采用細胞生長階段低濃度、產物培養(yǎng)階段高濃度的添加策略，可將YE高效應用于表達重組蛋白的CHO細胞培養(yǎng)過程。

4 結論

本研究綜合考察了YE在CHO細胞傳代擴增階段以及批式培養(yǎng)階段對細胞生長及抗體表達的影響。結果表明，低濃度（1 g/L）的YE在這兩個階段均能促進CHO細胞的生長而高濃度（5-10 g/L）時則顯著抑制其生長；抗體的比生成速率則隨著YE濃度（0-10 g/L）的提高而增加。綜合而言，YE的使用宜選擇細胞生長階段低濃度、產物表達階段高濃度的添加策略。YE在動物細胞培養(yǎng)領域具有巨大的應用價值和潛力。

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（責任編輯 狄艷紅）

Effects of Yeast Extract on Cell Growth and Antibody Production in CHO Cell Culture

HU Dong-dong ZHAO Liang FAN Li LIU Xu-ping DENG Xian-cun MIU Shi-wei TAN Wen-song
（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237）

The objective is to get insights into the effects of yeast extract on Chinese hamster ovary（CHO）cell growth and monoclonal antibody production. We comprehensively investigated the cell growth，antibody production and nutrients metabolism at different yeast extract concentrations in continuous passage culture and batch culture. It was found that yeast extract significantly improved CHO cell growth at low concentration（1 g/L）and remarkably inhibited CHO cell growth at high concentration（5-10 g/L）during continuous passage culture. Additionally，the result of seed cells in batch culture was not influenced while adding the yeast extract during continuous passage culture. Supplementing yeast extract in batch culture medium，a positive correlation was found between specific antibody production rate and the yeast extract concentration with a maximal antibody titer achieved at yeast extract concentrations of 10 g/L. In conclusion，yeast extracts can make a great contribution on animal cell culture process with a strategy of low concentration added at cell growth phase and high concentration added at protein-production phase.

animal cell culture；CHO cells；yeast extract；monoclonal antibody；amino acid metabolism

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1020

2016-11-10

國家自然科學基金項目（21406066），國家重大專項（2013ZX10004003-003-003）

胡冬冬，男，博士研究生，研究方向：動物細胞與組織工程；E-mail：dongdonghu@mail.ecust.edu.cn

趙亮，男，助理研究員，研究方向：動物細胞與組織工程；E-mail：zhaoliang@ecust.edu.cn

譚文松，男，教授，研究方向：動物細胞與組織工程；E-mail：wstan@ecust.edu.cn