雌酮脅迫農田土壤微生物群落結構變化研究

田琳 張珣

（沈陽大學環境學院 區域污染環境生態修復教育部重點實驗室，沈陽 110044）

雌酮脅迫農田土壤微生物群落結構變化研究

田琳 張珣

（沈陽大學環境學院 區域污染環境生態修復教育部重點實驗室，沈陽 110044）

雌酮是具有雌效應的天然類固醇雌激素之一，具有高毒性、難降解的特性，可通過食物鏈蓄積于體內，威脅人類和動物的健康。使用PCR-DGGE技術分析雌酮脅迫下農田土壤微生物群落結構變化。結果表明，雌酮濃度越高，對微生物種群的影響越深，種群的親緣關系也就越復雜。在雌酮濃度為500 ng/kg至2 000 ng/kg時，微生物群落多樣性隨著E1濃度的增加而減小，超過某一值時其多樣性則會迅速增加，繼續增大E1濃度，多樣性增加趨勢則逐漸變緩。雌酮在微生物作用下可以轉變為雌二醇、雌三醇和結合態的E1-3G，這種相互轉變也會給微生物菌群多樣性帶來更加復雜的變化。

雌酮；農田土壤；微生物群落結構；PCR-DGGE

類固醇雌激素作為環境激素中雌激素效應最高一類物質［1］，環境曝露會導致動物雄性繁殖能力下降、生殖系統發育異常，男性精子數量減少、質量下降，女性生理現象混亂，內分泌系統異?？簥^或抑制，神經內分泌功能紊亂，激素依賴性器官腫瘤發病率明顯升高等［2，3］。雌酮（Estrone，E1）作為具有雌效應的天然類固醇雌激素之一，在極低的濃度水平即可使水生生物性腺功能異常，具有高毒性、難降解的特性，通過食物鏈在體內蓄積［4］，進而威脅人類和動物的健康。類固醇雌激素主要由人與動物卵巢合成分泌，通過污水處理廠和禽畜養殖場兩種主要途徑進入環境［5，6］。研究表明處于孕期的女性E1排泄量最多可達到 1 194 μg/d［7］。國內外各種水體及污水廠出水中均檢測到較高濃度的E1［8，9］。2007年，中國天然類固醇雌激素的總排放量高達10.6 t［10］。E1被土壤微生物降解轉化的同時，微生物也會受到E1的影響（如細胞形態結構改變、酶的產生及效用改變和DNA突變等），具體表現在種群的生長與消亡；不同種微生物對E1的敏感程度不同，土壤微生物群落作為混合性的微生物群，E1作用下表現為群落結構發生變化。土壤微生物群落結構的改變將直接影響該植被上農作物的生長狀況，進而影響高級生態系統的健康。

本文以雌酮作為脅迫因子，以農田土壤作為實驗材料，通過PCR-DGGE技術探討不同雌酮濃度、不同培養時間下農田土壤微生物群落變化，旨在了解雌酮脅迫下農田土壤微生物群落動態變化特征。

1 材料與方法

1.1 材料

供試土壤：農田土壤，采自沈陽農業大學水稻試驗田。該土壤常年種植水稻，并未施用畜禽糞便或市政污水。主要理化性質如下：有機質含量23.6 g/kg，總氮1.54 g/kg，有效磷71.6 mg/kg，總磷1.14 g/kg，速效鉀120 mg/kg，總鉀16.7 g/kg，pH值7.62，類固醇雌激素未檢出。

1.2 方法

1.2.1 實驗設計 本實驗的主要培養裝置為塑料盒，其長度、寬度和高度分別為490、350和160 mm。將15 kg的農田土壤裝入塑料盒，500 mL不同濃度的雌酮溶液分別加入到各塑料盒中，最后使得各裝置的終含量分別為500、1 000、1500和2 000 ng/kg，于室溫培養。通過攪拌器使各溶液與農田土壤樣品混合，以確保所有的農田土壤樣品充分混合。每個塑料盒每次收集20 g再次充分混合的土壤樣品，重復3次，曝露時間分別為 0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55和60 d。將樣品保存在-80℃用于分子生物學分析。

1.2.2 土壤中總DNA提取 本實驗使用E.Z.N.ATMSoil DNA Kit試劑盒（美國OMEGA公司）提取農田土壤樣品中的總DNA，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其提取結果?？侱NA保存于-20℃冰箱中。

1.2.3 PCR-DGGE分析 PCR的擴增區域是細菌16S r DNA的V3可變區，選用引物對338F和518R。選用的上游引物P1（5'端連接GC夾）為GC-338F（5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGGG CCT ACG GGA GGC AGC AG-3'）和下游引物P2為518R（5'-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3'）［11］，直接對總DNA進行PCR擴增。PCR反應體系為：模板DNA 0.1 μL，引物P1和P2各0.75 μL，2×GoTaq buffer 25 μL，無核酸酶水23.4 μL。PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，65℃退火1 min（每個循環降低1℃），72℃延伸1 min，一共10個循環；然后94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環；最后72℃延伸10 min。PCR擴增產物用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。所有的PCR產物約240 bp，可進行DGGE分析。

DGGE實驗按照Webster等［12］方法進行并適當修改。PCR 產物分離使用 DCodeTM 通用突變檢測系統（Bio-Rad，Dcode，USA.）進行DGGE電泳分析。DGGE電泳條件為8%聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度為35%-65%。電泳電壓為150 V，電泳溫度為60℃，緩沖體系是1×TAE緩沖液，電泳時間為7.5 h。電泳后，將凝膠用EB（溴化乙錠）染色30 min并在紫外光下觀察。為獲得清晰的圖像，將使用凝膠照片系統（GelDoc，Bio-Rad，USA.）進行拍照。

1.2.4 DGGE圖譜分析 使用Quantity one圖像分析軟件對DGGE圖譜進行分析（4.0版本，Bio-Rad，USA.）。該軟件能夠識別同一個凝膠不同泳道上占據相同位置的條帶。兩個樣本的相似性可以通過戴斯系數（Cs）條帶模式進行估測（公式1）：

其中，j是兩條DGGE泳道中共有的條帶數，a和b分別是兩條DGGE泳道各自的條帶數量。用非加權平均法（UPGMA）檢驗農田土壤樣品的相似性。

基于DGGE條帶數據而進行的香農-威納指數（H'），豐富度（S）和均勻度（E）的計算比較了細菌多樣性的變化。H'計算公式如下（公式2） pi是指i條帶出現在一條泳道中的概率。S 是一條凝膠泳道的總條帶數，E計算方法為H'/ lnS。

2 結果

2.1 雌酮對微生物群落結構的影響

雌酮濃度為500、1 000、1 500、2 000 ng/kg時各個不同的時間段的細菌的16S rDNA基因的PCR產物DGGE電泳圖譜如圖1，曝露時間分別為0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55和 60 d。在分離圖譜中，每個可以區分的條帶都代表一個獨立的細菌種群［13］。E1對農田土壤微生物群落結構變化產生影響。例如，條帶1與條帶4只存在于E1濃度為500和1 000 ng/kg的土壤樣本中，條帶6只存在于1 500與2 000 ng/kg濃度下，且顏色均是從無到有并逐漸變亮；而條帶5在4個濃度下均存在。條帶2與3僅存在于E1濃度為500 ng/kg下農田土樣中，區別在于條帶3在曝露前期就出現，條帶2是從曝露中期出現。條帶7僅出現在E1濃度為2 000 ng/kg的曝露前期，急速出現至鼎盛后又迅速消失。條帶8出現于E1濃度為2 000 ng/kg的農田土樣曝露中后期。

圖1 農田土壤在不同雌酮濃度不同暴露時間細菌16S rDNA的DGGE分析

2.2 相似性分析結果

圖2是不同雌酮濃度下不同曝露時間的農田土壤樣本與原始土壤樣本的戴斯系數。與初始農田土壤樣品相比，在第一個5 d內，由于剛加入雌酮，土壤微生物群落原始平衡被破壞，E1濃度為500 ng/kg的土壤樣本的Cs平均下降了59.7%，E1濃度為1 000 ng/kg的土壤樣本的Cs平均下降了17.1%，E1濃度為15 00 ng/kg的土壤樣本的Cs平均下降了32.8%，E1濃度為2 000 ng/kg的土壤樣本的Cs平均下降了62.8%。E1濃度為1 500 ng/kg的農田土壤的Cs直降到第10 d才暫時停止下降趨勢，降低了55%。曝露時間為60 d時，E1濃度500 ng/kg農田土壤樣品的Cs與初始樣品只有30.6%的相似性；曝露時間為25 d時，E1濃度2 000 ng/kg農田土樣的Cs僅為21.3%。E1濃度為 500 ng/kg的農田土壤在第一個5 d之后，隨著曝露時間的增加Cs波動平緩。E1濃度為1 000 ng/kg的農田土壤在曝露前期Cs的變化較緩和，第30 d之后Cs隨著曝露時間的增加而劇烈變化。E1濃度為1 500 ng/kg的農田土壤樣本在曝露時間內Cs始終都在劇烈波動。E1濃度為2 000 ng/kg的農田土壤的Cs在加入E1的前期劇烈波動，從第25 d到第40 d時波動相對平緩，第40 d后又出現巨大波動。

不同雌酮濃度的農田土壤樣品，其系統進化樹圖譜有著顯著差異（圖3）。在E1刺激的農田土壤樣品中微生物群落結構表現出很大程度的變化，特別是E1濃度為2 000 ng/kg的農田土壤樣品。結果表明，E1濃度越高，對微生物種群的影響越深，種群的親緣關系也就越復雜。E1濃度為500 ng/kg、1 000 ng/kg、1 500 ng/kg、2 000 ng/kg時，曝露內所有實驗土壤的遺傳相似性分別為37%、71%、47%和39%。

2.3 多樣性分析結果

多樣性指數能夠有效地表征微生物群落結構的多樣性。香農-維納指數越高，微生物群落的多樣性越大。除香農-維納指數外，豐富度和均勻度也是多樣性指數表征的重要參數：物種的總數即物種豐富度（S），不同物種個體數量的分布即物種均勻度（E）。

雌酮污染農田土壤樣本中微生物群落的多樣性指數如表1所示。在曝露前，原農田土壤的H'在3.581-3.582之間，S 均為53，E 在0.908-0.909之間，說明在添加污染物前，農田土壤系統具有穩定的微生物群落結構和活性，同時具有基本的同質性。橫向對比不同E1濃度發現，濃度為500 ng/kg和1 500 ng/kg的農田土壤中微生物群落多樣性指數明顯大于另外兩組。E1濃度為500 ng/kg時農田土壤H'、S、E在曝露期間明顯高于其余E1濃度曝露下的H'、S、E。E1濃度為1 000 ng/kg的農田土壤的多樣性隨著曝露時間的增加總體呈下降趨勢；而E1濃度為500 ng/kg、1 500 ng/kg和2 000 ng/kg的農田土壤的多樣性隨著時間的推移總體趨勢在逐步增長，且濃度為2 000 ng/kg時其增長趨勢明顯高于濃度為500 ng/kg與1 500 ng/kg時的增長趨勢。縱向對比曝露時間，E1濃度為500 ng/kg農田土壤在第30 d時H'、S、E均高于其余曝露時間，但總體波動都比較平緩。E1濃度為1 000 ng/kg的土樣在第20 d時H'、S、E達到最高值，之后在緩慢下降。濃度為2 000 ng/kg時，第40 d時的H'、S、E均達到最大值，且該濃度下多樣性總體波動程度高于濃度為500 ng/kg和1 000 ng/kg時。E1濃度為1 500 ng/kg的農田土壤在曝露時間內，當S達到最大時，H'、E并沒有達到最大，相比與其他濃度的微生物群落，此濃度下微生物群落顯然是個不穩定的體系。

圖2 不同雌酮濃度不同暴露時間下農田土樣微生物群落的戴斯系數

3 討論

本實驗相似性與多樣性分析結果表明，在E1濃度為500 ng/kg至2 000 ng/kg之間，隨著E1濃度的增大，其對微生物的影響增大，微生物生長受到抑制，多樣性降低；可能因為原有的優勢微生物因E1濃度的增大而逐步消亡（例如，條帶2、3代表的種群），或者有可能已經出現新物種，只是新物種仍處于適應生長階段，其在數量上并沒有占據主要地位，故而在E1濃度為1 000 ng/kg的曝露后期微生物群落多樣性都在不斷下降；當超過某一濃度時，其對微生物的影響促使抗E1和可以有效降解E1的新型微生物（如條帶6代表的種群）迅速適應、大量生長并逐漸占據主導地位，使得在E1濃度為1 500 ng/kg時，整個曝露期間內微生物多樣性呈現平穩增長；繼續加大濃度，E1為2 000 ng/kg時雖然在整個曝露階段微生物多樣性仍在緩慢持續增長，但是同1 500 ng/kg時增長趨勢相比，此濃度下的增長趨勢變緩，其原因有可能是原優勢微生物受到一定的抑制作用進而消亡（例如，條帶7所代表的種群），或者新式微生物出現并處于逐步適應階段（例如，條帶8所代表的種群）。

E1在土壤中的吸附量的多少會影響其被微生物降解轉化的多少。劉建林［14］與吳喬龍［15］的研究表示，雌激素在土壤中吸附是自發放熱過程，且在24 h內達到吸附平衡。而E1在土壤中的吸附作用受離子強度、pH、腐殖酸及其他共存污染物的共同作用。石月娥［16］發現E1在砂質壤土和粉砂性粘土中的吸附平衡時間延長約300%。

研究學者發現，E1與E2在生物降解過程中可以發生相互轉化或單向轉化，且在E1的降解過程中發現了E3［17］。同時E1在微生物酯化作用下也可形成結合態的E1-3G（G是葡萄糖苷酸）。類固醇雌激素之間的相互轉化也會給微生物菌群多樣性帶來更為復雜的變化。張照韓［18］通過等摩爾比與等毒性單位復合的方式研究二元雌激素復合效應發現，除EE2和E1復合體系呈現拮抗作用外，其它復配體系均呈現協同效應，且復合作用效應的類型及強度與共存物質的種類及各種物質的比例有關。

王凌云［19］發現E1分子中C17-C13鍵級最低，因此E1可能會通過環開裂生成小分子羧酸等易降解物質。Ascenzo等［20］發現，即使經過最徹底的發酵E1仍有一定量的殘留。目前對于環境介質（如土壤）中類固醇雌激素的代謝過程仍沒有確定的途徑，本實驗可以進一步研究在該類農田土壤下E1的轉化途徑與代謝過程。不同種類固醇雌激素對微生物菌群的影響不同，這種情況與復合污染物類似。故針對單一污染物下分析微生物群落變化存在不確定的因素。因此，后續研究擬篩選有效降解類固醇雌激素的降解菌，并研究降解菌的降解特性。

圖3 不同雌酮濃度不同暴露時間農田土樣的系統發育進化樹

表1 不同雌酮濃度刺激農田土壤的微生物群落多樣性指數

4 結論

PCR-DGGE指紋技術可以有效分析雌酮污染農田土壤樣品中的微生物群落結構的動態變化。雌酮濃度和曝露時間的變化能夠對微生物的活性和功能產生影響，進而造成微生物群落變化。

（1）經戴斯系數與系統進化樹圖譜分析可知，雌酮濃度越高，對微生物種群的影響越深，種群的親緣關系也就越復雜。（2）經不同曝露時間與不同雌酮濃度微生物群落多樣性指數對比分析可知，在一定濃度范圍內，微生物群落多樣性隨著E1濃度的增加而減小，超過某一值時其多樣性則會迅速增加，繼續增大E1濃度，多樣性增加趨勢則逐漸變緩。（3）雌酮可以轉變為E2、E3以及在微生物酯化作用下形成結合態的E1-3G，這種相互轉變也會給微生物菌群多樣性帶來更加復雜的變化。

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（責任編輯 狄艷紅）

Study on the Changes of Soil Microbial Community Structure in Farmland by Estrone Stress

TIAN Lin ZHANG Xun
（College of Environment/Key Laboratory of Regional Environment and Eco-Remediation，Ministry of Education，Shenyang University，Shenyang 110044）

Estrone is one of natural steroidal estrogens which have female effect and characterizes by high toxicity and refractory. It can accumulate in the body through the food chain，threatening human and animal health. In this study，PCRand DGGE was used to analyze the variation of the microbial community structure in estrone-contaminated farmland soil samples. The results showed that the higher the concentration of estrone，the deeper the effect on the microbial population，and the more complex the phylogenetic relationship among populations. When the concentration of estrone was 500 ng/kg to 2 000 ng/kg，the diversity of microbial community decreased with the increase of E1 concentration；the diversity increased rapidly when the concentration of estrone was over a certain value，and the increase trend of diversity gradually became slower when the concentrations of E1 continuously increased. Estrone in the presence of microorganisms can be transformed to estradiol，estriol and bound-state E1-3G，this transformation brings more complex changes to the microbial community diversity.

estrone；soil in farmland；microbial community structure；PCR-DGGE

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-0861

2016-09-12

國家自然科學基金面上項目（41472237），遼寧省高等學校優秀人才支持計劃項目（LJQ2015077），遼寧省科學技術計劃面上項目（201602530）

田琳，女，碩士研究生，研究方向：土壤污染生態修復治理；E-mail：opqrvu@163.com

張珣，男，副教授，研究方向：土壤污染生態修復治理；E-mail：zhangeasy@sohu.com