橙皮素衍生物-XIV調控PTCH1基因甲基化對佐劑性關節炎大鼠FLS炎癥的影響

孫正浩，劉彥會，劉駿達，徐丹丹，李小楓，張義龍，孟曉明，黃 成，李 俊

(1.安徽醫科大學藥學院，安徽省重大自身免疫性疾病重點實驗室，安徽省創新藥物產業共性技術研究院，2.抗炎免疫藥物教育部重點實驗室，3. 安徽醫科大學肝病研究所，安徽 合肥 230032)

橙皮素衍生物-XIV調控PTCH1基因甲基化對佐劑性關節炎大鼠FLS炎癥的影響

孫正浩1,2,3，劉彥會1,2,3，劉駿達1,2,3，徐丹丹1,2,3，李小楓1,2,3，張義龍1,2,3，孟曉明1,2,3，黃 成1,2,3，李 俊1,2,3

(1.安徽醫科大學藥學院，安徽省重大自身免疫性疾病重點實驗室，安徽省創新藥物產業共性技術研究院，2.抗炎免疫藥物教育部重點實驗室，3. 安徽醫科大學肝病研究所，安徽 合肥 230032)

目的 研究5-(4-氯苯乙基)亞胺基-7-氧-乙酰-4-氯苯乙胺基橙皮素，即橙皮素衍生物XIV號(hesperidin derivative-XIV，HDND-XIV)對佐劑性關節炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠成纖維滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)炎癥的影響及分子機制。方法 弗氏完全佐劑(Freund′s complete adjuvant，FCA)誘導Sprague Dawley(SD)大鼠AA模型(FCA，0.01 ml·kg-1)，造模后24 d處理并提取原代FLS；MTT法檢測HDND-XIV的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50); 酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)測定細胞培養基中FLS分泌的白細胞介素-6(interleukin- 6，IL-6)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)和白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)水平; Lipofectamine2000轉染試劑盒將過表達質粒GV230-MeCP2轉染入AA FLS;Western blot法檢測MeCP2、PTCH1、Gli1、Shh蛋白的表達;焦磷酸測序法定量檢測各組PTCH1基因的甲基化程度。結果 MTT法檢測HDND-XIV在FLS上的IC50值為161 μmol·L-1；ELISA篩選出HDND-XIV最佳抗炎濃度為10 μmol·L-1;Western blot結果顯示經HDND-XIV刺激后，AA FLS中PTCH1表達升高，MeCP2、Gli1和Shh表達下降; 焦磷酸測序顯示經HDND-XIV刺激后，AA FLS中PTCH1基因甲基化程度明顯降低；在AA FLS中過表達MeCP2后加HDND-14刺激, Western blot結果顯示成功過表達MeCP2后,PTCH1蛋白表達下降, 而Gli1和Shh蛋白表達升高, ELISA結果顯示IL-6、IL-1β、TNF-α水平也升高。結論 HDND-XIV對于FLS有較明顯的抗炎活性, 其機制可能與抑制MeCP2的表達，降低PTCH1基因甲基化程度有關。

HDND-XIV；SD大鼠；佐劑性關節炎；甲基化；Hedgehog；成纖維滑膜細胞；過表達；炎癥

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種自身免疫炎癥疾病，其主要特征是關節腫脹與不可逆性的損壞，慢性的滑膜炎癥[1]。成纖維滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)在RA發病中顯示出獨特的特性，參與血管新生，免疫應答，關節損傷等過程，并產生炎性細胞因子促進炎癥的發生[2]，慢性炎癥導致多種炎癥因子異常并使關節損傷[3]。文獻報道，特定基因的甲基化參與RA的發病[4]，甲基CpG結合蛋白2(methyl CpG binding protein 2，MeCP2)是MBD家族的成員，可以特異性的識別和綁定在甲基化的DNA序列上，從而抑制基因的轉錄，也可招募甲基化酶，組蛋白去乙酰化酶甲基化DNA[5]。

Hedgehog信號通路對組織的形態和生長給予調控，Patch1(PTCH1)在此通路中是一個負調控基因[6]。目前研究表明[7-8]，在胃癌、肝細胞癌等癌癥中，癌細胞異常增殖，PTCH1基因發生高甲基化。RA中FLS呈腫瘤細胞樣增殖[9]，鑒于癌癥與RA在細胞增殖方面的共性，靶向調控PTCH1基因的甲基化，可能成為治療RA的新療法。橙皮素是二氫黃酮的一種，有著抗氧化和抑制炎癥介質產生的藥理作用[10]。為了克服半衰期短，口服給藥后失效快的問題，本課題組設計合成了橙皮素衍生物XIV號(hesperidin derivative-XIV，HDND-XIV)，并進行抗炎篩選，其化學式為C34H32Cl2N2O6，分子質量為635.5380，結構如Fig 1。

因佐劑性關節炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠模型具有與RA相似的病理學特征和免疫學變化，所以廣泛用于研究RA的發病和篩選新藥治療風濕性疾病[11]，本實驗即采用AA大鼠為動物模型，重點研究HDND-XIV對PTCH1基因甲基化的調控。基于FLS在RA發病中的重要作用，以FLS為研究對象，通過觀察HDND-XIV對AA FLS分泌白介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)的影響和對AA FLS表達MeCP2，PTCH1和Hedgehog信號通路相關蛋白Gli1和Shh的影響，以及HDND-XIV對PTCH1基因甲基化的調控，研究HDND-XIV抑制FLS炎癥可能存在的機制，為防治RA提供理論依據。

Fig 1 Chemical formula

1 材料

1.1 實驗動物 清潔級♂Sprague Dawley(SD)大鼠30只，體質量(200±20) g，購自安徽醫科大學動物實驗中心。溫度：(25±1)℃，濕度：40%～75%，自由飲食飲水。

1.2 藥物與試劑 HDND-XIV由安徽醫科大學藥學院提供，濃度為0.1 mol·L-1；弗氏完全佐劑(Freund′s complete adjuvant，FCA)及噻唑藍MTT購自美國Sigma公司；澳洲胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；高糖DMEM購自Hyclone公司；lipofectamine 2000轉染試劑盒及Opti-MEM購自Invitrogen公司；MeCP2抗體及Shh抗體購自Abcam公司；β-actin抗體購自北京中杉金橋公司；Gli1及PTCH1抗體購自北京Bioss公司；IL-6、TNF-α、IL-1β酶聯免疫試劑盒(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)購自武漢Elabscience公司；辣根標記山羊抗兔IgG及辣根標記山羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋公司。

2 方法

2.1 動物模型的制備 實驗動物隨機分為正常組、AA組，每組15只。適應性喂養1周后，每只大鼠左后足趾皮內注射FCA(0.01 ml·kg-1)，制備AA大鼠，即模型組大鼠。左后足趾皮內注射等量的PBS，作為正常對照組大鼠。

2.2 原代FLS的提取與培養 造模24 d后將大鼠處死，在新潔爾滅溶液中浸泡約15 min，沿膝關節正中縱行切開并分離肌肉，關節囊的滑膜層和纖維層，取出滑膜組織，每只大鼠可采集15 mg～20 mg。將取出的滑膜組織用Hank′s液反復洗3次，洗至白色再在DMEM中清洗3次。剪成1 mm3的小塊，剪的過程中保持組織塊的濕潤。將細胞培養瓶底板浸潤DMEM培養基，用吸管分別將剪成小塊的組織均勻地平鋪在底板上，加入含FBS的DMEM培養基，FBS的體積分數為0.2。培養瓶倒置于37 ℃培養箱中培養6～8 h后，正置繼續培養，3 d后可觀察到個別組織周圍出現稀少的滑膜細胞，此時換液。6 d后個別組織周圍細胞生長緊密，即可除去組織。9 d后傳代，為第1代FLS細胞，消化細胞并進行培養，實驗所用FLS為3代～5代。

2.3 半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration， IC50)的檢測

2.3.1 MTT法檢測HDND-XIV的IC50值 實驗分組，正常FLS組：與AA FLS做對照；AA FLS組：與HDND-XIV處理組作對照；HDND-XIV處理組：400、200、100、50、25、12.5 μmol·L-1。實驗重復3次。

2.3.2 步驟 將對數生長期的FLS消化成細胞懸液，以2×104個/孔的密度接種于96孔板中，37 ℃過夜。細胞貼壁后各濃度組加入HDND-XIV刺激，作用48 h后將孔內液體換成無血清的培養基，加入MTT(5 g·L-1)，每孔20 μL，37℃作用4 h。然后將孔內液體吸凈，每孔加入150 μL DMSO，室溫震蕩后，將96板放在酶標儀上檢測吸光度(A)，波長為490 nm。

2.4 ELISA分析IL-6、TNF-α、IL-1β水平 將對數生長期FLS消化成細胞懸液并接種于24孔板內，每孔1×106個，待細胞長滿時，分別加入不同濃度的HDND-XIV進行刺激，每組3個復孔。實驗分組為正常組，AA組，AA加HDND-XIV組(80、40、20、10、5 μmol·L-1)。HDND-XIV作用24 h后，吸取細胞培養基上清，4℃，3 000 r·min-1，離心1 min, 收集上清液，ELISA法檢測炎癥細胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β的含量。

2.5 Western blot檢測MeCP2、PTCH1、Gli1和Shh 將對數生長期FLS接種于6孔板中，待24 h貼壁后，每孔內加入2 mL DMEM，并在AA組上加HDND-XIV刺激，分正常組、AA組、AA加HDND-XIV組(10 μmol·L-1)。作用48 h后，每孔加250 μL RIPA裂解液(1 mL裂解液中加10 μL PMSF)，冰上裂解30 min，將裂解的混合物移到EP管中。4℃，12 000 r·min-1，離心30 min，離心結束后移取上清至新的EP管中，加入蛋白上樣緩沖液，100℃恒溫10 min使蛋白變性。將提取的蛋白樣品每孔上樣15 μL，進行電泳分離，并轉膜到PVDF膜上。在體積分數為0.05的脫脂奶粉下封閉2 h，TBST漂洗3次后，于4 ℃中孵一抗過夜。一抗稀釋的比例為：PTCH1(1 ∶200)、MeCP2(1 ∶1 000)、Gli1(1 ∶200)、Shh(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶1 000)。在TBST漂洗3次后，加入和一抗匹配的二抗(1 ∶10 000)，孵育1 h，再在TBST中漂洗3次，用ECL發光試劑盒進行顯影。

安：我更喜歡紐約施坦威，盡管在紐約琴上演奏更具挑戰，但他們的聲音更符合我的審美。于我而言，紐約琴有一種更暗、更柔和的聲音，我非常喜歡紐約琴的低音部分。

2.6 焦磷酸測序分析 使用Axygen DNA提取試劑盒提取出基因組DNA，并用亞硫酸鹽對DNA進行修飾。PTCH1引物序列上游引物：5′-AGTTGGGAGTTTTTTAGATGATAGG-3′，下游引物：5′-CCAA AAAACCCCACCTTAATCTCTTTCA-3′，PTCH1測序引物：5′-GGAGTTTTTTAGATGATAGGTTTA-3′，擴增后，使用QIAGEN焦磷酸測序儀測序。

2.7 過表達質粒GV230-MeCP2的轉染 使用脂質體(lipofectamine 2000)轉染過表達質粒GV230-MeCP2入AA FLS，對照組AA FLS轉染空載體GV230。轉染前1天，將FLS接種于6孔板中，加入含FBS的DMEM培養基，在37℃培養箱中培養。待細胞快長滿時，即可用于實驗。取5 μL質粒與200 μL Opti-MEM輕柔混合，溫室孵育5 min，同時另取 5 μL脂質體同樣與200 μL Opti-MEM輕柔混合并孵育5 min。將上述兩種混合液輕柔混合，并在室溫孵育25 min，形成復合體。取出6孔板，棄去原培養基并用PBS清洗3次，每孔加入1.6 mL Opti-MEM，將上述孵育好的復合體，輕揉均勻的加入相應的孔中并混合均勻，置于37℃培養箱中培養6 h后，換成含FBS的DMEM培養基繼續培養。對照組操作方法同上。

3 結果

3.1 不同濃度的HDND-XIV對FLS增殖的影響 由Fig 2的MTT分析可知，AA組FLS的吸光度值大于正常組FLS，且差異具有統計學意義(P<0.01)，說明AA組的增殖速率大于正常組。加入不同濃度的HDND-XIV(400、200、100、50、25、12.5 μmol·L-1)刺激48 h后，隨著HDND-XIV濃度的減小，吸光度值在增加(P<0.01)，說明HDND-XIV具有一定的毒性，并根據吸光度值計算出IC50值為161 μmol·L-1。

Fig 2 Effect of HDND-XIV on

Lane 1：Control group；Lane 2：AA group；Lane 3～8：400，200,100,50,25,12.5 μmol·L-1HDND-XIV treated AA group.**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vsAA group

3.2 不同濃度的HDND-XIV抗炎活性的篩選 鑒于HDND-XIV毒性，在小于0.5倍的IC50范圍里，如Fig 3，選擇5個濃度點(80、40、20、10、5 μmol·L-1)，在AA組FLS上進行HDND-XIV抗炎活性的篩選，結果表明AA組FLS細胞上清中IL-6，TNF-α，IL-1β分泌大于正常組(P<0.01)，且差異具有統計學意義，隨著HDND-XIV濃度的減小，其分泌在一定范圍內呈下降的趨勢(P<0.01，P<0.05)，當HDND-XIV濃度為10 μmol·L-1時，含量最低。

3.3 HDND-XIV對PTCH1，MeCP2，Gli1和Shh蛋白表達的影響 根據ELISA篩選的結果，在AA組FLS上加HDND-XIV刺激，刺激濃度為10 μmol·L-1。如Fig 4所示，與正常組FLS相比，AA組FLS中PTCH1的表達下降(P<0.01)，MeCP2，Gli1和Shh蛋白表達升高(P<0.01)，并差異具有統計學意義。加入HDND-XIV以10 μmol·L-1濃度刺激48 h后，相比較AA組FLS，AA加HDND-XIV組中PTCH1蛋白表達升高(P<0.01)，MeCP2，Gli1和Shh蛋白表達下降(P<0.01)，差異具有統計學意義。

3.4 PTCH1基因啟動子的焦磷酸測序 以10 μmol·L-1的濃度，在AA組FLS上加 HDND-XIV刺激，分正常組，AA組，AA加HDND-XIV組。刺激48 h后，提取FLS的基因組DNA，用焦磷酸測序進行檢測，結果如Fig 5。每組均檢測了4個位點，正常組PTCH1基因啟動子4個位點Pos.1、Pos.2、Pos.3、Pos.4甲基化程度分別為0%、9%、41%、0%；AA組PTCH1基因啟動子4個位點Pos.1、Pos.2、Pos.3、Pos.4甲基化程度分別為63%、67%、62%、63%；AA加HDND-XIV組PTCH1基因啟動子4個位點Pos.1、Pos.2、Pos.3、Pos.4甲基化程度分別為28%、32%、48%、26%。根據文獻指出[12]，50%以上定義為高甲基化，20%～50%定義為低甲基化，20%以下定義為無甲基化。正常組Pos.1、Pos.2、Pos.4位點的甲基化程度分別為0%、9%、0%，視為無甲基化；AA組Pos.1、Pos.2、Pos.3、Pos.4位點均高于50%，視為高甲基化；AA加HDND-XIV組Pos.1、Pos.2、Pos.3、Pos.4位點均在20%～50%，視為低甲基化。說明AA組FLS甲基化程度高于正常組(P<0.01)，經HDND-XIV刺激后，AA組甲基化程度降低(P<0.01)。

Fig 3 Effect of HDND-XIV on level of IL-6(A)，

Lane 1：Control group；Lane 2：AA group；Lane 3～7：80，40,20,10,5 μmol·L-1HDND-XIV treated AA group.**P< 0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsAA group

Fig 4 Effect of HDND-XIV on PTCH1，MeCP2,

A,B,C:the protein expression of PTCH1，MeCP2，Shh and Gli1；HDND-XIV(10 μmol·L-1) treated AA group.**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vsAA group

3.5 轉染過表達質粒對MeCP2、PTCH1、Gli1和Shh蛋白表達以及炎癥因子IL-6，IL-1β，TNF-α的影響 在AA FLS中轉染GV230-MeCP2過表達質粒，對照AA FLS組轉染GV230空載體，轉染成功后均加入HDND-XIV，HDND-XIV的終濃度為10 μmol·L-1。分組如Fig 6，結果顯示成功轉染GV230-MeCP2，MeCP2表達上升，且與AA組MeCP2表達無差異，但與AA加HDND-XIV組相比差異具有統計學意義(P<0.01)，說明過表達成功。成功過表達MeCP2后，相比較AA加HDND-XIV組，PTCH1蛋白表達下降(P<0.01)，Gli1和Shh蛋白表達增加(P<0.01)，并且炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α的分泌也增加，差異具有統計學意義(P<0.01)。

Fig 5 PTCH1 gene promoter methylation level

A:PTCH1 gene promoter methylation level.B:Lane 1：Control group；Lane 2：AA group；Lane 3：HDND-XIV(10 μmol·L-1) treated AA group.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsAA group

Fig 6 AA-FLS transfected with plasmid ±s,n=3)

The MeCP2, PTCH1, Gli1 and Shh protein expressions was detected by western blot(A,B,C) and the level of IL-6，IL-1β，TNF-α was detected by ELISA(D) Lane 1：Control group；Lane 2：AA group；Lane 3：HDND-XIV(10 μmol·L-1) treated AA group；Lane 4：HDND-XIV(10 μmol·L-1) and GV230-MeCP2 treated AA group；Lane 5：HDND-XIV(10 μmol·L-1) and GV230 treated AA group.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsAA group

4 討論

RA是一種滑膜炎癥疾病，其發病機制尚不清楚。炎癥因子被認為是發病不可缺少的一部分，其在類風濕關節炎中的紊亂會造成炎癥性的關節損傷[13]。本實驗在體外采用MTT和ELISA證明了HDND-XIV具有明顯的抗炎活性，并對HDND-XIV產生抗炎作用的機制經行了探究。橙皮素是二氫黃酮的一種，為了克服其較低的生物利用度，本實驗室合成了一系列橙皮素衍生物，前期預實驗初步證明HDND-XIV可能具有良好的抗炎活性，MTT法檢測6個不同HDND-XIV濃度點對AA FLS的影響，顯示HDND-XIV具有一定的毒性。炎癥指標的高低可以反映藥物的抗炎活性，鑒于HDND-XIV的毒性，在小于0.5倍IC50范圍里選擇5個濃度點加藥刺激，檢測各組炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β的含量，顯示隨著HDND-XIV濃度的降低，細胞培養基中IL-6、TNF-α、IL-1β的濃度呈現下降的趨勢，HDND-XIV濃度為10 μmol·L-1時含量最低，說明此時HDND-XIV的抗炎活性最強。

文獻報道，Hedgehog信號通路在組織修復以及持續的慢性炎癥中發揮著重要作用[14]。因此，實驗中檢測了Hedgehog信號通路相關蛋白的表達來探究HDND-XIV發揮抗炎作用的機制。Western blot(Fig 4)的結果顯示，經HDND-XIV作用后，AA FLS中PTCH1蛋白表達增加，Gli1和Shh蛋白表達減少，說明AA FLS中Hedgehog信號通路可能受到了HDND-XIV的抑制。蛋白質的表達受到多種因素的影響，如轉錄、翻譯等環節，其中DNA甲基化是表觀遺傳學修飾的一種，可以抑制基因的轉錄，阻止蛋白的表達。有研究表明特定基因的甲基化參與了RA的發病[4,15]。在RA中，不同基因的甲基化狀態和程度有所不同。一些基因，如凋亡誘導基因，抗炎因子基因發生高甲基化，導致其基因表達水平降低，促進了RA的發病。另外一些基因，如促炎因子基因甲基化水平降低，導致其表達水平上升，促進RA的發病。為了探究HDND-XIV是否通過調控PTCH1基因的甲基化，從而增加PTCH1蛋白的表達，產生抗炎作用。本研究采用了焦磷酸測序技術定量檢測了各組PTCH1基因的甲基化程度。結果顯示AA FLS中PTCH1基因的甲基化程度明顯高于正常組FLS，表現為高甲基化狀態，經HDND-XIV刺激后，PTCH1基因甲基化程度明顯降低，表現為低甲基化狀態。說明HDND-XIV可能是通過抑制PTCH1基因甲基化，增加PTCH1蛋白的表達產生抗炎作用。文獻報道MeCP2與DNA甲基化密切相關，其可以特異性的識別和綁定在甲基化的DNA序列上,從而抑制基因的表達[5]。MeCP2的增多反映甲基化水平發生整體的上調。為了探究HDND-XIV是否通過作用于MeCP2來調控PTCH1基因的甲基化，我們在AA FLS上轉染過表達質粒GV230-MeCP2，然后再加入HDND-XIV，顯示成功過表達MeCP2后，PTCH1蛋白表達明顯減少，Gli1和Shh蛋白表達增加，說明Hedgehog信號通路被激活，同時該組的細胞培養基中IL-6、IL-1β、TNF-α的含量較AA FLS加HDND-XIV組也增加。說明HDND-XIV可能是通過下調MeCP2蛋白的表達，使PTCH1基因甲基化程度降低，增加了PTCH1蛋白的表達，抑制了炎癥因子的釋放。

綜上所述，HDND-XIV可在體外抑制FLS的炎癥，其抗炎的作用可能與抑制PTCH1基因甲基化有關，通過下調MeCP2蛋白的表達，使PTCH1基因的甲基化程度降低，增加PTCH1蛋白的表達，從而抑制了Hedgehog信號通路，下調了炎癥指標。提示HDND-XIV可能是通過調控特定基因的甲基化緩解FLS的炎癥，初步說明HDND-XIV治療RA有一定的療效。本實驗探討了HDND-XIV對AA大鼠FLS炎癥的影響及可能的分子機制，使橙皮素類藥物在臨床的應用等方面具有積極的意義。

(致謝：本實驗在安徽醫科大學藥學院科教大樓實驗室完成，特別感謝我的導師李俊教授給予我細心的指導與教誨，感謝我的師兄師姐，在實驗進展與論文撰寫中給予我幫助，在此一并表達我誠摯的謝意。)

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Effect of Hesperidin derivative-XIV regulating methylation of PTCH1 gene on FLS inflammation of adjuvant arthritis rats

SUN Zheng-hao1,2,3, LIU Yan-hui1,2,3, LIU Jun-da1,2,3, Xu Dan-dan1,2,3,LI Xiao-feng1,2,3,ZHANG Yi-long1,2,3,MENG Xiao-ming1,2,3, HUANG Cheng1,2,3, LI Jun1,2,3

(1.SchoolofPharmacy,AnhuiMedicalUniversity,theKeyLaboratoryofMajorAutoimmuneDiseasesofAnhuiProvince,AnhuiInstituteofInnovativeDrugs,Hefei230032，China;2.TheKeyLaboratoryofAnti-inflammatoryandImmunemedicines，MinistryofEducation,Hefei230032，China;3.InstituteforLiverDiseasesofAnhuiMedicalUniversity，Hefei230032，China)

Aim To explore the effect of 5-(4-Chlorophenethyl) imino-7-O-acetyl-4-chlorophenethylamine hesperetin(HDND-XIV) on fibroblast-like synoviocytes(FLS) inflammation in adjuvant arthritis(AA) rats and the underlying molecular mechanism.Methods AA rats were induced by Freund′s complete adjuvant(FCA，0.01 ml·kg-1)，after 24 d，the rats were killed and the synovial tissue was used to extract primary cells；MTT was used to detect the half maximal inhibitory concentration(IC50) of HDND-XIV；Enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) was used to detect the level of interleukin-6(IL-6)，tumor necrosis factor-α(TNF-α)，interleukin-1β(IL-1β) in cell culture. Lipo-fectamine2000 transfection kit was used to display the overexpression of MeCP2 in AA FLS. Western blot was used to detect the expression of MeCP2，PTCH1，Gli1 and Shh. Pyrosequencing was used to detect the methylation level of the PTCH1 gene quantificationally.Results The IC50of HDND-XIV on FLS was 161 μmol·L-1through MTT. The most significant anti-inflammatory concentration was 10 μmol·L-1through ELISA. In AA FLS，the expression of PTCH1 was increased and MeCP2，Gli1，Shh were reduced in response to HDND-XIV. According to pyrosequencing，the methylation level of the PTCH1 gene was significantly decreased in response to HDND-XIV. Overexpression of MeCP2 in AA FLS followed by treating with HDND-14，the expression of PTCH1 was reduced，the expression of Gli1，Shh was increased and the level of IL-6, IL-1β, TNF-α rose.Conclusion HDND-XIV has prominent anti-inflammatory activity in FLS，the mechanism of which may be associated with inhibiting the expression of MeCP2 to reduce the methylation status of PTCH1 gene.

HDND-XIV；Sprague Dawley rats；adjuvant arthritis；methylation；Hedgehog；fibroblast-like synoviocytes；overexpression；inflammation

時間：2017-5-25 17:44 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170525.1744.018.html

2017-01-13，

2017-02-20

國家自然科學基金資助項目(No 81273526，81473268)；安徽省教育廳重點基金項目(No KJ2016A364，KJ2016A365)；安徽省自然科學基金面上項目(No 21408085MKL31)

孫正浩(1992-)，男，碩士生，研究方向：抗炎免疫藥理學,E-mail：sunzhenghao1992@163.com； 李 俊(1960-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：抗炎免疫藥理學，通訊作者，E-mail: lijun@ahmu.edu.cn，ayidasunzhenghao@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.06.009

A

1001-1978(2017)06-0781-07

R-332；R285.5；R364.5；R392.12；R394.2；R593.22