風(fēng)心病合并房顫患者心肌microRNA表達(dá)譜分析與靶基因預(yù)測(cè)

韓莉莉+沈曉麗+賴力+林賽梅+劉小晴+翁國(guó)星+陳同+丁杭+胡潔+浦曉東

[摘要] 目的 研究風(fēng)心病合并房顫患者心肌microRNAs的表達(dá)差異，預(yù)測(cè)其靶基因并分析其可能的生物學(xué)功能。方法經(jīng)知情同意，整群采集2013年1—12月收治的14例住院風(fēng)心病房顫患者和8例風(fēng)心病無(wú)房顫患者右心耳組織；提取總RNA進(jìn)行miRNAs芯片雜交檢測(cè)，應(yīng)用RMA和FC法篩選差異表達(dá)的miRNAs，并用RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證；運(yùn)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)靶基因并分析其生物學(xué)功能。結(jié)果 與風(fēng)心病無(wú)房顫組相比，風(fēng)心病合并房顫組有22個(gè)miRNAs表達(dá)有差異，其中6個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào)，16個(gè)miRNAs表達(dá)下調(diào)；驗(yàn)證結(jié)果表明與風(fēng)心病無(wú)房顫組比較，miR-661、miR-520d-5p和miR-145-5p表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.01）；經(jīng)GO和KEGG數(shù)據(jù)分析，差異miRNA 靶基因的一部分亦與心肌纖維化相關(guān)。結(jié)論 該研究獲得與房顫相關(guān)的差異miRNAs，可能是房顫新的生物標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] 房顫；微小RNA；表達(dá)譜；生物信息學(xué)

[中圖分類號(hào)] R4 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2017）02（c）-0007-04

Analysis of Myocardium MicroRNA Expression Profile and Prediction of Target Gene of Patients with Rheumatic and Atrial Fibrillation

HAN Li-li1， SHEN Xiao-li1， LAI Li1， LIN Sai-mei1， LIU Xiao-qing1， WENG Guo-xing2， CHEN Tong2， DING Hang1， HU Jie1， PU Xiao-dong1

1.Clinical Medical College of Medical University of Fujian， Fujian Key Laboratory of Cardiovascular Disease， Judicial Appraisal Institute of Fujian Province-owned Hospital， Fuzhou， Fujian Province， 350001 China；2.Department of Cardiac surgery， Fujian Provincial Hospital， Fuzhou， Fujian Province， 350001 China

[Abstract] Objective To research the expression difference of myocardium microRNA of patients with rheumatic and atrial fibrillation and predict the target gene and analyze the potential biology function. Methods Auricula dextra tissues of 14 cases of inpatients with rheumatic and atrial fibrillation and 8 cases of patients were group selected with rheumatic but without atrial fibrillation from January to December 2013 were collected， and the total RNA was extracted for miRNAs hybridization test， and the miRNAs was screened by RMA and FC， and then RT-PCR was used for verification， and the target gene was predicted by the biology information software and the biology function was analyzed. Results The expression of 22 miRNAs had differences in the combined group， including 6 whose expression increased and 16 whose expression decreased， and the expressions of miR-661， miR-520d-5p and miR-145-5p obviously decreased compared with the other group， all P<0.01， the GO and KEGG data analysis showed that the some of differential miRNA target genes was correlated with the myocardial fibrosis. Conclusion The differential miRNA related to atrial fibrillation may the new biomarkers of atrial fibrillation and potential treatment target point.

[Key words] Atrial fibrillation； mini RNA； Expression profile； Information biology

風(fēng)濕性心臟病是因風(fēng)濕活動(dòng)引起的心臟病變，常導(dǎo)致房顫發(fā)生。房顫（Atrial Fibrillation ，AF），是多因素導(dǎo)致的心律失常[1]。微小RNA（miRNA）是長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA，可使靶mRNA降解或者抑制其翻譯而在轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平發(fā)揮調(diào)控作用，繼而影響細(xì)胞增殖分化和凋亡等[2]。既往研究miR-30、miR-21、miR-150和miR-146[3-4]等可能參與AF， 而miRNA在AF心肌纖維化的作用尚缺少研究。通過分析2013年1—12月收治的22例風(fēng)心病瓣膜置換者miRNAs表達(dá)，該研究擬尋找新的調(diào)控AF心肌纖維化的miRNAs并預(yù)測(cè)其靶基因，為進(jìn)一步揭示miRNAs在AF的作用機(jī)制及尋求安全、有效診治AF的靶點(diǎn)提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

整群選擇該院心外科接受風(fēng)心病瓣膜置換的患者，知情同意后入選。分兩組：風(fēng)心病合并房顫組14例，風(fēng)心病無(wú)房顫組8例。采集患者右心耳心肌組織放入液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA抽提

Trizol法提取總RNA并檢測(cè)其質(zhì)量和含量，用瓊脂糖電泳檢測(cè)其完整性，質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：1.70.7，合格者用于后續(xù)研究。

1.3 miRNA芯片雜交

先分析總RNA，然后選用FlashTag Biotin HSR 標(biāo)記試劑對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)記后雜交，繼而用 GeneChip雜交洗染試劑來洗染芯片，最后掃描得到圖片和原始數(shù)據(jù)。

1.4 芯片結(jié)果的RT-PCR驗(yàn)證

1.4.1 引物設(shè)計(jì) 擴(kuò)大樣本量，挑取6個(gè)差異miRNAs進(jìn)行組織驗(yàn)證，用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，U6 為內(nèi)參照，見表1。

1.4.2 RT-PCR 擴(kuò)增 反應(yīng)體系為20 μL，10μL SYBR premix ex taq，0. 5 μL 上、下游引物（2.5 μM） ，8 μL H2O，加入1 μL cDNA 后混勻。循環(huán)條件為： DNA變性1 個(gè)循環(huán)：95℃ 30 s，目標(biāo)DNA擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)：95℃ 5 s、60 ℃，30s，反應(yīng)結(jié)束后制作熔解曲線。

1.5 靶基因預(yù)測(cè)和功能分析

采用targetscan、miRDB與mimada 3種軟件對(duì)差異表達(dá)miRNA靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。基于Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)，通過GO分析對(duì)靶基因進(jìn)行GO分類，再通過KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析靶基因的信號(hào)通路及功能分布，初步了解差異miRNAs對(duì)AF發(fā)生、發(fā)展的調(diào)控情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

采用RMA方法和倍數(shù)變化法（FC）篩選差異miRNAs，判斷標(biāo)準(zhǔn)為|FC|>2或|FC|<0.5。熒光定量PCR 數(shù)據(jù)采用2 - ΔΔCt法分析，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果

miRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)顯示，該研究中與風(fēng)心病無(wú)房顫組相比，風(fēng)心病合并房顫組患者有16個(gè)miRNAs（miR-520d-5p、miR-661、miR-4490、miR-4474-3p、miR-4518、miR-379*、miR-3939、miR-1243、miR-4793-3p、miR-548c-3p、miR-4711-5p、miR-4754、miR-4677-5p、miR-4423-3p、miR-145*、miR-1252）相對(duì)表達(dá)下調(diào)，6個(gè)miRNAs相對(duì)表達(dá)上調(diào)（miR-4800-3p、miR-3174、miR-4723-5p、miR-218-2*、miR-920、miR-4470）（P<0.05）。

2.2 Real-time PCR驗(yàn)證結(jié)果

選擇6條miRNAs做組織驗(yàn)證，結(jié)果與風(fēng)心病無(wú)房顫組相比，風(fēng)心病有房顫組中miR-661、miR-520d-5p和miR-145-5p表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.01），與芯片結(jié)果一致；而miR-4800-3p、miR-1243和miR-4723在兩組表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與芯片結(jié)果不一致，不適于進(jìn)一步功能研究，見表2。

注：與風(fēng)心病無(wú)房顫組比較，*P<0.01。

2.3 miRNA靶基因的預(yù)測(cè)和功能分析

通過分析差異miRNA的靶基因，選擇3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)共同預(yù)測(cè)得出有交集的靶基因， miR-661、miR-145-5p和hsa-520d-5p靶基因分別有44、227個(gè)和491個(gè)，具體分布及重疊情況見圖1。

A.miR-661靶基因 B. miR-145-5p靶基因

C. miR-520d-5p靶基因

通過在Pubmed檢索并對(duì)照《人類基因功能手冊(cè)》，確定上述差異miRNA最有可能的靶基因，見表4。

基于 Gene Oncology和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行GO和Pathway分析，結(jié)果除涉及核酸、蛋白代謝外，這些靶基因生物學(xué)途徑還涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Wnt通路為主）及胞外基質(zhì)合成，此外也參與了心臟組織發(fā)育、細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)粘附、轉(zhuǎn)錄因子活性及炎癥等。

3 討論

miRNA是近年來生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)，既往對(duì)其研究主要集中在生物發(fā)生等方面，在心血管疾病中的研究起步較晚。雖然已發(fā)現(xiàn)多種在心血管發(fā)育及疾病病理發(fā)生過程中發(fā)揮非常重要作用的miRNAs，但有關(guān)房顫和心肌細(xì)胞外基質(zhì)纖維化研究較少，而且絕大多數(shù)是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。因此，該研究選擇風(fēng)心病接受瓣膜置換患者右心耳組織作為實(shí)驗(yàn)材料，探討了miRNAs在房顫發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具真實(shí)性。

寡核苷酸芯片具有特異性和敏感性高、重復(fù)性好、假陽(yáng)性率低等優(yōu)點(diǎn)，在心肌組織miRNA分析中得到廣泛應(yīng)用。RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果發(fā)現(xiàn)風(fēng)心病房顫組較風(fēng)心病無(wú)房顫組miR-520d-5p、 miR-661和miR-145-5p表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.01），與芯片結(jié)果一致；而另3種miRNA在兩組表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與芯片結(jié)果不一致，可能原因有：①基因芯片具有高通量?jī)?yōu)勢(shì)也存在假陽(yáng)性的不足之處，②FC法篩選差異miRNAs具有簡(jiǎn)便、節(jié)約成本等優(yōu)點(diǎn)，也存在結(jié)論過于簡(jiǎn)單、閾值劃分主觀性較強(qiáng)等缺點(diǎn)，易產(chǎn)生假性結(jié)果[5]，適用于預(yù)實(shí)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)初篩。

既往有關(guān)miRNAs與AF的研究中，Liu Z等[6]報(bào)道m(xù)iR-188-5p、miR-1181等8條表達(dá)上調(diào)，miR-497、miR-145等20條下調(diào)。另有報(bào)道m(xù)iR-17、miR-10b、等5條miRNA表達(dá)上調(diào)；miR-30c、miR-100等5條miRNA表達(dá)下調(diào)[7]。該研究首次發(fā)現(xiàn)miR-661和miR-520d-5p與AF有關(guān)，且與風(fēng)心病無(wú)房顫患者相比，風(fēng)心病合并房顫患者上述miRNA表達(dá)水平降低。由于AF機(jī)制的復(fù)雜性，該研究推測(cè)AF形成可能是諸多miRNA調(diào)控下游靶基因的結(jié)果。

為進(jìn)一步探討差異miRNA調(diào)控預(yù)測(cè)靶基因的功能，該研究應(yīng)用PubMed檢索顯示多數(shù)預(yù)測(cè)的靶基因尚未見與AF相關(guān)的報(bào)道，提示這些miRNA可能通過信號(hào)通路級(jí)聯(lián)效應(yīng)對(duì)AF進(jìn)行調(diào)控。GO分析結(jié)果顯示除涉及核酸、蛋白代謝外，miR-661靶基因生物學(xué)功能主要集中在細(xì)胞外基質(zhì)的合成與代謝上，而胞外基質(zhì)在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞收縮和胞間信息中起重要作用[8]，表明差異miRNA與AF發(fā)生有關(guān)。AF涉及電重構(gòu)、結(jié)構(gòu)重構(gòu)等過程，其都涉及信號(hào)通路的調(diào)控。KEGG分析顯示這些miRNA影響的靶基因主要在Wnt、細(xì)胞骨架、粘附連接和MAPK等信號(hào)通路上，尤以Wnt通路富集指數(shù)最高，Wnt通路可能是這些miRNA調(diào)控的核心通路。

綜上所述，該研究為了解AF發(fā)生機(jī)制提供了新視野，miR-661、miR-520d-5p和miR-145-5p可作為檢測(cè)AF的新的標(biāo)志物，后續(xù)研究中也將進(jìn)一步通過功能實(shí)驗(yàn)等探索其與靶基因的關(guān)系，以期為AF機(jī)制的研究及尋找安全、有效治療AF的藥物提供新的思路。

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（收稿日期：2016-11-28）