寧夏枸杞內生菌的抗菌和抗腫瘤活性研究

代金霞+杜曉寧

[摘要] 為篩選具有抗菌抗腫瘤活性的枸杞內生菌資源，對分離自寧夏枸杞的10株內生菌發酵液的抑菌活性和體外細胞毒活性進行檢測，通過ITS 和16S rDNA序列分析對菌株進行了分子鑒定。結果表明，5株內生真菌對供試病原菌都未表現出抑制活性，放線菌AL6對3種病原真菌都有一定的抑制作用，而AL5僅對金黃色葡萄球菌有較強抑制活性。但內生真菌的抗腫瘤活性明顯強于放線菌。當發酵液濃度為0.2 g·L^-1時，有4株內生真菌至少對1種腫瘤細胞的抑制率高于50%。序列分析表明，5株內生真菌隸屬于曲霉屬、青霉屬和翹孢霉屬。5株內生放線菌隸屬于鏈霉菌屬、微球菌屬和擬諾卡氏菌屬。曲霉屬菌株FL1對A549和HeLa細胞的抑制活性都較強，其IC₅₀分別為0.022，0.028 g·L^-1，值得進一步研究。

[關鍵詞] 枸杞；內生菌；抑菌活性；抗腫瘤活性

[Abstract] The antimicrobial activity and cytotoxicity in vitro of the fermentation broth of 10 endophytic strains isolated from Lycium barbarum were determined to screen high activity endophytic strains. Sequences analysis of ITS and 16S rDNA was used for molecular identification of the strains. The results showed that 5 endophytic fungi had no inhibitory activity against the tested pathogens. Endophytic actinomycete strain AL6 had a certain inhibitory effect on 3 kinds of pathogenic fungi，and strain AL5 only had strong inhibitory activity against Staphylococcus aureus. However，the anti-tumor activity of endophytic fungi was significantly higher than that of actinomycetes. Four endophytic fungi strains exhibited the growth inhibition rate of above 50% against at least one of the tested tumor cells when the concentration of fermentation broth was 0.2 g·L^-1. Sequences analysis showed that 5 endophytic fungi strains belonged to genus Aspergillus，Penicillium and Emericella，and the 5 endophytic actinomycetes strains belonged to genus Aspergillus，Penicillium and Emericella. Aspergillus strain FL1 had stronger inhibitory activity against A549 and HeLa cells，and the IC₅₀ values were 0.022，0.028 g·L^-1，respectively，which was worthy of further study.

[Key words] Lycium barbarum；endophytes；anti-microbial activities；anti-tumor activities

內生菌（endophyte）是指一類在其部分或全部生活史中存活于健康植物組織內部，而不使宿主植物表現出明顯感染癥狀的微生物[1]。植物內生菌在植物微生態系統中，與宿主建立了和諧的聯合關系，不僅能夠參與植物次生代謝及成分的轉化合成，而且還能夠獨立產生豐富的次生代謝產物，是天然產物的重要來源[2]。藥用植物內生菌次生代謝產物含有與宿主植物相同或相似的藥用活性成分，包括抗腫瘤、抗菌、抗炎癥、免疫調節、降糖等天然化合物[3]。直到現在人們已發現微生物的代謝產物中有60余種藥理作用[4]。尤其是近10年來關于微生物代謝產物的研究越來越受到人們的重視，并且也取得了極為驚人的研究成果。目前藥用植物內生菌已成為人們尋找新型藥物的重要來源。內生菌代謝產物已作為抗癌藥物、抑菌劑、植物激素、殺蟲劑、抗氧化劑等服務于人類[5-6]。

枸杞Lycium barbarum L.為茄科多年生落葉小灌木，花、果、葉、根皮均可入藥，有很高的營養價值和藥用保健功效，不僅是我國傳統的藥用植物，也是重要的經濟資源。寧夏產枸杞因其品質優良成為全國首推的藥用枸杞，被《中國藥典》收錄為大宗道地性中藥材。而內生菌與宿主植物在長期共進化過程中形成了穩定的互利共生關系，次生代謝產物是這種關系的物質基礎[7]。目前對于枸杞內生菌的相關研究極少，其代謝產物是否具備與宿主植物相同或相似的活性成分，是否具有潛在的藥用價值尚未可知。本研究擬以前期分離自寧夏枸杞的5株內生真菌和5株內生放線菌為供試菌株，以5種病原菌為指示菌對菌株的抑菌活性進行測定，以2種腫瘤細胞為指示細胞對菌株的體外細胞毒活性進行檢測，篩選具有抗菌抗腫瘤活性的菌株，旨在了解枸杞內生菌的生物學特性及其未知的藥理學作用，為開發枸杞內生菌資源、獲得能夠產生藥用功能性成分的內生菌代謝產物提供基礎資料。

1 材料

1.1 內生菌

分離自寧夏枸杞的5株內生真菌和5株內生放線菌。其中內生真菌FL1，FL2，FL6和FL9分離自枸杞嫩葉，FR4B分離自枸杞根皮；內生放線菌AF16分離自枸杞花，AL1B，AL3，AL5，AL6分離自枸杞嫩葉。

1.2 致病菌

動物病原細菌包括大腸桿菌Escherichia coli和金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus；植物病原真菌包括玉米大斑病菌Exserohilum turcica、小麥赤霉病菌Fusarium graminearum和番茄炭疽病菌Colletotrichum nigrum，由寧夏大學生命科學學院和農學院保存。

1.3 細胞株

腫瘤細胞株包括人宮頸癌細胞株HeLa和人肺腺癌細胞株A549，以正常細胞人胚肺成纖維細胞株MRC-5為對照。

1.4 試劑

胎牛血清（北京全式金生物有限公司）、二甲基亞砜 （DMSO，美國Sigma公司）、1640培養基（美國，Hyclone 公司）、細胞完全培養基（1640培養基：胎牛血清= 9∶1）；MTT（噻唑藍）溶液：稱取100 mg MTT粉末，溶于20 mL PBS溶液中，用0.22 μm微孔濾膜過濾后分裝在5個2 mL的無菌離心管中，封口膜封口，-20 ℃避光保存。

2 方法

2.1 抑菌活性檢測

將保存的枸杞內生菌、指示菌分別接種于NA、高氏I號和PDA平板上進行活化后，挑取單菌落或菌絲接種于250 mL相應的液體培養基中，在28 ℃，120 r·min^-1條件下震蕩培養3～7 d，將菌懸液在8 000 r·min^-1離心 5 min，取上清液備用。

采用抑菌圈法對菌株的抑菌活性進行檢測。取200 μL指示細菌和真菌發酵液分別注入NA和PDA平板中，用滅菌的涂布棒均勻涂布于平板上，干燥后用打孔器在培養基表面均勻打3～4個直徑為6.0 mm的孔，取80 μL供試內生菌的發酵上清液接于孔內，每皿接2～3株，分別以滅菌的PDA和高氏I號培養液為陰性對照，每組實驗設置3次重復。于28 ℃培養3～7 d觀察并測量抑菌圈直徑與菌落直徑的比值（D/d）。

2.2 抗腫瘤活性測定

將供試菌株發酵液經凍融、勻漿后，8 000 r·min^-1離心 10 min，上清液用 0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，經減壓濃縮成膏狀。分別稱取0.2 g膏狀發酵產物，用PBS緩沖液配置成20 g·L^-1的母液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，得到無菌備用液。用RPMI-1640基本培養基稀釋備用液至0.2 g·L^-1（內生真菌）和2.0 g·L^-1（內生放線菌），4 ℃冰箱保存備用。

采用體外細胞毒測定的MTT法和CCK-8法測定菌株發酵液的抗腫瘤活性。把培養好的HeLa，A549，MRC-5 細胞用完全培養基制成單細胞懸浮液，血球計數板計數，按5萬個/mL接種100 μL于96孔板，置CO₂培養箱中37 ℃培養12 h，待貼壁后吸掉原有培養液，每孔加入100 μL含0.2 g·L^-1內生真菌或2.0 g·L^-1內生放線菌發酵液的完全培養基，繼續培養48 h。以滅菌的完全培養基處理為陰性對照，每處理3次重復。

2.2.1 MTT法 上述處理后每孔加入MTT溶液（5 g·L^-1） 20 μL，繼續培養4 h后，終止培養。小心吸出孔內培養液，每孔加入150 μL DMSO后震蕩10～15 min，使藍色結晶完全溶解。用酶標儀測定波長490 nm處的吸光值A₄₉₀。

2.2.2 CCK-8法 每孔加入CCK-8 Solution 10 μL，在培養箱繼續培養2.5 h后終止培養。用酶標儀測定450 nm的吸光度A₄₅₀。用以下公式計算樣品對腫瘤細胞生長的抑制率。用改良的寇氏法計算IC₅₀。

2.3 發酵液梯度活性測定

對篩選出的具有較強抗腫瘤活性的菌株進行濃度梯度活性測定。將保存的無菌備用液用完全培養基分別配置成濃度梯度為0.5，0.4，0.3，0.2，0.1 g·L^-1的待測液，采用CCK-8法進行抗腫瘤梯度活性試驗。分別于處理 24，48 h時用倒置顯微鏡觀察細胞株形態變化。用改良的寇氏法計算樣品的IC₅₀（即抑制率為50%時的樣品濃度）。用IBM SPSS Statistics 19軟件進行數據分析。

2.4 菌株的分子鑒定

提取各菌株基因組DNA，采用引物對ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）擴增內生真菌的ITS序列，用引物對27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）擴增內細菌的16S rDNA序列。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，委托上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。測序結果在GenBank中進行blast同源性搜索，用MEGA5.0構建系統發育樹，確定菌株的分類地位。

3 結果與分析

3.1 枸杞內生菌的抑菌活性

抑菌實驗結果表明，5株枸杞內生真菌對所選病原菌均未表現出抑制活性。而內生放線菌中，菌株AL6對番茄炭疽病菌、玉米大斑病菌、小麥赤霉病菌的生長都有一定抑制作用，抑菌圈與菌落直徑比值（D/d）分別為2.31，2.45，3.92，但對2種動物病原細菌沒有抑制作用；菌株AL5僅對金黃色葡萄球菌表現出較強的抑制活性，D/d達到3.98；其余菌株對各病原菌均無抑制活性（圖1）。

3.2 枸杞內生菌的抗腫瘤活性

本研究采用 MTT法與CCK-8法，以腫瘤細胞HeLa和A549為指示細胞株，對10株枸杞內生菌發酵物的體外細胞毒活性進行分析。2種方法的測定結果基本一致，而CCK-8法操作更為簡便，且靈敏度略強。當內生真菌發酵液濃度為0.2 g·L^-1時，有4株內生真菌對2種腫瘤細胞的生長均具有抑制作用（表1）。其中菌株FL1和FL6對HeLa和A549的抑制活性都較強，抑制率分別達到78.8%，89.2%和65.7%，55.7%；菌株FL2對HeLa細胞有明顯的抑制作用，抑制率為71.2%，而FL9則對A549細胞的生長抑制率為51.8%；FR4B對HeLa細胞的生長沒有抑制作用，對A549的抑制作用也不明顯。

內生放線菌發酵液濃度為2.0 g·L^-1時，僅菌株AL6和AL5對HeLa細胞、AL1B對A549有一定的抑制作用，其余菌株對供試腫瘤細胞均未表現出抑制活性。總體上看，枸杞內生真菌對供試腫瘤細胞的抑制活性明顯強于內生放線菌。

3.3 內生菌發酵液梯度活性

根據各菌株的抗腫瘤活性結果，選取對2種腫瘤細胞均具有抑制活性的4株內生真菌進行梯度活性試驗。結果表明內生真菌發酵液濃度與其對腫瘤細胞的抑制活性成線性正相關關系，即隨著濃度的不斷增大，對腫瘤細胞的抑制活性也不斷增強（圖2）。4株內生真菌對HeLa細胞抑制濃度的IC₅₀為0.028～0.388 g·L^-1，抑制活性表現為FL1>FL2>FL6>FL9。對腫瘤細胞A549抑制濃度的IC₅₀為0.022～0.373 g·L^-1，抑制活性表現為FL1>FL9>FL6>FL2；其中菌株FL1對2株腫瘤細胞的抑制活性均最強，其IC₅₀分別為0.022，0.028 g·L^-1（表2）。

比較細胞毒活性最強的菌株FL1對腫瘤細胞A549，HeLa和正常細胞MRC-5生長的影響。在各細胞貼壁12 h后，用0.5 g·L^-1的 FL1代謝產物進行處理，用完全培養基處理做陰性對照，分別于處理24，48 h后觀察各細胞形態。結果表明在處理24 h時，實驗組腫瘤細胞出現明顯凋亡現象，細胞核變大，細胞形態明顯分化，細胞變薄，顏色變深，數目沒有增多，而對照組細胞形態正常，數量增多。處理48 h后，實驗組細胞形態進一步異化，HeLa細胞出現明顯的凋亡現象，而A549的細胞核明顯變圓變大，細胞形態明顯分化變形，出現凋亡跡象，對照組細胞形態沒有明顯變化，數量進一步增多。而相同濃度的代謝產物對正常細胞MRC-5的形態與數量均沒有明顯影響（圖3）。

3.4 菌株的鑒定

通過序列測定，獲得5株枸杞內生真菌約500 bp左右ITS序列，5株放線菌約1 400 bp的16S rDNA序列。系統發育分析表明（圖4），內生真菌FL1，FL6，FL9隸屬于曲霉屬Aspergillus，分別與該屬A. fumigatus，A. flavus和A. tubingensis聚為一支；菌株FR4B屬于青霉屬Penicillium，與P. chrysogenum的序列相似性為99%；FL2則與翹孢霉Emericella quadrilineata聚為一支。內生放線菌AL5，AL6和AL1B隸屬于鏈霉菌屬Streptomyces，與鏈霉菌屬參比菌株Streptomyces sp.，S. lividans 和S. badius 以99%～100%的序列相似性聚為一支；EAF16和AL3分別隸屬于微球菌屬Micrococcus和擬諾卡氏菌屬Nocardiopsis屬，與二者有著高的序列相似性。

4 討論

內生菌在與宿主植物長期的協同進化過程中形成了密切的關系，而維持這種關系的物質基礎是內生菌產生的或由其誘導宿主植物合成的次生代謝產物。內生菌次生代謝產物的研究對于闡明生物進化的機制，加深對生物體之間競爭與生存關系的了解以及豐富微生物多樣性均具有重要的意義。目前對植物內生菌的研究顯示，約有30%的內生真菌能夠產生具有抗菌活性的物質，對多種病原菌具有廣譜或專一抗性[8]。本研究對枸杞內生菌的抑菌活性結果表明，供試的5株內生真菌對供試病原菌均未表現出抑制活性，僅有2株鏈霉菌屬菌株對部分病原菌的生長有一定抑制作用，但抑菌活性不強。內生菌代謝產物的活性因菌株不同而有很大差異，即使同屬的菌株其活性也大不相同，如鏈霉菌屬的AL5，AL6和AL1B，菌株AL6對3種病原真菌都表現出抑制作用，菌株AL5僅對金黃色葡萄球菌有抑制活性，而AL1B則對所有病原菌都未表現出抑制活性。蘇林涓等[9]、張志斌等[10]分離自茶樹和野生稻的鏈霉菌對許多病原菌的生長都具有較強的抑制作用，表現出廣譜的抑菌活性。王營等[11]從廣藿香中分離的曲霉屬菌株具有廣譜抗菌活性；而劉雷[12]分離自川麥冬的曲霉屬菌株僅對白色念珠菌具有抑制活性，對其他動物病原細菌則無抑制作用；這些研究結果表明，植物內生菌對不同病原菌的抑制作用既表現出一定的選擇性，也具有專一性。

抗腫瘤實驗結果表明，枸杞內生真菌具有較強的細胞毒活性，對腫瘤細胞的抑制效果明顯強于放線菌。尤其是曲霉屬菌株FL1，對2種供試腫瘤細胞都表現出強的細胞毒活性。王胤等[13]的研究發現，煙曲霉對人肺癌A549細胞的生長有明顯的抑制活性，而且活性成分主要存在于胞內；在本研究中曲霉屬菌株FL1的胞外次級代謝產物中具有抗腫瘤活性成分，這與陳傳文等[14]的研究結果一致。這表明不同藥材基因型和同種異質對內生菌的功能具有一定的影響。內生菌次生代謝產物的多樣性可導致其代謝功能的差異，也是內生菌生物學作用多樣性的根本原因。許多內生菌代謝產物中所含的黃酮類化合物，能夠產生強的細胞毒活性，對腫瘤細胞的生長有明顯的抑制作用[15-16]。而黃酮類物質也是寧夏枸杞的主要活性成分之一，那么，本研究篩選出的對2種腫瘤細胞具有強抑制活性的內生真菌FL1，其活性成分是否與其宿主的代謝產物黃酮類相關，還值得進一步研究。

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[責任編輯 孔晶晶]