中藥穿山甲的DNA分子鑒定研究

尹艷+劉遜+王兵+高琳惠+張夏楠

[摘要] 對中藥穿山甲及其混偽品進行分子鑒定研究，建立一個穩定、準確的位點特異性PCR鑒別體系。收集整理穿山甲屬動物組織樣本及NCBI序列，提取基因組總DNA，PCR擴增Cytb和COⅠ序列并測序，通過BioEdit軟件進行序列比對，應用MEGA 6.0構建序列系統聚類樹，并根據序列特異位點設計和篩選中華穿山甲特異性鑒別引物，并對PCR反應條件進行退火溫度、DNA模板上樣量和PCR循環數等條件的適應性考查。結果表明：Cytb和COⅠ序列均能有效對穿山甲正、偽品進行聚類分析；在位點特異性PCR反應體系中，當退火溫度為55～60 ℃，DNA模板量3～100 ng，PCR擴增35個循環時，基于COⅠ序列的引物COⅠ-S10/A5 能使中華穿山甲擴增出約400 bp的特異性條帶，而其他穿山甲品種擴增結果為陰性。該文基于COⅠ序列的引物COⅠ-S10/A5能實現中華穿山甲與偽品印度穿山甲、馬來穿山甲、樹穿山甲等的準確、穩定鑒別。

[關鍵詞] 穿山甲；COⅠ；Cytb；分子鑒定

[Abstract] The study was aimed to establish a stable，accurate site specific PCR identification system to identify Manis pentadactyla and its adulterants using DNA molecular identification. The genomic DNA was extracted from experimental samples using the DNA extraction kit. The Cytb and CO Ⅰ genes were amplified using PCR and sequenced bi-directionally. Obtained sequences were assembled using the BioEdit software. The neighbor-joining tree was constructed by MEGA 6.0. Specific identification primers were designed according to the specific allelets，and PCR reaction system was optimized. The results indicated that the Cytb and CO Ⅰ sequence both were able to be used to identify M. pentadactyla and its adulterants. With the specific primers CO Ⅰ-S10/A5，the M. pentadactyla could be amplified a 400 bp DNA band when the annealing temperature ranged from 55 to 60 ℃ and the amount of DNA template ranged from 3 to 100 ng within 35 PCR cycles. However，other adulterants displayed no relevant bands. So that primers CO Ⅰ- S10 / A5 can be used to identify the M. pentadactyla with the adulterants.

[Key words] Manis pentadactyla；COⅠ；Cytb；molecular identification

穿山甲為鯪鯉科Manidae穿山甲屬Mains動物，全球現存包括分布亞洲的中華穿山甲M. pentadactyla、印度穿山甲M. crassicaudata、馬來穿山甲M. javanica、菲律賓穿山甲M.culionensis 4種，分布非洲的樹穿山甲M. tricuspis、大穿山甲M. gigantea南非穿山甲M.temminckii和長尾穿山甲 M. tetradactyla 4種[1]。其中中華穿山甲是我國藥典規定的中藥穿山甲的唯一正品來源，是我國傳統名貴中藥之一[3-6]，具有活血消癥、通經下乳、消腫排膿、搜風通絡之功效，用于經閉癥瘕、乳汁不通、癰腫瘡毒、風濕痹痛、中風癱瘓、麻木拘攣等癥。然而近年來中華穿山甲的資源極度稀缺，早在2013年世界自然保護聯盟（IUCN） 物種生存委員會（SSC） 穿山甲專家組（PSG） 會議中，中華穿山甲和馬來穿山甲在受脅物種紅色名錄（Redlist） 中的等級就被上調為極度瀕危級（Cr），而其他6 種穿山甲的等級也全部提升為瀕危級（En） [2]。穿山甲除藥用之外，其肉可食且被認為味道鮮美兼具較高營養價值。穿山甲人工繁殖困難[7]，藥材等來源依靠野生資源捕獵且缺乏科學可持續手段?；谝陨显?，穿山甲野生資源逐漸匱乏[8]，穿山甲市場售價昂貴[9]，是以導致穿山甲非法捕獵和走私貿易泛濫[10-11]。

Gaudin T J等基于計算機技術對現存的7種和已經滅絕的5種穿山甲的骨骼特征進行了系統發育關系分析，從形態學上解釋了穿山甲生物地理學分布特征和物種進化史[12]。劉遜等對穿山甲商品狀況及基源進行了調查和鑒定，并總結了系列穿山甲鱗甲的基源鑒別依據[13]，但穿山甲鱗甲大小、顏色、紋理等隨源動物年齡、生活生態環境、鱗片部位等有所差異[14]，種內變化大，種間辨識度低，非經驗豐富專家不能正確鑒別。與之相比，DNA分子技術具有不受樣品形態、數量等限制的優點，對于穿山甲這一類珍稀物種的種源鑒定具有獨特的優勢，Tobe S S等也曾提出用DNA特異性片段作為珍貴瀕危物種的鑒定新方法[15]。目前關于穿山甲分子鑒定方面的研究較少，尤其缺乏穿山甲屬內種間分子鑒別的研究。本文應用分子標記方法對穿山甲屬不同種動物進行鑒別，并基于標記序列建立一個位點特異性PCR體系，以準確快速區分中華穿山甲與其他穿山甲品種。

1 材料

1.1 樣品

共收集穿山甲樣品供24份（表1），其中鱗甲19份，筋膜5份。由首都醫科大學中醫藥學院教學實驗中心和江蘇衛生職業技術學院劉遜副教授鑒定保存并饋贈。

1.2 儀器

PCR儀（Applied Biosystems Veriti）；微量核酸定量儀（NanoDrop 2000C）；高級熒光化學發光系統（FUSION-SL）。

1.3 試劑

Wizard SV Genomic DNA Purification System （Promega，0000178703）；2×EasyTaq PCR SuperMix （TRANS，AS111）；2×KAPA HiFi Hotstart ReadyMix（KAPA，00061748）；2K DNA Marker（TRANS，E110）；Gene Green Nucleic Acid Dye（TIANGEN，P4829）。

2 方法

2.1 基因組DNA的提取、通用引物PCR擴增及測序

選用了Promega Wizard SV Genomic DNA Purification System進行穿山甲鱗甲和筋膜的DNA提取，按照試劑盒的說明，樣品粉碎后取30～50 mg 加入275 μL消化液55 ℃消化處理過夜（16～18 h），隨后進行裂解，釋放基因組DNA，并利用吸附柱吸附，經漂洗液去除蛋白質等雜質后，用雙蒸水500 μL分2次洗脫獲得基因組DNA。各樣品分別用通用引物（表2）以高保真酶擴增COⅠ和Cytb序列并進行測序。PCR擴增體系為2×KAPA HiFi Hotstart ReadyMix 25 μL，正反向引物各1.5 μL，DNA 5 μL，無菌水補足至50 μL。PCR產物經過1.5%瓊脂糖凝膠電泳后對目的片段切膠回收，由北京睿博興科生物技術有限公司測序部測序，各樣品均采用正反雙向測序，以保證結果的準確性。

2.2 序列分析

將測序結果使用MEGA 6.0進行比對并建立構建系統聚類樹（鄰接法），Bootstrap（1 000次重復）檢驗各分支的支持率。

2.3 特異性鑒別引物的設計

將所測得的序列與GenBank中下載的穿山甲序列用BioEdit軟件進行多重比對分析，找出具有穩定差異的特異性片段，篩選獲得變異位點，通過該位點運用Premier Primer 5.0軟件針對中華穿山甲的特異性片段設計鑒別引物，并由睿博興科生物技術有限公司合成。

2.4 特異性鑒別引物篩選

取穿山甲不同樣品DNA進行位點特異性PCR，所用20 μL反應體系為：2×EasyTaq PCR Super Mix 10 μL，正反向引物各0.4 μL，DNA經微量核酸定量儀定量并稀釋至10 mg·L^-1后取1 μL，無菌水補齊。PCR產物通過添加Gene Green 核酸染料染色的1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下顯色觀察。以結果出現特異擴增片段為陽性，無擴增為陰性，由此判斷引物特異性。

2.5 特異性PCR反應條件優化

為優化位點特異性PCR反應條件，分別考察了DNA模板上樣量（3，5，10，30，50，100 ng）、退火溫度（55，57，60 ℃）、PCR循環數對特異性PCR結果的影響。

3 結果與分析

3.1 基于Cytb和COⅠ序列的系統聚類樹構建結果

采用MEGA 6.0分析軟件進穿山甲屬動物Cytb和COⅠ序列系統聚類樹的構建（圖1，2）。亞洲產區與非洲產區的穿山甲分別聚為2支，亞洲產穿山甲中，中華產山甲、印度穿山甲與馬來產山甲又分別聚為一支，種間區分置信度≥99%，表明Cytb和COⅠ序列用于穿山甲的分子鑒定具有可行性。2種序列所建NJ樹中，樣品J8，J11，J12，J15，J16，R2均與NCBI上下載的中華穿山甲序列聚為一支，說明這6個樣品為正品中華穿山甲。而樣品R6，R3，J6為印度穿山甲，R5為樹穿山甲，其余樣品為馬來穿山甲。

3.2 特異性引物篩選結果

用基于Cytb和COⅠ序列設計的中華穿山甲位點特異性引物以各穿山甲樣品DNA為模板進行PCR擴增，篩選獲得一對特異性引物COⅠ-S10/A5。該對引物對中華穿山甲在一定條件下能擴增出400 bp的特異片段，而印度穿山甲、馬來穿山甲和樹穿山甲擴增結果均為陰性；而COⅠ通用引物對所有DNA模板均能有效擴增出750 bp明亮清晰的片段，證明引物COⅠ-S10/A5對中華穿山甲具有良好的特異性（圖3）。

3.3 PCR擴增反應條件優化

3.3.1 DNA模板量的考查 對20 μL PCR 反應體系中的模板DNA用量進行了考察（圖4），DNA在3～100 ng時，中華穿山甲（1，2）能擴增出特異性條帶，且隨模板量減少條帶變暗，模板量降至3 ng時條帶已經難以辨識；偽品在DNA模板量3～100 ng擴增結果均為陰性，因此建議本方法中DNA模板用量以3～100 ng為宜。

3.3.2 退火溫度和PCR循環次數對結果的影響 如退火溫度在55～60 ℃，PCR擴增35個循環時，中華穿山甲（1，2）能擴增出特異性條帶（陽性），且偽品擴增結果為陰性。當PCR循環數減少至28個，正品特異性條帶明顯變弱，甚至無法辨識；循環數增加至時，偽品出現假陽性擴增（圖5，6）。

4 結論與討論

2016年9月舉行的第17屆《瀕危野生動植物種國際貿易公約》締約方大會（CITESCoP17）擬通過了將亞洲和非洲的全部8種穿山甲由原來的《公約》附Ⅱ提升到附錄Ⅰ的提案，全面禁止穿山甲的國際貿易。調查數據顯示，野生穿山甲在亞洲地區已經很難找到，對穿山甲藥用和食用需求，刺激了非洲穿山甲非法走私貿易網絡的形成[17]。Zhang H等收集了大量走私穿山甲樣本并應用法醫學中DNA取證的方法對這些樣本的來源及可能的走私路徑進行了分析，論證了DNA取證的方法在野生動物非法貿易檢測上的應用價值[18]。作為中國傳統用藥的唯一正品來源，中華穿山甲的準確便捷鑒別能一定程度上有效抑制外來穿山甲品種向中國的輸入，并有效打擊國內中華穿山甲的非法捕獵。

本研究通過特異引物篩選和條件優化，確定20 μL PCR反應體系時，基于COⅠ序列設計的引物COⅠ-S10/A5在DNA模板加樣量3～100 ng，退火溫度55～60 ℃時，擴增35個循環可將正品中華穿山甲與其他偽品進行有效的鑒別。由于穿山甲樣品組織的特殊性，選用了Promega Wizard SV Genomic DNA Purification System進行穿山甲鱗甲和筋膜的DNA提取。該方法操作簡單，無酚、氯仿等污染，提取的穿山甲DNA經微量核酸定量儀檢測，其質量濃度在5～100 mg·L^-1，可直接用于本文所篩選的特異性引物進行鑒定。本研究采用該試劑盒進行了炮制穿山甲片DNA的提取實驗，發現取樣量20 mg左右時，DNA量為5～20 mg·L^-1，且蛋白和小分子污染較為嚴重，采用特異性引物進行鑒別時重復性不高，因此對于炮制甲片的鑒別研究有待進一步優化實驗過程。

對于標記片段，分別擴增了線粒體基因片段COⅠ（cytochrome oxidaseⅠ）和Cytb（cytochrome b），其中COⅠ序列為目前研究者普遍推薦的動物DNA通用條形碼序列，對鳥類、魚類、節肢動物、哺乳動物等均具有很好的物種鑒別能力[19]。此外，線粒體DNA具有的分子結構相對簡單，較核DNA容易檢測且不易降解的優勢，適用于穿山甲鱗甲這類DNA提取困難的樣品檢測。

此外，本研究中還構建了穿山甲基于Cytb和COⅠ序列的系統聚類（NJ）樹，成功將不同種穿山甲區分開來，證明Cytb和COⅠ序列均適用于穿山甲的分子鑒定。NJ樹圖顯示，亞洲產區和非洲產區的穿山甲分別聚為一支，其下不同種穿山甲又各自分支聚集。中華穿山甲在我國分布有3個亞種：指名亞種（M. p. pentadactyla）分布于臺灣；華南亞種（M. p. aurita）見于華南一帶 14 個省區；海南亞種（M. p. pusilla ）產于海南[1]。但三者具體鑒別信息少有文獻報道。本文中Cytb和COⅠ序列的NJ樹均顯示，在中華穿山甲分支內部，樣品J11，J12，J15，J16與樣品J8，R2及NCBI上下載的中華穿山甲序列又分別聚為一支，說明這2個分支所在樣品可能為兩個不同的中華穿山甲亞種，為中華穿山甲分類保護與研究提供參考依據。

[參考文獻]

[1] 張立，李麒麟，孫戈，等. 穿山甲種群概況及保護[J]. 生物學通報，2010，45（9）：1.

[2] 吳詩寶. 穿山甲專家組會議在新加坡召開，中國穿山甲升級為極度瀕危動物[J]. 獸類學報，2013，33（3）：214.

[3] Soewu D A，Adekanola T A. Traditional-medical knowledge and perception of pangolins （Manis sps） among the Awori people，Southwestern Nigeria[J]. J Ethnobiol Ethnomed，2011，7（5）：446.

[4] Boakye M K，Pietersen D W，Kotzé A，et al. Ethnomedicinal use of African pangolins by traditional medical practitioners in Sierra Leone[J]. J Ethnobiol Ethnomed，2013，10（1）：76.

[5] Boakye M K，Pietersen D W，Kotzé A，et al. Knowledge and uses of African pangolins as a source of traditional medicine in Ghana[J]. PLoS ONE，2014，10（1）：e0117199.

[6] 胡軒銘，溫成平，謝志軍. 穿山甲古今應用的沿革研究[J]. 中華中醫藥學刊，2012，30（3）：590.

[7] 唐松元，段文武，黃興國，等. 穿山甲資源現狀和人工養殖對策及發展前景[J]. 湖南林業科技，2012，39（3）：75.

[8] 吳詩寶，劉延發，張迎梅，等. 中國穿山甲受危狀況評估[J]. 應用與環境生物學報，2004，10（4）：456.

[9] 吳詩寶，馬廣智，唐玫，等. 中國穿山甲資源現狀及保護對策[J]. 自然資源學報，2002，17（2）：174.

[10] 劉曦慶，彭建軍，高賽飛，等. 穿山甲的走私貿易概況、物種鑒定與形態比較[J]. 林業實用技術，2011，29（5）：11.

[11] 尹峰，盧琳琳，夢夢，等. 穿山甲的貿易與保護[J]. 野生動物學報，2016，37（2）：157.

[12] Gaudin T J，Emry R J，Wible J R. The phylogeny of living and extinct pangolins （Mammalia，Pholidota） and associated taxa： a morphology based analysis[J]. J Mamm Evol，2009，16（4）：235.

[13] 劉遜，朱纓，胡芳，等. 瀕危物種穿山甲的商品調查及其基源鑒定[J]. 亞太傳統醫藥，2015，11（15）：35.

[14] Zhang Y P，Shi L M. Genetic diversity in the Chinese pangolin （Manis pentadactyla ）： inferred from restriction enzyme analysis of mitochondrial DNAs[J]. Biochem Genet，1991，29（9/10）：501.

[15] Tobe S S，Linacre A. A new assay for identifying endangered species in traditional east Asian medicine[J]. Forensic

Sci Int Genet，2011，3（1）：e232.

[16] Gaubert P，Machordom A，Morales A，et al. Comparative phylogeography of two African carnivorans presumably introduced into Europe： disentangling natural versus human-mediated dispersal across the Strait of Gibraltar[J]. J Biogeogr，2011，38（2）：341.

[17] Nijman V，Zhang M X，Shepherd C R. Pangolin trade in the Mong La wildlife market and the role of Myanmar in the smuggling of pangolins into China[J]. Gecco，2016，5：118.

[18] Zhang H，Miller M P，Yang F，et al. Molecular tracing of confiscated pangolin scales for conservation and illegal trade monitoring in southeast Asia[J]. Gecco，2015，4：414.

[19] 張輝，姚輝，崔麗娜，等. 基于COⅠ條形碼序列的《中國藥典》動物藥材鑒定研究[J]. 世界科學技術——中醫藥現代化，2013，15（3）：371.

[責任編輯 呂冬梅]