基于UPLC—Q—TOF—MS/MS技術的短管兔耳草化學成分快速識別研究

謝晶+張麗+曾金祥+李敏+王娟+謝雄雄+鐘國躍+羅光明+袁金斌+梁健

[摘要] 采用超高效液相色譜-串聯四極桿飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF/MS）技術快速分析鑒別短管兔耳草的化學成分，為其臨床應用提供參考依據，試驗采用UPLC-Q-TOF-MS/MS儀器，YMC-Triart C₁₈色譜柱 （2.1 mm×100 mm，1.9 μm），以乙腈-0.2%甲酸水溶液為流動相梯度洗脫；質譜采用電噴霧（ESI）離子源，在負離子模式下采集數據，通過保留時間、精確分子離子峰和二級質譜裂解碎片，并結合參考文獻，對短管兔耳草成分進行鑒定，該實驗共鑒別出22個化合物，其中黃酮類化合物11個，苯乙醇苷類化合物6個，環烯醚萜類化合物1個，有機酸類化合物4個。UPLC-Q-TOF-MS/MS方法能快速鑒別短管兔耳草中的各類化學成分，方法簡單，快速，可為短管兔耳草的臨床應用提供物質依據。

[關鍵詞] 短管兔耳草；UPLC-Q-TOF-MS/MS；化學成分；快速鑒別

[Abstract] The chemical constituents of Lagotis brevituba were rapidly determined and analyzed by using ultra performance liquid chromatography tandem quadrupole time of flight mass spectrometry （UPLC-Q-TOF-MS/MS） method，providing material basis for the clinical application of L. brevituba. The separation was performed on UPLC YMC-Triart C₁₈ （2.1 mm×100 mm，1.9 μm） column，with acetonitrile-water containing 0.2% formic acid as mobile phase for gradient elution. The flow rate was 0.4 mL·min^-1 gradient elution and column temperature was 40 ℃，the injection volume was 2 μL. ESI ion source was used to ensure the data collected in a negative ion mode. The chemical components of L. brevituba were identified through retention time，exact relative molecular mass，cleavage fragments of MS/MS and reported data. The results showed that a total of 22 compounds were identified，including 11 flavones，6 phenylethanoid glycosides，1 iridoid glucosides，and 4 organic acid. The UPLC-Q-TOF-MS/MS method could fast identify the chemical components of L. brevituba，providing valuable information about L. brevituba for its clinical application.

[Key words] Lagotis brevituba；UPLC-Q-TOF-MS/MS；chemical constituents；fast identification

藏藥是我國傳統醫藥的重要組成部分，生長環境獨特藥用效能高，尤其對某些特殊疑難病癥如風濕病、心血管病、胃病等方面顯示出其他藥物無可替代的作用[1]。這些特性說明藏藥具有非常重要的開發價值。如何快速鑒別藏藥化學成分，為藥效活性提供參考依據是當前藏藥進一步現代化開發與應用亟待解決的關鍵問題之一。

短管兔耳草系玄參科兔耳草屬植物Lagotis brevituba Maxim的干燥全草，是著名藏藥“洪連”的主要基原植物，也是2015年版《中國藥典》收載僅有的9種藏藥材之一。其應用歷史悠久，在著名藏醫古籍《月王藥診》、《四部醫典》及《晶珠本草》中均有記載，并被《四部醫典》列為藏草藥之首，具有極高的藥用價值。藏醫學在臨床上用于治療腎炎、高血壓、動脈粥樣硬化癥、全身發燒、肺病、濕熱瀉痢、陰道流黃黑色液物、綜合性毒性中毒及“心熱”等多種疾病。前期研究表明短管兔耳草具有抗炎[2]、抗癌[3]、抗阿爾茨海默病[4]、降尿酸[5]、抗肝損傷[6]等多種作用。這表明藏藥短管兔耳草具有很好的開發與應用前景。物質基礎的闡明是藥物現代化開發的先決條件，因此如何快速闡明短管兔耳草化學成分，為臨床藥效提供物質依據，已成為其現代化開發的決定性因素。

目前短管兔耳草化學成分研究多采用傳統分離純化方法[7-8]。這些方法費時耗力，難以滿足短管兔耳草化學成分快速鑒別的需要。近年來，液質聯用技術集超高效液相色譜的快速高效分離能力和MS的高靈敏度、高選擇性于一體，在中藥領域應用日益廣泛，已成為分離鑒定各種化合物的重要手段[9-10]。因此，本實驗以藏藥短管兔耳草為研究對象，應用超高效液相色譜-串聯四極桿飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技術對其甲醇提取物的化學成分進行研究，根據其準分子離子以及二級碎片離子、文獻數據等鑒定短管兔耳草的化學成分，以為短管兔耳草臨床應用及現代化開發提供支撐。

1 材料

島津LC-30A超高效液相色譜儀，PDA紫外檢測器；YMC-Triart C₁₈色譜柱（2.1 mm ×100 mm，1.9 μm）；Triple-TOF 5600+高分辨質譜儀，配備 ESI 離子源及 Analyst 1.6 數據處理軟件（美國AB Sciex公司）；KQ-5200DB型超聲清洗機（昆山市超聲波儀器公司）；AL204 型電子分析天平[Mettler Toledo 儀器（上海）有限公司]；Millipore-Simplicity 超純水處理系統（德國默克密理博公司）；BUCHI電動旋蒸蒸發儀（瑞士步琪公司）。

大車前苷對照品（純度≥98%，批號MUST-16041508）、 金絲桃苷對照品（純度≥98%，批號MUST-16032113）、木犀草素對照品（純度≥98%，批號MUST-16011015）均購自成都曼思特生物科技公司；毛蕊花糖苷（純度≥97%，實驗室自制）；松果菊苷（純度≥98%，批號P23N7F25444）購于上海源葉生物科技有限公司。乙腈（色譜純，美國anaour公司），甲酸[色譜純，阿拉丁試劑（上海）有限公司]，其余試劑為分析純。短管兔耳草購于成都荷花池藥材市場，經鐘國躍教授鑒定為短管兔耳草L.brevituba的干燥全草。

2 方法

2.1 供試品溶液制備

短管兔耳草全草粉碎，稱取2.0 g，于錐形瓶中加入50 mL 75%甲醇超聲提取30 min，重復3次。抽濾，旋干，用75%甲醇定容至25 mL量瓶中，0.22 μm微孔濾膜過濾，供UPLC-Q-TOF-MS/MS分析。

2.2 標準品溶液的制備

分別精密稱取對照品金絲桃苷2.18 mg、大車前苷2.33 mg、木犀草素2.24 mg、松果菊苷2.07 mg、毛蕊花糖苷2.45 mg分別置于5 mL量瓶中，用75%甲醇溶解并稀釋至刻度，分析前過0.22 μm微孔濾膜，備用。

2.3 LC-MS 條件

2.3.1 色譜條件 YMC-Triart C₁₈分析色譜柱 （2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流動相0.2%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫，0～5 min，5%～15% B；5～14 min，15%～16% B；14～28 min，16%～22% B；28～33 min，22%～95% B；流速0.4 mL·min^-1；柱溫40 ℃；進樣量2 μL。

2.3.2 質譜條件 離子源為電噴霧離子化源（ESI），負離子模式；質量掃描范圍m/z 50～1 200；噴霧電壓-4 500 V；霧化氣溫度550 ℃；氣簾氣30 psi（1 psi=6.895 kPa），輔助氣50 psi；去簇電壓（DP）-100 V；采用AB analyst TF軟件采集數據，TOF-MS一級預掃描和觸發的二級掃描TOF-MS/MS離子累積時間分別為250，150 ms，碰撞能量CE 40 eV，CES碰撞能量疊加為（40±10） eV。

2.4 數據處理

采用AB Sciex公司Peakview 1.6數據處理軟件對UPLC-Q-TOF-MS/MS采集的數據進行處理。

3 結果

3.1 短管兔耳草中化學成分確認

按照1.4.2項下方法對75%甲醇提取短管兔耳草藥材成分進行定性分析，（-） ESI-MS 的質譜總離子流圖（TIC）見圖1。應用Peak View 1.6軟件分析其中各化學成分的保留時間及其質譜信息，并結合其分子離子峰與對照品、文獻報道的數據進行對比，再對其中的化學成分進行辨別，從而鑒定出短管兔耳草提取物中22個化合物，鑒定結果見表1。由于黃酮化合物在質譜中有相似的規律，其具有相同的母核，本次實驗選擇了具有代表性的化合物7，13，19，21詳細分析其裂解過程，苯丙素類選擇化合物9，10，15分析其裂解過程，有機酸類化合物選擇化合物20分析其裂解過程。

3.2 黃酮苷元裂解規律以及其二級碎片離子

化合物7分子組成 C₂₁H₂₀O₁₂，母離子為m/z 463.100 8[M-H]-，相對分子質量為464。其脫去1分子吡喃半乳糖基得到m/z 301.012 4的碎片離子峰。繼而脫去1分子CHO產生m/z 272.030 8，再脫去1個OH得到m/z 255.029 7的碎片離子峰，最后脫去1分子CO得到m/z 227.033 2的碎片離子峰[16]。與對照品金絲桃苷比較，發現其液相出峰時間與其相同，從而證明化合物7為金絲桃苷。

化合物13分子組成C₂₈H₂₈O₁₈，母離子為m/z 651.131 2[M-H]-，相對分子質量為652。二級碎片離子m/z 351.060 8顯示雙葡萄糖醛酸片段，母離子失去1個雙葡萄糖醛酸片段得到m/z 299.057 9的碎片離子峰。其碎片離子峰推斷為香葉木素苷元。苷元發生裂解失去1個CH₃得到m/z 284.035 7碎片離子。香葉木素苷元同時發生RDA裂解產生m/z 193.036 4和m/z 131.035 8黃酮特征碎片離子。根據文獻[15]，推測化合物13為香葉木素-7-O-雙葡萄糖醛酸苷。其裂解見圖2。

化合物19分子組成 C₁₅H₁₀O₆，母離子為m/z 285.042 7[M-H]-，相對分子質量為286。二級碎片離子峰m/z 257.044 0為分子失去1分子CO，繼續失去1分子CO產生m/z 229.052 0的碎片離子峰。同時母核發生RDA裂解分別產生m/z 150.999 3，133.058 2 的碎片離子，這2個碎片離子都是黃酮環裂解的特征離子，可以推斷其為黃酮類化合物。其中m/z 133.025 4 的碎片離子為B環和C環中的殘基組成的，所以其豐度遠大于m/z 150.999 3的豐度[25-26]。之后又與對照品木犀草素進行比對，化合物19出峰時間與對照品相同，質譜裂解規律一致。從而確認化合物19為木犀草素。具體裂解過程見圖3。

化合物21分子組成C₁₆H₁₂O₅，母離子m/z 283.059 6[M-H]-，相對分子質量為284。其裂解脫去甲基產生m/z 268.038 2的碎片離子峰，為基峰。該基峰離子繼續發生裂解，脫去1分子CO生成m/z 240.042 0的碎片離子峰，繼而丟失1個CHO產生m/z 211.038 2碎片離子峰。同時此化合物發生了RDA反應，產生m/z 151.000 3的黃酮特征碎片離子峰。根據文獻[20]，推測化合物21為刺槐素。裂解方式見圖4。

3.3 苯丙素類化合物裂解規律以及其二級碎片離子

化合物9的分子組成為C₂₉H₃₆O₁₆，母離子m/z 639.218 7[M-H]-，相對分子質量為640。二級碎片離子m/z 477.139 4推測為失去了1分子葡萄糖基或者是咖啡?；?，之后進行下一步裂解，產生m/z 315.112 5，表明化合物繼續脫去1分子葡萄糖基或者咖啡酰基。m/z 297.101 2為m/z 477.139 4碎片離子脫去1個相對分子質量為180的中性碎片，其可能是咖啡酰基或者是端基六碳糖基同時失去了1分子的H₂O。而m/z 179.033 3又是m/z 297.101 2的互補離子。m/z 160.999 2則可能為剩下的咖啡?；蛘呤瞧咸烟菤埢摎潆x子。根據文獻[17]，進行對比初步判斷這個化合物為大車前苷，之后又與對照品進行比對，其出峰時間與大車前苷對照品相同，質譜裂解規律一致。最終確認化合物9為大車前苷。其裂解方式見圖5。

化合物15分子組成為C₂₉H₃₆O₁₅，母離子為m/z 623.209 8[M-H]-，相對分子質量為624。質譜圖中出現m/z 477.168 3碎片離子，可能為母離子失去末端的咖啡酞基或葡萄糖基產生的，但是丟失葡萄糖基需要斷裂2個糖苷鍵，證實m/z 477.168 3為斷裂末端咖啡?；目赡苄员容^大?；衔锢^續發生裂解失去146，推測化合物繼續失去1分子鼠李糖基。m/z 315.1188與m/z 135.0422相差180，說明該化合物丟失1個葡萄糖基。其中m/z 135，161為咖啡?；揭掖架盏奶卣麟x子峰，其中m/z 161離子為強峰。根據文獻[21]，可以推測它是毛蕊花糖苷。之后又與對照品相比較，其出峰時間與對照品出峰時間相同，質譜裂解途徑一致，說明推斷正確。毛蕊花糖苷裂解方式見圖6。

化合物10分子組成為C₃₅H₄₆O₂₀，離子峰為m/z 785.287 5[M-H]-，相對分子質量為786。二級碎片離子m/z 623.243 2為準分子離子丟失1個葡萄糖基（C₆H₁₀O₅）產生的產物離子。之后繼續丟失1分子咖啡酰基產生了m/z 461.178 4碎片離子。碎片m/z 623，461是松果菊苷的特征碎片離子。根據文獻[18]，可以初步確定化合物10為松果菊苷，之后與對照品相比對發現其出峰時間與對照品相匹配，質譜裂解途徑一致，說明推斷正確。

3.4 環烯醚萜類化合物裂解規律以及其二級碎片離子

化合物18分子組成為C₂₄H₂₈O₁₁，母離子為m/z 491.163 1[M-H]-，相對分子質量為492。二級碎片離子峰m/z 315.109 3表明分子脫掉相對分子質量為176的肉桂酸基和1分子CO所產生的。m/z 175.040 2為脫去肉桂酸基，其后繼續脫去1分子CO產生m/z 161.024 4的碎片離子，表示大基團發生碎片裂解之后產生了1分子脫氧葡萄糖基。根據文獻[24]，可以推測化合物18為球花苦苷。其裂解過程見圖7。

3.5 有機酸類物質裂解規律及其二級碎片離子

化合物20分子組成為C₁₈H₃₄0₅，母離子為m/z329.237 4[M-H]-，相對分子質量為330。碎片離子峰m/z 229.147 0為失去了1個C₆H₁₂O片段，隨之繼續失去了1分子H₂O生成m/z 211.136 3的碎片離子峰。之后分子脫去1個C₃H₄片段產生了m/z 171.104 6的碎片離子峰，再進行裂解丟失1分子CO₂產生m/z 127.113 5的碎片離子峰。經過文獻[20]比對，化合物20可能為9，12，13-三羥基-10-十八碳烯酸或者是9，10，11-三羥基-12-十八碳烯酸，見圖8。

4 討論

短管兔耳草是重要的藏藥材，具有多種藥理活性，但其物質基礎尚缺少研究。傳統先提取分離純化中藥提取物，得到化合物單體之后再進行核磁共振波譜鑒定結構的成分分析方法操作復雜，工作量大。UPLC-Q-TOF-MS技術結合了超高效液相色譜的快速高分離能力和高分辨質譜的高靈敏度和高精確度，避免了傳統成分分離分析方法的不足，不僅可快速對中藥復雜成分進行定性分析，還具有操作簡單、信息量大、節省溶劑的特點，因而在中草藥成分研究中日益廣泛[29]。

本試驗應用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術分析了短管兔耳草甲醇提取物成分的質譜信息，快速成功鑒別了22個化合物，發現其中含有黃酮、苯乙醇苷、環烯醚萜、有機酸及萜等類多種成分。這些不同的成分具有不同的藥效，如黃酮類化合物金絲桃苷具有抗炎、抗氧化、鎮痛等活性[30]，木犀草素是抗腫瘤的啟動因子，對直結腸癌細胞、鼻咽癌細胞、前列腺癌細胞、人乳腺癌等細胞增殖有顯著的抑制作用，能增敏多種致凋亡因子，具有多靶點抗腫瘤的潛力[31]，木犀草素-7-O-葡萄糖苷能夠保護心肌肉細胞[32]，苯乙醇苷類化合物毛蕊花糖苷具有抗高血壓活性及XOD抑制活性等[33]，松果菊苷可以通過逆轉線粒體功能及細胞凋亡、抗腫瘤壞死因子α誘導的人神經母細胞瘤細胞凋亡，從而促進血管性癡呆鼠腦中膽堿能神經遞質水平等途徑發揮明顯的神經保護效應[34]，原兒茶酸具有抑菌抗炎，有抑制細胞凋亡等多種藥理作用[35]，這些成分為短管兔耳草抗炎、抗高血壓、抗腫瘤、抗阿爾茨默癥等臨床應用提供了較好的物質依據。這表明本試驗推斷出的化合物，在一定程度上闡明了短管兔耳草的藥效物質，為短管兔耳草的臨床應用及開發提供了初步物質依據。

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[責任編輯 曹陽陽]