基于代謝組學研究黃連—黃芩藥對治療腦缺血大鼠的作用機制

曹慧婷+朱華旭+張啟春+郭立瑋

[摘要] 運用代謝組學方法研究黃連-黃芩藥對對腦缺血模型大鼠代謝的作用機制。采用線栓法致大腦中動脈阻塞復制缺血再灌腦損傷大鼠模型（MCAO）。通過超高效液相色譜-串聯四級桿飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF/MS）的方法、Markerlynx軟件、以及主成分分析法和偏最小二乘判別法分析正常大鼠、腦缺血模型大鼠以及分別給予黃連（HL）、黃芩（HQ）和黃連-黃芩藥對（LQ）干預后大鼠尿液樣本中的內源性代謝物的差異，結合內源性代謝物的一級及二級碎片離子的精確信息，檢索并鑒定可能的生物標志物，進而在MetPA數據庫中構建代謝通路。結果在腦缺血模型大鼠的尿液中發現并鑒定出了20種生物標志物，并對其相對含量及代謝途徑進行分析。主要涉及神經遞質調節、氨基酸代謝、能量代謝、脂質代謝等。這些代謝通路在腦缺血模型大鼠的體內發生紊亂，主成分分析表明，正常與腦缺血模型得到明顯區分，而給予HL，HQ，LQ后可以使之向著正常狀態轉變。此研究對腦缺血大鼠代謝組及黃連-黃芩藥對干預的作用機制進行闡釋，體現代謝組學可反映生物體的生理及代謝狀態，能較好地體現藥對是中醫遣方用藥的特色優勢，具有內在的組合變化規律以及中醫藥的整體觀、系統觀以及多成分協同或拮抗作用的特點。

[關鍵詞] 腦缺血；黃連-黃芩藥對；代謝組學；UPLC-Q-TOF/MS

[Abstract] The metabolic effect of Huanglian-Huangqin herb pairs on cerebral ischemia rats was studied by using metabolomic method. The rat model of ischemia reperfusion injury induced by introduction of transient middle cerebral artery occlusion （MCAO） followed by reperfusion. Ultra high performance liquid chromatography-series four pole time of flight mass spectrometry method（UPLC-Q-TOF/MS），Markerlynx software，and principal component analysis and partial least-squares discriminant analysis were used to analyze the different endogenous metabolites among the urine samples of sham rats，cerebral ischemia model rats，Huanglian groups （HL），Huangqin groups （HQ） and Huanglian-Huangqin herb pairs groups （LQ） was achieved，combined with accurate information about the endogenous metabolites level and secondary fragment ions，retrieval and identification of possible biological markers，metabolic pathway which build in MetPA database. The 20 potential biomarkers were found in the urine of rats with cerebral ischemia，which mainly involved in the neurotransmitter regulation，amino acid metabolism，energy metabolism，lipid metabolism and so on. Those metabolic pathways were disturbed in cerebral ischemia model rats，the principal component analysis showed that the normal and cerebral ischemia model is clearly distinguished，and the compound can be given to the normal state of change after HL，HQ，LQ administration. This study index the interpretation of cerebral ischemia rat metabolism group and mechanism，the embodiment of metabonomics can reflect the physiological and metabolic state，which can better reflect the traditional Chinese medicine as a whole view，system view and the features of multi ingredient synergistic or antagonistic effects.

[Key words] cerebral ischemia；Huanglian-Huangqin herb pairs；metabolomics；UPLC-Q-TOF/MS

藥對是單味中藥與若干方劑之間的橋梁，是許多方劑隱含的規律性特征與辨證施治內涵體現[1]。黃連和黃芩作為黃連解毒湯中的君藥和臣藥是其重要的組成部分，方中黃連與黃芩配伍比例為3∶2。黃連-黃芩屬清熱燥濕配伍的經典藥對，兩藥配伍主治上、中二焦，火邪去而熱毒清，均能清熱燥濕、瀉火解毒[2-3]。代謝組學是對一個生物系統的細胞在給定時間和條件下所有小分子代謝物質的定性定量分析，從而描述生物內源性代謝物質的整體規律，并且將在內外因素作用下產生的代謝物質的動態變化與病理生理相關聯。代謝組學處于生命信息傳遞的終端，它是能表現出生物體系整體功能或狀態的最終結果而拋開體內復雜的生理過程的一種系統生物學科學[4-6]。本實驗室前期研究黃連解毒湯在腦缺血模型大鼠體內藥代動力學和藥效學，探究其在體內的分布及代謝特點，尋找中藥復方中蘊含的潛在規律和方證對應的合理性，結果黃連解毒湯中有效成分對腦缺血病癥大鼠具有一定的調節作用。在此基礎上本實驗以大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occusion，MCAO）模型大鼠為研究對象，采用代謝組學技術、模式識別方法并結合代謝組網絡數據庫對大鼠尿液中代謝物進行研究，探討正常與模型大鼠其尿液中的內源性代謝物的整體變化，分析鑒定潛在生物標志物及代謝通路，尋找黃連解毒湯干預后代謝產物動態變化規律及抗腦缺血的生物學作用機制。

1 材料

1.1 儀器與試劑 美國Waters UPLC AcquityTM系統；BEH C₁₈色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；SynaptTMQ -TOF質譜儀，配有Lock-spray接口，ESI離子源和MassLynx 4.1質譜工作站軟件。 抗酸型冷凍離心濃縮儀（Labconco）；臺式冷凍離心機（Thermo Fisher）；真空冷凍干燥儀（Biocool）。純凈水由南京易普易達純水儀制得。乙腈（色譜純，Merck公司）；甲酸（色譜純，Merck公司）；水合氯醛（成都科龍化工試劑廠，批號20160225）；疊氮鈉（NaN₃，分析純，天津市福晨化學試劑廠）；TTC染色液（2%，南京邁博生物科技有限公司）。其他試劑均為分析純。黃連、黃芩及黃連-黃芩藥對水提液由實驗室自制。

1.2 動物 SPF級SD大鼠35只，雄性，體重（250±20） g，購自浙江省實驗動物中心，合格證號SCXK（浙）2014-0001。大鼠分籠飼養，飼養環境溫度20～25 ℃，相對濕度55%～65%。

1.3 藥材及樣本制備 黃連（批號151203）、黃芩（批號151202），均購于安徽福春堂中藥飲片有限公司，經南京中醫藥大學吳啟南教授鑒定，符合2015年版《中國藥典》規定。稱取黃連、黃芩飲片各500 g，按黃連解毒湯中黃連與黃芩的比例（3∶2）稱取藥材飲片，混合，共500 g，分別水煎煮2次，第1次10倍量水，煎煮1.5 h；第2次8倍量水，煎煮1 h；水提取液合并、濃縮、真空冷凍干燥，得3組凍干粉，含生藥分別為3.97，3.85，4.31 g·g^-1。精密稱取一定量提取物置研缽中，加入少許0.5%的羧甲基纖維鈉（CMC-Na）液，研磨后按照生藥量濃度加0.5% CMC-Na液制成混懸液。

2 方法

2.1 動物模型復制 大鼠MCAO模型復制方法：大鼠10%水合氯醛腹腔注射（1 g·kg^-1）麻醉，躺位固定，用碘伏消毒皮膚，在頸部偏右方切口，鈍性分離，分離右頸總動脈（CCA）、頸內動脈（ICA）及頸外動脈（ECA）并掛線備用，結扎ECA，用動脈夾夾閉ICA遠心端和CCA近心端后，迅速于分叉處下ECA上做一切口，從切口處插入MCAO線栓（直徑為0.125 mm，距球端18 mm處作標記）。線插入ICA后，于入口處稍稍結扎線栓與入口處ICA段，至線栓插入深度為（18±0.5） mm左右。再次結扎入口處，線栓外留約1 cm，縫合皮膚。2 h后輕輕提拉所留線頭至有阻力，實現大腦中動脈再灌，則造模完成。動物入選的標準（按照Zea Longa 5級評分法取評分為2，3，4分的動物）：動物于缺血2 h后出現對側前肢倦曲、行走轉圈或行走向對側倒體征則納入，動物無此體征或于2 h后仍不清醒者棄去。

2.2 動物分組和給藥 實驗動物按體重隨機分為5組，每組7只，分為對照組（Sham）、模型組（MCAO）、黃連組（HL）、黃芩組（HQ）和黃連-黃芩藥對組（LQ）。按照實驗室前期做黃連解毒湯組給藥劑量為生藥20 g·kg^-1·d^-1換算相應劑量，灌胃體積2 mL· 100 g^-1。對照組和模型組灌胃給藥等劑量的生理鹽水，連續灌胃7 d。

2.3 TTC染色 將各組大鼠生理鹽水、多聚甲醛灌注后取腦，-20 ℃速凍20 min后切片，37 ℃恒溫TTC染色。

2.4 尿液樣品的采集和處理 各組大鼠均于末次給藥后連同正常組大鼠禁食不禁水，收集尿液12 h，接尿管中加1 mL 1%NaN₃為抑菌劑和防腐劑，收集的尿液于4 ℃離心機3 000 r·min^-1離心10 min后，取2 mL上清液-80 ℃冷凍保存至分析。分析前將尿液樣品于室溫解凍，解凍后精密吸取尿液200 μL，加入甲醇600 μL，渦旋振蕩2 min，于4 ℃，13 000 r·min^-1離心10 min，取上清液，37 ℃離心濃縮至干，殘渣用200 μL 70%乙腈水溶液復溶，渦旋振蕩2 min，于4 ℃，13 000 r ·min^-1離心10 min，取上清液用于進樣檢測。

2.5 色譜和質譜條件 色譜條件：流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈。梯度洗脫： 0～1 min，95%A；1～13 min，95%～5%A；13～14 min，5%A；14～15 min，5%～95%A。柱溫35 ℃，流速0.4 mL·min^-1，進樣量2 μL。質譜條件： 毛細管電壓3.0 kV，離子源溫度120 ℃，脫溶劑氣溫度350 ℃，錐孔電壓45 V，離子能量1.0 V，錐孔氣流量50 L·h^-1，脫溶劑流量600 L·h^-1，碰撞能量4 eV，掃描時間為0.5 s，間隔掃描時間為0.02 s。

2.6 代謝組學數據處理與分析 樣品經過Waters公司的UPLC-Q-TOF/MS分析得到代謝指紋輪廓圖譜。質譜數據采用Waters公司的MassLynx軟件v4.1進行總離子流提取、峰對齊及歸一化處理。主要參數包括：保留時間0～15 min；質荷比m/z 100～1 000（±0.01），峰強度閾值50，質量窗口0.05 Da，保留時間窗口0.20 min，自動檢測5%峰高及噪聲。利用MarkerLynx軟件對峰面積、樣品名稱和離子強度組成的數據表進行分析。在進行多元變量分析前要對每個檢測峰的離子強度進行標準化，即對原始變量進行Pareto標尺化處理。將處理后的數據按照“一種用于代謝組學數據處理中消除外源性成分干擾的分析方法”[7-8]，然后將剔除后的數據導入EZinfo 2.0進行有監督的偏最小二乘判別法（PLS-DA）進行分析。使用SPSS 16.0軟件進行統計學處理，2組間比較采用t檢驗，檢驗標志性代謝物組間差異的顯著性，顯著性標準界值定為P<0.05。

3 結果

3.1 TTC染色 結果顯示Sham組兩側大腦半球呈均勻一致紅色，MCAO組見右側紋狀體及額頂葉皮質失染區呈白色，而且邊緣清晰；HL，HQ，LQ組失染區范圍均小于MCAO組，而且緣清晰，見圖1。

3.2 大鼠尿液樣品代謝指紋譜的建立和多變量數據分析 采用UPLC-Q-TOF/MS在正負離子模式下進行尿液樣品的代謝分析，正負離子模式下對照組大鼠、腦缺血模型組大鼠、黃連組、黃芩組和黃連-黃芩藥對組大鼠的典型總離子流圖見圖2。為了考察腦缺血模型大鼠體內代謝物的整體變化，采用PCA方法對正常組和模型組大鼠尿液代謝物譜數據進行模式識別，得到樣品分布圖，它能夠反映樣品之間的相似性、差異程度，圖譜差異小的樣品在散點圖中的位置相互靠近；反之，差異較大的樣品距離較遠。所得的PLS-DA模型的R2Y和Q2分別為0.935和0.627，表明該模型是可靠的。A1，A2為模型組小鼠尿液代謝譜的分類，可以看出，在正、負離子模式下，腦缺血模型組與對照組得到明顯區分，說明模型復制成功，與正常組相比腦缺血模型大鼠機體內發生代謝異常，見圖3。

3.3 潛在生物標志物的鑒定通過 PLS-DA 分析，正常組、腦缺血模型組大鼠、黃連組、黃芩組和黃連-黃芩藥對組的PLS-DA載荷圖中的每一個點代表一個變量，變量對分類的重要程度（variable importance in the projection，VIP）由其值的大小來衡量，并依據VIP對變量進行篩選。VIP>1且具有統計學意義的變量被認為對模型有顯著貢獻。距離中心越遠的點對差異的貢獻度越大，越有可能是潛在的特征代謝物。

將潛在的生物標志物根據其質荷比及其串聯質譜數據，在HMDB（http：//www.hmdb.ca/） 和KEGG （http：//www.genome.jp/kegg/） 公共數據庫中進行檢索和確認[8]，并與文獻進行比較，共鑒定出 20個潛在的生物標志物，其質譜數據信息以及在對照組與腦缺血模型組大鼠尿液中的變化見表1。與正常組比較，模型組大鼠尿液中有變化的代謝物包括：L-乳酸、L-蘇氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-犬尿氨酸、L-脯氨酸、?；撬帷④浿?、褪黑素、肌苷呈上調趨勢，L-天冬酰胺、同型半胱氨酸、檸檬酸、硬脂酸、花生四烯酸、煙酰胺呈下降趨勢。在給予黃連、黃芩及黃連-黃芩藥對后，均有不同程度的回調現象，見圖4，5。

3.4 代謝通路分析與干預機制探討 將表1中的生物標志物輸入MetPA（http：//www.metaboanalyst.ca/）數據庫中，構建代謝通路。大腦中動脈栓塞（MCAO）所致腦缺血模型大鼠體內的代謝紊亂主要與8條代謝途徑相關，見圖6。在給予HL，HQ，LQ后，代謝物的含量得到一定程度的回調，代謝通路的紊亂有所改善，從代謝層面體現HL，HQ，LQ對腦缺血模型有較好的治療作用。鑒定的20個生物標志物中，苯丙氨酸參與苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成和苯丙氨酸代謝，?；撬釁⑴c?；撬岷蛠喤；撬岽x；花生四烯酸參與花生四烯酸代謝；檸檬酸參與乙醛酸和二羧酸代謝，煙酰胺參與煙堿和煙酰胺代謝；精氨酸、脯氨酸參與精氨酸和脯氨酸代謝，犬尿氨酸、褪黑素參與色氨酸代謝。

4 討論

4.1 神經遞質調節 γ-氨基丁酸（GABA）是一種抑制性神經遞質，GABA代謝的改變可能是造成腦缺血引起的神經元損傷的一個重要因素[9]，在腦缺血損傷早期GABA水平急劇升高，使突觸后神經元處于保護性抑制狀態，并可通過突觸前抑制作用，減少谷氨酸的釋放協助Ca²⁺等離子的轉運，維持細胞內外滲透壓[10] ，減輕細胞損傷，增強神經元對缺血的耐受性，缺血導致血腦屏障損害，大量GABA進入尿液，不能發揮神經保護作用[11]。郭昫等[12]采用此法造模給藥后，測定大鼠丘腦中谷氨酸和γ-氨基丁酸含量，結果發現，黃連解毒湯藥材總黃酮可以促進腦缺血模型大鼠丘腦中谷氨酸和GABA 含量恢復至正常水平。正常情況下，天冬氨酸 （Asp） 主要存在于神經末梢內的囊泡內，當末梢因膜去極化而興奮時被釋放到細胞間隙[13]。大腦局部缺血后，由于能量缺乏，從細胞內釋放的谷氨酸數量增加，細胞外谷氨酸濃度迅速升高[14]。在給與黃連、黃芩、黃連-黃芩藥對干預后，GABA、天冬氨酸含量下調，與文獻報道一致。

4.2 氨基酸代謝 同型半胱氨酸是動脈粥樣硬化、血栓栓塞、血管損傷的獨立致病因素，并與腦缺血、冠狀動脈疾病、類風濕關節炎及阿爾茲海默病等疾病高度相關[15]。甜菜堿（Met）可作為甲基供體，完成再甲基化的替代過程，在體內參與蛋氨酸循環，同型半胱氨酸含量升高可以在甜菜堿高半胱氨酸甲基

轉移酶作用下利用Met提供的一個甲基轉化為甲硫氨酸，導致肝代謝異常可能引起各種疾病，如冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、腦部肝部和血管病變[16]。牛磺酸（Tau）是腦內的一種抑制性氨基酸，具神經保護作用，腦缺血損傷時其胞外含量升高[16-17]，它可以調整腦內興奮性氨基酸的含量。龍建飛等[18]采用MCAO模型大鼠為研究對象，結果表明黃連解毒湯水提取物、總生物堿總黃酮和總環烯醚萜可通過抑制神經元中Caspase-3 活性，保護缺血半暗帶神經元。

4.3 能量代謝 乳酸是厭氧糖酵解的終產物，也是腦缺血/缺氧后，神經恢復有氧能量代謝的重要底物。腦缺血過程中，腦組織不能進行正常的有氧代謝，有氧呼吸受到抑制，能量代謝紊亂，無氧酵解加重，葡萄糖通過無氧酵解的方式產生少量ATP，同時，丙酮酸經乳酸脫氫酶（LDH）催化還原生成乳酸，乳酸含量上升[19-20]。張明發[21]發現黃連解毒湯中主要成分小檗堿可能有抗自由基作用，能增加整體小鼠耐缺氧能力，降低氧耗，并通過抑制腺許酸環化酶，對抗缺氧時兒茶酚胺釋放過多所造成的組織耗氧增加。因而推測小檗堿通過抗缺氧，降低腦組織耗氧等途徑抗氧自由基損傷。三羧酸循環（TCA）開端是在檸檬酸合成酶的催化下，草酰乙酸和乙酰輔酶A進行不可逆反應生成檸檬酸。三羧酸循環是細胞線粒體中重要的能量代謝途徑，大腦缺血時，能量代謝失衡，三羧酸循環的相關代謝物發生應激性改變[22]。王月華等[23]觀察小續命湯有效成分組對慢性缺血大鼠腦線粒體的作用。結果表明小續命湯有效成分組能夠減輕缺血缺氧導致的線粒體功能異常及其結構損傷，降低缺血缺氧損害后導致的線粒體活性氧產生和凋亡。

4.4 脂質代謝 花生四烯酸（AA）是一種重要的人體必須脂肪酸，是人體前列腺素合成的重要前體物質，具有舒張血管、激活和抑制血小板聚集、參與造血和免疫調節[24]、誘導和抵抗致炎作用、調節神經內分泌和促進細胞分裂等[25] 。近年來研究表明，在病理狀態下，花生四烯酸副產品可以阻塞星形膠質細胞的縫隙連接通道，進而增加神經元對氧化損傷的易感性。

4.5 激素調節 褪黑素（M）T是一種主要由松果體分泌的神經分泌激素，是高效的自由基清除劑和抗氧化劑[26]，并具有一定的抗炎作用，能夠修復腦缺血引起的DNA損傷，減輕腦缺血時的微血管損害，保護線粒體功能及阻止細胞能量耗竭等。Stefanova N A等[27]發現長期服用褪黑素可顯著減輕散發性阿爾茨海默病患者大腦中可能是神經元突觸發生病變產生毒性Aβ-淀粉樣蛋白積累的破壞作用。

5 結論

本研究采用代謝組學方法揭示了大腦中動脈阻塞所致的腦缺血模型大鼠與空白大鼠的內源性代謝產物的差異，并探討了黃連-黃芩干預的作用機制。給予黃連-黃芩，對其內源性代謝產物具有較明顯的調節作用，提示黃連、黃芩及黃連-黃芩藥對可能能夠一定程度的調整腦缺血所致的神經遞質紊亂（天冬氨酸含量下降，γ-氨基丁酸含量升高）、能量代謝不足（葡萄糖、檸檬酸含量下降，乳酸含量上升）、氨基酸代謝異常（同型半胱氨酸含量下降，甜菜堿、牛磺酸含量升高）、脂質代謝異常（花生四烯酸含量下降）等。其可能涉及的作用機制主要有興奮性氨基酸毒性；細胞信號轉導（包括Ca²⁺超載和NO損傷）；線粒體損傷；氧自由基大量生成；星形膠質細胞和神經元網絡等?，F代藥理學研究表明黃連解毒湯臨床研究多集中在腦血管病變和精神系統疾病領域，臨床上可用于抗腦缺血、抗氧化、降壓等疾病。此外，代謝組學為模型動物體內代謝、循環狀態的變化及藥物可能的作用機制研究提供指導，并且它所反映的整體觀念與中藥整體思想和復雜體系的特點相吻合，對中藥作用機制、方證對應依據、配伍規律等方面的研究提供技術支撐。

[參考文獻]

[1] 唐于平，束曉云，李偉霞，等.藥對研究（I）——藥對的形成與發展[J]. 中國中藥雜志，2013，38（24）：4185.

[2] 陳維華.試論黃連的對藥配伍應用[J].中醫藥臨床雜志，2005，17（5）：506.

[3] 王付.仲景方黃連藥對研究與應用[J]. 中醫藥通報，2007，6 （5）：28

[4] 李文仕.代謝組學研究與應用新進展[J].今日藥學，2013，23（6）：394.

[5] 孫啟慧，張靜，李壯壯，等. 基于代謝組學的麻黃細辛附子湯治療流感小鼠的作用機制研究[J]. 中國中藥雜志，2017，42（4）：763.

[6] 張愛華，王喜軍. 中醫藥的代謝組學研究[J]. 世界科學技術——中醫藥現代化，2013（4）：643.

[7] 劉樹民，閆廣利，柳長鳳，等.一種用于代謝組學數據處理中消除外源性成分干擾的分析方法：中國，201110230853.0 [P]. 2011-08-12.

[8] 李偉霞，黃美艷，唐于平，等.基于代謝組學研究佛手散對血虛小鼠的養血補血作用機制[J]. 藥學學報，2013，48（8）：1301.

[9] Kang T C，Park S K，Hwang I K，et al. Spatial and temporal alterations in the GABA shunt in the gerbil hippocampus following transient ischemia[J]. Brain Res，2002，944（1/2）：10.

[10] Olthof M R，Verhoef P. Effects of betaine intake on urine homocysteine concentrations and consequences for health[J]. Curr Drug Metab，2005，6（1）：15.

[11] 張天舒，阮志，劉霞，等.MCAO大鼠腦缺血再灌注損傷機制的核磁共振代謝組學研究[J]. 中國藥科大學學報，2016，47（2）：188.

[12] 郭昫，莊偉，林曉蘭，等. 黃連解毒湯對腦缺血模型大鼠丘腦中氨基酸含量的影響[J].中國藥房，2015，26（16）： 2216.

[13] 張焰，陳群，顧衛東，等.燈盞花素對腦缺血再灌注沙土鼠興奮性氨基酸釋放和學習記憶能力的影響[J]. 中華實用中西醫雜志，2004，4（17）：1930.

[14] 張天舒.基于NMR代謝組學技術的腦缺血FF再灌注損傷分子化制研究[D].上海：華東理工大學，2015.

[15] Miller A L. The methionine-homocysteine cycle and its effects on cognitive diseases[J]. Altern Med Rev，2003，8（1）：7.

[16] Craig S A. Betaine in human nutrition[J]. Am J Clin Nutr，2004，80（3）：539.

[17] Olthof M R，Verhoef P. Effects of betaine intake on urine homocysteine concentrations and consequences for health [J]. Curr Drug Metab，2005，6（1）：15.

[18] 龍建飛，張弛，張秋霞，等.黃連解毒湯有效部位對腦缺血大鼠半暗帶神經元NeuN、Caspase-3、PARP 表達的影響[J]. 北京中醫藥大學學報，2014，37（2）： 90.

[19] 靳令經，楊振燕. 急性缺血性腦卒中磁共振成像新技術進展[J]. 同濟大學學報：醫學版，2002，23（5）：445.

[20] 胡珺，陳蕓蕓，邢東明，等. 腦缺血時乳酸的生成、轉運、代謝和利用[J]. 中國藥理學通報，2008，24（3）：284.

[21] 張明發.小檗堿的抗整體小鼠缺氧作用[J]. 中國藥理學通報，1991，7（1）：70.

[22] Yang M X，Wang S，Hao F H，et al. NMR analysis of the rat neurochemical changes induced by middle cerebral artery occlusion[J]. Talanta，2012，88：136.

[23] 王月華，賀曉麗，李曉秀，等.小續命湯有效成分組對慢性腦缺血大鼠腦線粒體的保護作用[J]. 中西醫結合學報，2012，10（5）：569.

[24] Bell J G，Ashton I，Secombes C J，et al. Dietary lipid affects phoepholipid fatty acid compositions，eicaeenoid production and immune function in Atlantic salmon[J]. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids，1996，54：173.

[25] 袁成凌，姚建銘，余增亮.花生四烯酸及其代謝物的生物學作用[J]. 中國藥物化學志，2000，10（11）：75.

[26] Reiter R J，Tan D X，Qi W，et al. Pharmacology and physiology of melatonin in the reduction of oxidative stress in vivo[J]. Biol Signal Recept，2000，9（3/4）：160.

[27] Stefanova N A，Maksimova K Y，Kiseleva E，et al. Melatonin attenuates impairments of structural hippocampal neuroplasticity in OXYS rats during active progression of Alzheimer sdisease-like pathology[J]. J Pineal Res，2015，59：163.

[責任編輯 張燕]