新疆兩色金雞菊中原花青素含量測定體系考察

劉謝英，馮玉潔，冶曉童，姚新成，2，*

（1.石河子大學藥學院，新疆石河子832000；2.石河子大學新疆特種植物藥資源教育部重點實驗室，新疆石河子832000）

新疆兩色金雞菊中原花青素含量測定體系考察

劉謝英1，馮玉潔1，冶曉童1，姚新成1，2，*

（1.石河子大學藥學院，新疆石河子832000；2.石河子大學新疆特種植物藥資源教育部重點實驗室，新疆石河子832000）

為準確測定新疆兩色金雞中原花青素含量，選擇合適的對照品和測定體系。通過比較香草醛-鹽酸、正丁醇-鹽酸、鐵鹽（Fe3+）催化法、pH示差法等多種測定體系下，兩色金雞菊提取物和對照品兒茶素或原花青素的連續波長掃描圖譜，考察光譜吸收曲線的一致性和λmax峰位值，進而選擇適合測定兩色金雞菊中原花青素含量的顯色反應體系。結果表明，兩色金雞菊提取物與原花青素對照品在正丁醇-鹽酸、Fe3+催化法和pH示差法產生的光譜吸收曲線相似，λmax峰位值更接近。因此，可以用這3種體系快速測定兩色金雞菊中原花青素的含量。結果顯示，在特定的測定體系中，選擇合適的對照品能準確測定新疆兩色金雞菊中原花青素的含量。

兩色金雞菊；原花青素；顯色反應體系

兩色金雞菊（Coreopsis tinctoria Nutt.）為菊科金雞菊屬、蛇目菊種一年生草本植物蛇目菊的全草。原產于美洲內陸干旱地區，主要作為景觀植物栽培，后分布于世界各地。在我國，兩色金雞菊野生資源較為豐富。主要分布于新疆海拔1 500 m～3 000 m的昆侖山區，故又稱“昆侖雪菊”、“雪菊”、“昆侖血菊”。當地居民常采集新鮮頭狀花序浸泡當花茶飲用，可治療燥熱煩渴、高血壓、心慌、胃腸不適、食欲不振等病癥。新疆維吾爾醫院也將其作為一種維吾爾藥材使用，具有清熱解毒、活血化瘀和胃健脾之功效[1]。目前，新疆兩色金雞菊被人們廣泛用作茶飲品在使用。研究表明，兩色金雞菊富含黃酮類、酚類、多糖、皂苷類、氨基酸、揮發油、多種微量礦物質元素等化學成分，具有較高的食用價值[2-3]。

有文獻報道，新疆兩色金雞菊頭狀花序（Coreopsis tinctoria flowering tops，CTFT）中含大量的花色苷類和原花青素成分[4]。而該類物質具有類黃酮C6-C3-C6骨架結構，因此在測定過程中易受到黃酮類物質成分干擾而使測定結果不準確。目前，對原花青素的含量測定多采用比色法和HPLC法。HPLC法具有快速準確等優點，但由于無法獲得樣品中所有待測組份的對照品，只能測定其中的個別成分進行定量，測定結果并不能代表整體原花青素的含量[5]。而比色法具有簡單、快速等優點。在選擇合適對照品做參照和適當的反應體系下，比色法可以準確測定某一類物質的含量。因此，選取合適的標準對照物質，建立適當的測定反應體系，準確測定新疆兩色金雞菊中原花青素的含量，對控制該天然植物質量，開發相關功能性食品和綜合利用該植物資源是很有意義的。

1 材料與方法

1.1 材料

兩色金雞菊購于新疆和田地區策勒縣努爾鄉昆侖山區高海拔種植區（2013年11月），經石河子大學藥學院李鵬副教授鑒定為菊科金雞菊屬一年生草本植物蛇目菊的干燥頭狀花序。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

UV-2041PC紫外分光光度儀：日本島津；BP211D十萬分之一電子分析天平：北京Sartorius；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵：鞏義市英峪予華儀器廠；TP300超聲波提取器：北京天鵬電子新技術有限公司；旋轉蒸發儀RE-2000：上海亞榮生化儀器廠；Quorum K750X冷凍干燥儀：英國；5-1000 μL手動移液器：蘇州百得儀器有限公司；恒溫水浴鍋：北京光明醫療器械廠。

1.2.2 試劑

甲醇、正丁醇、濃鹽酸、香草醛、硫酸鐵銨等均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司；水為去離子純凈水。

1.2.3 試藥

原花青素，化學對照品（含量＞98%）：廣州超粵生物科技有限公司；兒茶素，化學對照品（含量＞99%）：中國藥品生物制品檢定所。

1.3 方法

1.3.1 兩色金雞菊中原花青素的提取

兩色金雞菊研碎，過20目篩。采用響應面法優化超聲波提取條件：液料比21∶1（mL/g），乙醇濃度為60%（含1%乙酸），提取30 min（250 W，40 kHZ）。提取物經減壓濃縮、冷凍干燥即得。

1.3.2 原花青素的含量測定體系考察

1.3.2.1 樣品溶液、兒茶素和原花青素對照溶液UVVis吸收譜圖

分別移取兒茶素甲醇標準溶液（1.0 mg/mL）、原花青素甲醇標準溶液（0.2 mg/mL）和CTFT提取物甲醇液（2.0 mg/mL）各1.0 mL至10.0 mL試管中，加入9.0 mL甲醇，搖勻。以甲醇為空白對照，在波長200 nm～600nm范圍內進行全波段掃描。

1.3.2.2 香草醛-鹽酸顯色反應體系[6]

國內多數文獻報道測定原花青素含量采用此法。該法的原理是原花青素在鹽酸/硫酸反應體系中，C6-C3-C6中A環有較高的化學活性，其結構中的間苯三酚或間苯二酚與香草醛發生縮合，產物在濃酸作用下就會形成有色的正碳離子。原花青素是一大類雙黃酮衍生物的多酚化合物的總稱，是由多羥基黃烷-3-醇單元構成的低聚體或多聚體，由不同數量的兒茶素或表兒茶素結合而成。香草醛-鹽酸主要與原花青素單體和低聚體反應，故初步判斷可以用原花青素或兒茶素作為對照品，測定樣品中的原花青素含量。具體測定過程如下：

1）以兒茶素為對照品香草醛-鹽酸顯色反應體系

分別移取兒茶素甲醇標準品溶液（1.0 mg/mL）和CTFT提取物甲醇液（0.4 mg/mL）各1.0 mL至10.0 mL試管中，加入6.0 mL香草醛甲醇溶液（4%）和3.0 mL濃鹽酸，搖勻。水浴30℃條件下避光反應30 min。反應產物以甲醇稀釋至合適濃度（吸光度A=0.2～0.8），以甲醇為空白，在波長400 nm～700 nm范圍內進行全波段掃描。

2）以原花青素為對照品香草醛-鹽酸顯色反應體系

分別移取原花青素標準品溶液（0.2 mg/mL）和CTFT提取物甲醇液（0.4 mg/mL）各1.0 mL至10.0 mL試管中，加入1.25 mL香草醛甲醇溶液（1%）和1.75 mL鹽酸溶液（8%），搖勻。水浴30℃避光反應20 min。反應產物以甲醇稀釋至合適濃度（吸光度A=0.2～0.8），以甲醇為空白，在波長400 nm～700 nm范圍內進行全波段掃描。

1.3.2.3 正丁醇-鹽酸顯色反應體系[7]

該法的原理是原花青素聚合體在正丁醇-鹽酸反應體系中，經高溫加熱產生有色物質，而生成有色物質的量與原花青素的量成正比。在正丁醇-鹽酸反應體系中，兒茶素或表兒茶素等單體不易發生反應，故在該反應體系中常選擇原花青素作對照品進行含量測定。

測定過程：分別移取原花青素甲醇對照品溶液（0.5 mg/mL）和CTFT提取物甲醇溶液（4 mg/mL）各1.0 mL至10.0 mL具塞試管中，再加入6.0 mL正丁醇-鹽酸溶液（95∶5），搖勻。沸水浴40 min后迅速冷卻至室溫。反應產物以正丁醇-鹽酸溶液（95∶5）稀釋至合適濃度（吸光度A=0.2～0.8），以正丁醇-鹽酸溶液為空白，在400 nm～700 nm范圍內進行全波段掃描。

1.3.2.4 鐵鹽（Fe3+）催化比色法[8]

該法原理與鹽酸-正丁醇法相似，即以正丁醇和鹽酸為反應介質，原花青素在酸性條件下加熱轉化成為紅色的花青素。與正丁醇-鹽酸反應體系不同之處是加入Fe3+離子為催化劑，使生成物顯色反應更靈敏。

測定過程：分別移取原花青素甲醇對照品溶液（0.5 mg/mL）和CTFT提取物甲醇溶液（2.0 mg/mL）各1.0 mL至10.0 mL具塞試管中，加入0.20 mL硫酸鐵銨鹽酸溶液（2.0 mol/L），混勻。再加入6.0 mL正丁醇-鹽酸溶液（95∶5），搖勻。沸水浴40 min后迅速冷卻至室溫。反應產物以正丁醇-鹽酸溶液（95∶5，體積比）稀釋至合適濃度（吸光度A=0.2～0.8），以正丁醇-鹽酸溶液為空白，在波長400 nm～700 nm范圍內進行全波段掃描。

1.3.2.5 pH示差分光光度法[9-10]

該法的原理是原花青素或花青素在不同的pH值條件下，存在藍色的醌式（脫水）結構、紅色的正離子結構、無色的甲醇假堿和類查爾酮等4種結構。在低pH值時，溶液呈現最強的紅色，隨著pH值的增大，溶液逐漸褪至無色?？筛鶕煌琾H值條件下光譜的變化測定原花青素色素含量。

測定過程：移取1.0 mL CTFT提取物甲醇溶液（0.4 mg/mL）3份至10.0 mL具塞試管中。其中2份分別加入9.0 mL（pH=6、3）的緩沖溶液，30℃避光水浴80 min。以相應的緩沖溶液為空白，在波長200 nm～500 nm范圍內進行全波段掃描。

2 結果與分析

2.1 CTFT提取物與兒茶素和原花青素標準對照溶液連續波長掃描圖

按1.3.2.1項下內容進行操作，獲得兒茶素、原花青素和CTFT提取物連續波長掃描圖。結果見圖1。

由圖1可知，樣品提取液、兒茶素和原花青素標準對照液在紫外區200 nm～300 nm范圍內吸收圖譜相似，最大吸收波長均在（280±1）nm，說明樣品中含有花青素類物質；但樣品提取液本底吸收較高，顯示有明顯的干擾成分。同時，可見區有明顯的吸收峰，說明樣品中有大量的有色物質如花色苷等。因此，不能采用兒茶素或原花青素為對照品UV法直接測定兩色金雞菊中原花青素含量。

圖1 兩色金雞菊提取物與兒茶素和原花青素標準對照溶液連續波長掃描圖Fig.1 The spectrogram of CTFT extract，catechin and proanthocyanidin standards at 200 nm～600 nm

2.2 香草醛-鹽酸顯色反應體系

按1.3.2.2項下內容進行操作，獲得兒茶素、原花青素和CTFT提取物連續波長掃描圖。結果見圖2。

圖2 兩色金雞菊提取物與兒茶素和原花青素標準對照在香草醛-鹽酸顯色反應體系連續波長掃描圖Fig.2 The spectrogram of CTFT extract，catechin and proanthocyanidin standards in vanillin-hydrochloric acid reaction system

由圖2可知，在香草醛-鹽酸顯色反應體系中，兒茶素和原花青素標準對照液在360 nm～600 nm范圍內吸收圖譜相似，最大吸收波長均在（500±2）nm；但CTFT提取液吸收圖譜與之差異較大，最大吸收波長（522±2）nm。因此，該反應體系也不適合測定兩色金雞菊中原花青素含量。

2.3 正丁醇-鹽酸顯色反應體系

按1.3.2.3項下內容進行操作，獲得原花青素和CTFT樣品連續波長掃描圖。結果見圖3。

由圖3可知，在正丁醇-鹽酸顯色反應體系中，樣品和原花青素標準對照液在400 nm～700 nm范圍內吸收圖譜相似，最大吸收波長均在（538±2）nm，而且樣品本底吸收很低，干擾較少。因此，該反應體系可用于測定兩色金雞菊中原花青素的含量。

圖3 兩色金雞菊提取物與原花青素對照品在正丁醇-鹽酸顯色反應體系連續波長掃描圖Fig.3 The spectrogram of CTFT extract and proanthocyanidin standard in n-butanol-hydrochloric acid reaction system

2.4 鐵鹽（Fe3+）催化比色法

按1.3.2.4項下內容進行操作，獲得原花青素和樣品連續波長掃描圖。結果見圖4。

圖4 兩色金雞菊提取物與原花青素對照品在Fe3+催化比色法反應體系連續波長掃描圖Fig.4 The spectrogram of CTFT extract and proanthocyanidin standard in Fe3+chromogenic method reaction system

由圖4可知，在Fe3+催化顯色反應體系中，樣品和原花青素標準對照液在400 nm～700 nm范圍內吸收圖譜相似，最大吸收波長均在（546±2）nm，而且樣品本底干擾很小。因此，該反應體系可用于測定兩色金雞菊中原花青素的含量。

2.5 pH示差分光光度法

按1.3.2.5下內容進行操作，獲得樣品在不同pH值條件下連續波長掃描圖。結果如圖5。

由圖5可知，在pH=3和6的條件下，相同濃度的兩色金雞菊提取物溶液吸收圖譜相似，最大吸收峰位也一致，但最大吸收度發生了改變。根據其改變的ΔA值，可以計算出樣品中原花青素的含量。因此，該法也適合用于樣品中原花青素的含量測定。

圖5 兩色金雞菊提取物在不同pH值條件下連續波長掃描圖Fig.5 The spectrogram of CTFT extract in different pH values

3 討論

1）原花青素是存在于植物中的一大類雙黃酮衍生物的天然多酚化合物的總稱，是由多羥基黃烷-3-醇單元構成的低聚體或多聚體，由不同數量的兒茶素或表兒茶素結合而成。在香草醛-鹽酸反應體系下，原花青素單體和低聚體可與香草醛發生呈色反應，故可選原花青素或兒茶素作為對照品進行含量測定；在正丁醇-鹽酸反應體系下，兒茶素或表兒茶素等單體不易發生呈色反應，只有多聚體或單聚體才產生，故在該反應體系中常選擇原花青素作對照品進行含量測定；而鐵鹽催化體系與正丁醇-鹽酸反應體系相同，兒茶素或表兒茶素等單體不易發生呈色反應，故只能選原花青素作為對照品進行含量測定。

2）香草醛-鹽酸顯色反應體系中，可測定原花青素單體及低聚體的總含量。但試驗中發現該法測定原花青素含量時誤差較大，反應體系透明度較差，測定結果不穩定，推測原因可能與原花青素在該條件下易氧化分解有關。

3）鐵鹽催化比色法是在鹽酸-正丁醇法的基礎上增加了Fe3+做催化劑，增強了反應的靈敏度，同時增加了顯色反應的穩定性。

4）pH差示分光光度法主要是根據不同pH值條件下，原花青素光譜的變化來測定原花青素的含量。但在該反應條件下，對試驗條件要求苛刻（溫度、pH值，反應時間等），微小的pH值變化都會引起吸光度值的改變。因此，在該反應體系下測定樣品中原花青素的含量需做隨行對照，并保持反應條件一致性。

4 結論

本研究通過比較分析香草醛-鹽酸、正丁醇-鹽酸、鐵鹽（Fe3+）催化法、pH示差法等多種測定體系下，兩色金雞菊提取物和對照品兒茶素或原花青素的連續波長掃描圖譜一致性和λmax峰位值。結果顯示，在香草醛-鹽酸顯色反應體系下，以兒茶素或原花青素為對照品均不適合測定新疆兩色金雞菊中原花青素的含量；而正丁醇-鹽酸顯色體系、鐵鹽（Fe3+）催化比色法和pH示差法均可以原花青素為對照品測定兩色金雞菊中原花青素的含量；其中Fe3+催化比色法反應更靈敏和更穩定。所以，新疆兩色金雞菊中原花青素含量測定可用原花青素為對照，使用Fe3+比色法和pH示差法進行。

本含量測定體系方法簡便易操作，且成本低，易于在實驗室進行快速分析樣品中的原花青素含量。

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The Determination of Proanthocyanidins Content in Coreopsis tinctoria Nutt.from Xinjiang in Different Chromogenic Reaction System

LIU Xie-ying1，FENG Yu-jie1，YE Xiao-tong1，YAO Xin-cheng1，2，*
（1.School of Pharmacy，Shihezi University，Shihezi 832000，Xinjiang，China；2.Ministry of Education Key Laboratory of Xinjiang Endemic Phytomedicine Resources，Shihezi University，Shihezi 832000，Xinjiang，China）

To select the appropriate standards and chromogenic reaction system for determination the content of proanthocyanidins in Coreopsis tinctoria flowering tops（CTFT）from Xinjiang，the spectrum of CTFT extract，catechin and proanthocyanidins standards were compared in vanillin-hydrochloric acid，n-butanol-hydrochloric acid，Fe3+catalytic chromogenic method and pH differential spectrophotometry reaction system.The spectral absorption curve and the wavelength λmaxpeak values were investigated for selecting a suitable reaction system to determine the content of proanthocyanidins of CTFT.The spectrum of CTFT extract and proanthocyanidins standard were similar in n-butanol-hydrochloric acid，Fe3+chromogenic method and pH differential spectrophotometry reaction system，and the λmaxvalues were also closer to standard.Therefore，the content of proanthocyanidins in CTFT could be assayed by these three chromogenic reaction system.The content of proanthocyanidins in CTFT could be accurately determined in a particular reaction system and using an appropriate standard.

Coreopsis tinctoria Nutt.；proanthocyanidins content；chromogenic reaction system

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.026

2016-09-30

國家自然基金項目（81660641）；新疆生產兵團重點領域科技攻關項目（2014BA031）；石河子大學高層次人才科研啟動項目（RCZX201328）

劉謝英（1993—），女（漢），碩士研究生，藥物分析專業。

*通信作者：姚新成（1973—），男（漢），副教授，博士，從事中藥與天然產物活性研究。