鴨綠江流域北冰紅冰葡萄酒天然酵母菌性能研究

牛國煥，宋文軍，郝亞波，王廷剛

（天津商業(yè)大學生物技術(shù)與食品科學學院，天津300134）

鴨綠江流域北冰紅冰葡萄酒天然酵母菌性能研究

牛國煥，宋文軍*，郝亞波，王廷剛

（天津商業(yè)大學生物技術(shù)與食品科學學院，天津300134）

從鴨綠江流域的北冰紅葡萄果皮及其生長土壤中篩選適合釀造北冰紅冰葡萄酒的耐低溫、耐高糖酵母菌，并對其基本形態(tài)特征、生理特性及發(fā)酵特性進行了研究。結(jié)果表明：B④的耐糖性優(yōu)于商業(yè)酵母LB，其在糖度500 g/L、pH3.0～4.0、溫度10℃～12℃時生長良好，受酒精、SO2影響相對較小。在糖度360g/L的冰葡萄汁中發(fā)酵結(jié)束后，酒精度為13.5%vol，殘?zhí)橇繛?30g/L，感官品評協(xié)調(diào)，酒體飽滿濃郁，果香突出，適合冰酒生產(chǎn)。

耐低溫；耐高糖；釀酒酵母；發(fā)酵

冰酒之所以被稱為“液體黃金”[1]，是因為釀造冰酒不僅對獲得原料的氣候條件要求非常嚴苛[2]，而且冰酒原料的高糖、高酸環(huán)境以及低溫發(fā)酵都對酵母提出了更苛刻的要求。ST、N96、EC1118是目前被加拿大科學家Erasmus等鑒別出的適合釀造雷司令冰酒的商業(yè)酵母[3]。WY1、WY3、WY4是裴廣仁等篩選出的適合遼寧桓仁冰酒產(chǎn)區(qū)威代爾冰酒釀造的商業(yè)酵母[4]。南海龍等研究北冰紅山葡萄進行冰酒釀造工藝研究時也選用了商業(yè)酵母（F33∶VL1∶ST=1∶1∶1）[5]。由此看出，我國釀造冰酒的酵母大多依賴進口，缺乏適合我國葡萄品種的本土酵母，很難表現(xiàn)出我國冰酒的風味。因此，我國的冰酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展受到了一定程度的限制[6]。

本實驗所用葡萄品種為“北冰紅”[7]，生長在有“塞外江南”美譽的鴨綠江流域，它是目前國內(nèi)外培育出的第一個釀造冰葡萄酒的山葡萄品種[8]。其果實含糖量高，總酸和單寧適中，克服了以往山葡萄品種糖度低、酸度高的缺點，為釀造優(yōu)質(zhì)的冰葡萄酒提供了原料基礎(chǔ)。通過從北冰紅葡萄的果皮及其生長土壤中篩選出耐低溫、耐高糖的冰葡萄酒釀酒酵母，并對其進行生理生化、遺傳及發(fā)酵性能的研究，進一步為生產(chǎn)本土特色的冰葡萄酒提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采自鴨綠江流域的北冰紅葡萄及其生長土壤。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌種的初步鑒定

進行酵母菌的形態(tài)觀察[9]、生理生化試驗[10-11]及酵母菌的18S rDNA基因測序[12-14]。

1.2.2 菌株的性能研究

采用不同葡萄糖濃度（300、400、500、600、700 g/L）、溫度（8、10、12、14℃）、酒精濃度（3%、5%、7%、9%、11%，13%、15%）、SO2濃度（60、100、150、200、250、300、400、500 mg/L）、pH（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0）的50 mL的液體培養(yǎng)基，按5%的接種量接種，16℃恒溫培養(yǎng)48 h，選用660 nm波長進行培養(yǎng)液OD值的測定。

1.2.3 葡萄汁發(fā)酵實驗

將活化的菌株按10%的接種量接種到200 mL的葡萄汁中，調(diào)整SO2濃度為80 mg/L，于12℃條件下進行發(fā)酵，酒精發(fā)酵結(jié)束后，測定發(fā)酵液的殘?zhí)呛考熬凭龋òl(fā)酵力采用CO2失重法；酒精采用酒精計法；殘?zhí)遣捎弥苯拥味ǚǎ┎凑誈B/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進行感官品嘗。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌種的初步鑒定

將挑選出的三株菌株及商業(yè)酵母LB在麥芽汁培養(yǎng)基中進行涂布培養(yǎng)48h后，其形態(tài)如圖1、圖2所示[15-16]。

圖1 酵母菌菌落形態(tài)Fig.1 Yeast colony morphology

圖2 酵母菌顯微鏡形態(tài)Fig.2 Yeast microscopy morphology

通過YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)后觀察，培養(yǎng)基表面均無菌醭生成，但三角瓶壁上面有菌環(huán)生成，且均有白色沉淀生成，質(zhì)地緊密。表1所示，篩選出的菌株形態(tài)為圓形或近圓形，出芽繁殖，且不產(chǎn)生假菌絲，符合釀酒酵母的基本形態(tài)特征。

表1 酵母菌的形態(tài)特征鑒定結(jié)果Table 1 The test result of the morphological characteristics of yeasts

2.2 酵母菌種的生理、生化鑒定

根據(jù)J.A巴尼特《酵母菌的特征與鑒定手冊》對G①、H②、B④及LB菌株進行生理生化試驗，包括糖類發(fā)酵試驗、碳源同化試驗、氮源同化試驗。結(jié)果見表2。

2.3 酵母菌種的分子生物學鑒定

以菌株G①、H②、B④的總DNA為模板，ITS1/ ITS4為引物進行基因擴增，以18S rDNA基因序列進行測序，結(jié)合《酵母菌的特征與鑒定手冊》，G①、H②、B④均被鑒定為酵母菌。

2.4 菌株的性能分析

釀造冰酒要求葡萄汁含糖量為320 g/L～360 g/L，在高糖情況下，容易導(dǎo)致細胞破裂，因此要求菌株能夠耐滲透壓。各菌株的耐高糖性結(jié)果見圖3。

由圖3可知，各菌株在葡萄糖為300 g/L～400 g/L時生長良好。當糖度增加至500 g/L后，各菌株生長受到抑制。在此濃度下，B④菌株的耐高糖性比LB高13%。

表2 酵母菌生理、生化試驗結(jié)果Table 2 The test result of the physiological and biochemical yeasts

圖3 各菌株在不同葡萄糖濃度下的OD值Fig.3 The OD value of each strain at different glucose concentrations

溫度是影響菌株生長發(fā)酵的重要因素。若培養(yǎng)溫度過高，酵母出芽率會降低；若溫度過低，則會導(dǎo)致發(fā)酵速度減慢甚至發(fā)酵終止。因此發(fā)酵溫度控制在10℃～12℃，菌株需要有較好的耐低溫能力。各菌株的耐低溫性結(jié)果見圖4。

圖4 各菌株在不同溫度下的OD值Fig.4 The OD of each strain at different temperatures

由圖4可知，在8℃時各菌生長緩慢，在10℃～12℃時，H②生長速度最快。與LB相比，各菌株在10℃～12℃時均長勢良好，適合冰酒的發(fā)酵。

酵母菌在無氧的條件下產(chǎn)乙醇和二氧化碳，但酒精達到一定濃度時也會抑制酵母的生長代謝。因此需要菌株有較好的耐酒精的能力。各菌株的耐酒精性結(jié)果見圖5。

圖5 各菌株在不同乙醇濃度下的OD值Fig.5 The OD value of each strain at different ethanol concentrations

由圖5可知，所有菌株隨著乙醇濃度的升高生長受到抑制。乙醇濃度大于7%時，G①、H②急劇下降，說明菌株的生長開始受酒精的影響增大。與LB相比，B④菌株受酒精影響相對較小。

SO2在葡萄酒生產(chǎn)過程中有抑菌、增色、增酸和改善口感質(zhì)量等作用，我國規(guī)定葡萄酒中SO2添加量不能超過300 mg/L，因此菌株需要有較高的耐SO2能力。各菌株的耐SO2性結(jié)果見圖6。

由圖6可知，當添加量濃度小于250 mg/L，三支菌均表現(xiàn)出較好的耐性，當添加量大于400 mg/L，菌株的生長受到抑制。與LB相比，B④菌株受SO2影響相對較小。

pH值是葡萄酒生產(chǎn)的重要條件，pH值越高，紫紅色逐漸消失變成藍色色調(diào)，色澤和透明度變差，所以要選擇能夠在pH3.0～3.6條件下生長較好并且代謝旺盛的菌株。各菌株的耐pH性結(jié)果見圖7。

如圖7可知，與LB相比，各菌株均在pH3.0～4.0時生長良好。

圖6 各菌株在不同SO2濃度下的OD值Fig.6 The OD value of each strain at different SO2concentrations

圖7 各菌株在不同pH下的OD值Fig.7 The OD value of each strain at different pH

2.5 葡萄汁發(fā)酵試驗

根據(jù)菌株發(fā)酵性能實驗結(jié)果，選擇H②、B④及LB進行葡萄汁發(fā)酵試驗。各菌株的發(fā)酵試驗結(jié)果見表3、表4。

表3 酵母菌發(fā)酵試驗CO2失重Table 3 Weight lose of fermentation test

表4 酵母菌發(fā)酵液酒精度與殘?zhí)荰able 4 Yeast fermentation liquor alcohol content and the residual sugar

表3所示，各菌株發(fā)酵啟動時間相似，并均在2 d達到高峰。與商用酵母LB相比，菌株B④啟動速度快，但發(fā)酵周期較長。由表4可以看出，各菌均能完成酒精發(fā)酵。由表3、表4可知，B④性能穩(wěn)定，發(fā)酵力強，產(chǎn)酒精量高，與商業(yè)菌對照結(jié)果相近。

3 結(jié)論

從鴨綠江流域的北冰紅葡萄果皮及生長土壤中篩選適合釀造北冰紅冰葡萄酒的耐低溫、耐高糖的菌株，其菌落表面光滑，邊緣整齊，乳白色，突起，細胞多為較大圓形或卵圓形。經(jīng)18SrDNA基因序列測序，結(jié)合《酵母菌的特征與鑒定手冊》，G①、H②、B④均被鑒定為酵母菌。結(jié)果表明，B④的耐糖性優(yōu)于商業(yè)酵母LB 13%，其在糖度500 g/L、pH3.0～4.0、溫度10℃～12℃時生長良好，受酒精、SO2影響相對較小。在糖度360 g/L的冰葡萄汁中發(fā)酵結(jié)束后，酒精度為13.5%vol，殘?zhí)橇繛?30 g/L，感官品評協(xié)調(diào)，符合冰酒生產(chǎn)的工藝要求。

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Study on the Performance of Natural Yeast in the Ice Wine Beibinghong of the Yalu River Basin

NIU Guo-huan，SONG Wen-jun*，HAO Ya-bo，WANG Ting-gang
（Institute of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China）

The yeasts，previously selected for their ability to bear the low temperature and high sugar form the Beibinghong grape peel and soil of the Yalu River basin，were analyzed the trait of the basic morphological characteristics，physiological characteristics and fermentation characteristics.The results manifested that the sugar tolerance of B④was better than LB，and B④ performs best at 10℃-12℃，in the conditions of 500 g/L sugar and pH 3.0-4.0，and the affection is relatively smaller by the alcohol and SO2.The data of alcohol and residual sugar was 13.5%vol and 130 g/L when the fermentation was stopped，which conducted in the grape must（360 g/L sugar）.The sensory coordination，full-bodied flavor and aroma are the evaluations of the wine by the wine experts.B④were identified as the most suitable yeast strains for the production of ice wine.

low temperature tolerance；high glucose tolerance；S.cerevisiae；fermentation

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.035

2017-03-16

天津商業(yè)大學橫向課題項目（G16014）

牛國煥（1981—），女（漢），工程師，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程。

*通信作者：宋文軍（1967—），男，副教授，博士，從事生物技術(shù)與食品科學研究。