高效液相色譜測定雪糕中6種合成色素

尤妍

（玉環縣食品藥品檢驗檢測中心，浙江臺州317608）

高效液相色譜測定雪糕中6種合成色素

尤妍

（玉環縣食品藥品檢驗檢測中心，浙江臺州317608）

建立一種簡便、重復性好的高效液相色譜可見光測定雪糕中的檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍6種合成著色劑。以無水乙醇-氨水-水（7∶2∶1，體積比）為溶劑提取，HLB固相萃取柱凈化，ZORBAXSB-C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm），流動相以甲醇和20 mmol/L乙酸銨進行梯度洗脫。流速1.0 mL/min，柱溫25℃，多波長同時測定6種的合成色素，檢測波長分別為428、521、509、483、507、625 nm。結果表明：6種合成色素均達到基線分離，在0.1 μg/mL～10 μg/mL范圍內，具有良好的線性關系（R2均大于0．999 9）；樣品的樣品加標回收率85%～110%，精密度RSD均小于2.0%。該方法可用于檢測雪糕中合成色素的含量。

合成色素；雪糕；高效液相色譜

合成著色劑是指用人工化學合成方法制得的有機色素，主要是以煤焦油中分離出來的苯胺染料為原料制成。合成著色劑在體內蓄積分解成致突變原前體芳香胺類化合物，有些可能會轉化成致癌物質[1-3]，過量攝入合成著色劑危害人體健康。若兒童過量食用含合成色素的食品，會影響兒童智力發育。同時也會干擾兒童正常的代謝功能。

雪糕中添加合成色素可以促進人們的食欲，提高食品的商品價值，GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》對檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍這6種合成色素在雪糕中最大使用量作了明確規定[4]。

目前合成著色劑的測定方法有高效液相色譜法[5-11]、毛細管電泳法[12-13]、液質聯用法[14]。一般采用GB/T 5009.35-2003《食品中合成著色劑的測定》和SN/ T 1743-2006《食品中的誘惑紅、酸性紅、亮藍、日落黃的含量檢測》的高效液相色譜法測定食品中的合成著色劑[15-16]，但是該方法未提及雪糕中著色劑測定的前處理方法，而且雪糕中含有穩定劑，按照GB/T 5009.35-2003的方法進行前處理，極易堵塞砂芯漏斗。因此，建立檢測雪糕中的合成色素的測定方法具有重要意義。本試驗旨在發現一種簡便、可行的檢測方法，為雪糕中色素的檢測提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

安捷倫1260高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測器、四元泵、在線脫氣機、柱溫箱、自動進樣器、Open LAB工作站）：安捷倫科技有限公司；梅特勒XS205DH電子天平（萬分之一）：梅特勒；DV-S26電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；KQ-500DE型數控超聲波清洗機：昆山市超聲儀器有限公司；Neofuge 18R臺式高速冷凍離心機：上海力申科學儀器有限公司。

甲醇、乙腈：HPLC級，經0.45 μm濾膜過濾，超聲脫氣；3%氨水溶液：取氨水3 mL，加水定容至100 mL；乙酸銨溶液（20 mmol/L）：取1.54 g乙酸銨，加水溶解至1 000 mL，經0.45 μm濾膜過濾，超聲脫氣；鹽酸-乙醇溶液：取10 mL鹽酸，90 mL乙醇，混勻；50%甲醇：取50 mL甲醇，50 mL水，混勻；檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、亮藍、日落黃（0.50 mg/mL）：中國計量科學研究院；誘惑紅標準儲備液：準確稱取60.24 mg誘惑紅（純度83%，農業部環境保護科研監測所）用水定容至100mL，配制成0.50 mg/mL的標準儲備液。

1.2 樣品

雪糕：市售。

1.3 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18柱（4.6×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇為A相，20 mmol/L乙酸銨為B相，按照梯度程序洗脫（見表1）。流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；檢測波長分別為：428、521、509、483、507、625 nm；進樣量：10 μL。

表1 最佳梯度洗脫程序Table 1 Optimal elution conditions of synthetic pigments by HPLC

1.4 標準曲線

分別取0.5 mg/mL的檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍各5.0 mL于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，即得50 μg/mL的混合標準溶液。

取該混合標準溶液，依次配制成濃度為0.1、0.2、0.4、1、3、5、10 μg/mL的混合標準溶液。這7個梯度標準溶液各自進樣10 μL，按照色譜條件進行檢測，根據保留時間、峰面積及對應的濃度分別作校準曲線。

1.5 樣品處理

試樣處理：取完整的雪糕樣品，室溫下化凍，均質機勻漿，作為供試樣品。

稱取2 g樣品（精確至0.01 g）于離心管中，加入乙醇-氨水-水（7∶2∶1，體積比）溶液約15 mL，置超聲波中超聲5 min，6 000 r/min離心5 min，過濾。再用30 mL乙醇-氨水-水（7∶2∶1，體積比）溶液重復提取3次，取濾液，于80℃水浴蒸至5 mL左右，用氨水溶液調節pH為8，作為待凈化液。

取HLB凈化小柱，先用8 mL甲醇，8 mL水活化，取待凈化液過小柱，用pH值為8的水和pH值為8的甲醇水溶液（甲醇∶水=1∶1，體積比）各5 mL淋洗小柱，鹽酸-乙醇溶液10 mL洗脫，洗脫液用氨水調至中性，80℃水浴蒸至近干，用50%甲醇溶液溶解并定容至10 mL，作為樣品供試溶液。

2 結果與討論

2.1 波長選擇

利用二極管陣列檢測器（DAD）對檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍分別進行波長掃描見圖1。

圖1 6種合成著色劑標準品的紫外-可見光譜掃描圖Fig．1 UV-Visible spectra of six kinds of synthetic pigments

由圖1可知，6種合成色素在紫外波長（254 nm）附近都有較強吸收，但樣品中的一些雜質在該波長下有吸收，影響目標色素的判斷（圖2）。因此，采用可見光吸收波長作為檢測波長。確定了檸檬黃的測定波長為428 nm，莧菜紅的測定波長為521 nm，胭脂紅的測定波長為509 nm,日落黃的測定波長為483 nm，誘惑紅的測定波長為507 nm，亮藍的測定波長為625 nm。采用以上可見光檢測，樣品的基質干擾少，各組分能有效分離。

2.2 標準曲線線性范圍及線性關系

選擇混合標準溶液的濃度分別為0.1、0.2、0.4、1、3、5、10 μg/mL，進高效液相色譜儀分析后，以各個組分的峰面積和濃度繪制標準曲線，以3倍性噪比計算檢出限。6種色素在其0.1 μg/mL～10 μg/mL濃度范圍內線性良好（見表2）。取1 μg/mL色素混合標準溶液，分別采用可見光和紫外光檢測，結果（如圖3）：采用可見光檢測后6種色素的響應值較按照GB/T 5009．35-2003《食品中合成著色劑的測定》紫外光檢測高，亮藍尤其明顯。

圖2 陽性樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of positive sample

表2 各組分標準曲線及檢出限Table 2 The detection limit of components and standard curve

圖3 1 μg/mL標準溶液的色譜圖Fig.3 Chromatogram of 1 μg/mL standard solution

2.3 方法精密度和加標回收率

取10 μg/mL的混合標準溶液進行精密度測定，重復測定6次，計算各組分峰面積精密度見表3。以雪糕陽性樣品為試樣，分別加入一定量的混標，計算回收率見表4。結果表明：6種人工合成色素的精密度均< 2.0%，樣品加標回收率85%～110%，該方法適用于雪糕樣品的檢測。

表3 精密度試驗結果Table 3 The precision of the result of the experiments

表4 樣品加標回收率Table 4 The recovery of the standard addition

2.4 前處理方法的選擇

目前合成色素的提取方法一般采用 GB／T 5009.35-2003《食品中合成著色劑的測定》的聚酰胺吸附法。試驗分析比較了不同顆粒度聚酰胺粉對空白樣品加標的吸附效果見表5。結果表明聚酰胺粉顆粒度對合成色素的吸附效果影響較大，顆粒度越小，吸附效果越好，但是＞200目的聚酰胺粉的價格昂貴，是100目～200目聚酰胺粉價格的近10倍，考慮100目～200目顆粒度的聚酰胺粉回收率滿足一般檢測需求，所以一般采用該規格的聚酰胺粉進行試驗。當用聚酰胺粉對雪糕陽性樣品進行處理時，由于雪糕中含有糖、增稠劑（卡拉膠、槐豆膠、瓜爾膠、羧基纖維素鈉、羅望子多糖膠）等物質，在用G3砂芯漏斗（濾片平均濾孔15 μm～40 μm）洗脫的過程中出現砂芯堵塞、洗脫困難的現象。為解決這一難題，特采用乙醇-氨水-水提取的方法，先將目標色素提取出來，再利用HLB凈化小柱對提取液進行凈化，排除干擾。

表5 不同顆粒度的提取效果Table 5 Extraction efficiencys of differents granularity

3 結論

試驗表明，利用高效液相色譜可見光測定雪糕中6種合成色素，能更精確地測定目標物，避免了一些干擾，各組份分離效果較好，標準曲線線性較好。同時，改進了樣品前處理方法，避免了樣品洗脫困難的發生，且方法回收率較高。試驗證明，該方法適合雪糕樣品中合成色素的含量的檢測。

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Determination of Six Synthetic Pigments in Ice Cream by High Performance Liquid Chromatography

YOU Yan
（The Inspection Testing Center of Food and Drug in YuHuan，Taizhou 317608，Zhejiang，China）

To develop a method for the determination of six synthetic pigments such as tartrazine，amaranth，carmine，sunset yellow，temptation red，brilliant blue，fancy red in ice cream.Using anhydrous ethanol-ammonia-water（7∶2∶1，V/V）as solvent extraction，the synthetic pigments were cleaned by HLB cartridge.After exreacetd，samples were separated in a ZORBAX SB-C18column（4.6 mm×250 mm，5 μm）column with gradient program by using methanol and 20 mmol/L ammonium acetate as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min，with the column temperature 40℃and detection wave 428，521，509，483，507，625 nm.The six synthetic pigments were separated.The linear range of menthod was in the range of 0.1 μg/mL-10 μg/mL：（R2＞0.999 9）.The recoveries for samples ranged from 85%-110%，and RSD were all below 2%.This methods were suitable for determination of synthetic colout in ice cream.

synthetic colorants；ice cream；high performance liquidchromatography

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.032

2016-09-23

尤妍（1986—），女（漢），碩士研究生，工程師，研究方向：食品檢測。