雙齒圍沙蠶多肽的制備及其抗肺癌A549細胞活性

賈盈露，丁國芳,2,*，楊最素，余方苗，鄭媛媛，吳宗澤，陳 銳

（1.浙江海洋大學食品與醫藥學院，浙江省海洋生物醫用制品工程技術研究中心，浙江 舟山 316022；2.浙江省海洋水產研究所，浙江 舟山 316021）

雙齒圍沙蠶多肽的制備及其抗肺癌A549細胞活性

賈盈露1，丁國芳1,2,*，楊最素1，余方苗1，鄭媛媛1，吳宗澤1，陳 銳1

（1.浙江海洋大學食品與醫藥學院，浙江省海洋生物醫用制品工程技術研究中心，浙江 舟山 316022；2.浙江省海洋水產研究所，浙江 舟山 316021）

探討雙齒圍沙蠶酶解多肽制備的關鍵技術及其對肺癌A549細胞的作用。以增殖抑制率為指標，確定最佳酶種并根據單因素試驗和正交試驗確定其最佳酶解工藝。經超濾獲得1～3 ku的酶解液，通過陰離子色譜、凝膠過濾色譜和制備色譜對其進行進一步的分離純化。采用四甲基偶氮唑藍法測定沙蠶多肽PAP對肺癌A549細胞的增殖抑制率并通過倒置顯微鏡、吖啶橙/溴化乙錠熒光染色及Hoechst熒光染色觀察其細胞形態的變化。實驗結果表明最佳酶種是堿性蛋白酶，其最佳酶解條件為：酶解溫度50 ℃、pH 11、料液比1∶1（g/mL）、酶解時間6 h、加酶量300 U/ g。經純化獲得的多肽命名為PAP，其氨基酸序列為Ile-Glu-Pro-Gly-Thr-Val-Gly-Met-Met-Phe，且PAP對A549細胞的作用呈時間與劑量依賴關系，作用后細胞出現了凋亡的形態學特征。因此，PAP能明顯抑制肺癌細胞A549增殖，可以誘導其發生凋亡而發揮抗腫瘤作用。

雙齒圍沙蠶；多肽；抗腫瘤；A549細胞；細胞凋亡

肺癌是全球范圍內發病率最高的惡性腫瘤，近年來發病率、死亡率逐年上升，已成為腫瘤相關死亡的首要病因[1]。肺癌約80%是非小細胞肺癌，在晚期肺癌中的比例達到總數的40%～50%[2]。目前對于非小細胞肺癌的治療早期是手術切除，晚期主要是化療，但化療的毒副作用及產生的耐藥性，影響治療的有效性，因此尋找精準治療是熱門話題。海洋是一個巨大的藥物寶庫，從海洋中尋找活性物質已成為熱點，從中分離獲得的多種活性物質，如肽類、多糖、生物堿、萜類、大環內酯等，有望開發成新型的抗腫瘤藥物[3]，如從海兔獲得的dolastatin 10已進入臨床實驗[4]。

沙蠶（Nereis）屬于環節動物門（Annelida）多毛綱（Polychaeta）沙蠶科（Nereididae），又稱為海蟲、海蜈蚣、海螞蟥等，其生物資源豐富，廣泛分布在我國沿海地區，近年來人工養殖用于鉤魚的誘餌。沙蠶是一種傳統的海洋中藥，有清熱解毒、消腫止痛、斂瘡生肌、治療癰瘡腫毒等功效[7]。學者們從沙蠶體內獲得了具有良好藥理活性的物質。已有研究[8-11]從日本刺沙蠶體內分離出一種沙蠶絲氨酸蛋白酶，該蛋白酶抑制血小板聚集，改變血液流變學特性，可作為降纖和溶栓藥物，預防和治療心、腦梗塞，腦動脈、肺動脈血栓形成等疾病；同時沙蠶蛋白酶ASP表現出對白血病細胞、肺癌SPC-A-1細胞較強的抗腫瘤活性[12-16]。然而沙蠶酶解多肽的研究較少，對非小細胞肺癌A549細胞的抑制活性目前鮮見報道，本實驗以沙蠶為實驗材料，探討酶解多肽的制備及體外抗A549細胞的增殖活性，為開發沙蠶的藥用價值提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品與試劑

沙蠶購于舟山市水產養殖場，經浙江海洋大學趙盛龍教授鑒定為雙齒圍沙蠶（Perinereies aibuhitensis），鮮活購買后待用。

胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶 北京亞太恒信生物科技有限公司；胎牛血清 杭州四季青生物工程有限公司；1640粉末培養基 美國Gibco公司；四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 細胞

人肺癌A549細胞株購自中科院上海細胞庫，由本實驗室傳代培養。

1.2 儀器與設備

DS-1組織搗碎機 上海標準模型廠；GF16RXII高速低溫離心機 日本Hitachi公司；ALPHA 1-4/LDplus型冷凍干燥機 德國Christ公司；WRO-70型超純水儀 美國Millipore公司；BSA124S型電子天平 德國Satorius AG公司；ZHJH-C1209C型超凈工作臺 上海智誠分析儀器制造公司；Forma3111型CO2培養箱 美國Thermo公司；酶標儀 美國Bio-Rad公司；BX2-FLB3熒光顯微鏡、CCD-NC6051顯微攝像 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 沙蠶酶解液制備工藝優化及多肽分離純化

1.3.1.1 最佳酶種的選擇

將沙蠶洗凈后勻漿，分別取10.0 g勻漿樣品參照文獻[17-20]確定胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶這5 種酶的酶解溫度及pH值進行酶解（酶解條件見表1），固定條件為：加酶量300 U/g、料液比1∶1（g/mL）、酶解時間4 h。結束后在100 ℃水浴中滅活10 min，12 000 r/min冷凍離心15 min后得上清液，采用MTT法測定對A549細胞的增殖抑制率（inhibition rate，IR），獲得最佳酶種。

表1 蛋白酶的最適酶解溫度和pH值Table1 Optimum temperature and pH for the enzymes

1.3.1.2 酶解條件優化

選用最佳蛋白酶進行酶解實驗，通過單因素試驗考察酶解溫度、酶解pH值、料液比、酶解時間和加酶量5 個因素對水解度[21-23]的影響，單因素試驗設計見表2，固定條件為酶解溫度45.0 ℃、pH 10、料液比1∶1、酶解時間4 h、加酶量300 U/g。氨基氮含量（amino nitrogen content，ANN）與水解度成正相關，采用甲醛電位滴定法測定氨基氮含量。

表2 單因素試驗因素與水平設計Table2 Factors and their coded levels and actual values used in one-factor-atatime experiments

根據單因素試驗結果，采用正交試驗以酶解溫度、酶解pH值、料液比、酶解時間和加酶量5 個因素，以IR值為指標，確定最佳的酶解條件。

1.3.1.3 沙蠶多肽的超濾分離

酶解上清液用超濾膜進行分離，得到小于1、1～3、3～5、5～8、大于8 ku的酶解液，分別命名為PAP-1、PAP-2、PAP-3、PAP-4和PAP-5。將以上組分收集冷凍干燥后，以MTT法檢測當組分質量濃度分別為2 000 mg/L和4 000 mg/L時，作用于A549細胞24 h后的IR，得到活性最高的組分，進行下一步的分離。

1.3.1.4 沙蠶多肽DEAE Sepharose Fast Flow層析分離

將超濾組分通過DEAE Sepharose Fast Flow進一步分離，樣品質量濃度為0.25 g/mL，離心取上清液，過0.22 μm濾膜濾后進行洗脫。分離條件：柱尺寸3.6 cm×15 cm；填料為瓊脂糖凝膠DEAE Sepharose FF；柱料顆粒直徑45～165 μm；上樣量2 mL；洗脫液為0～1 mol/L NaCl溶液；洗脫方式為梯度洗脫，每個濃度洗脫一個柱體積；流速5 mL/min；檢測波長280 nm；收集體積為5 mL/管。收集各峰，濃縮冷凍干燥，通過MTT法選出活性較好峰組分進一步分離。

1.3.1.5 沙蠶多肽葡聚糖凝膠Sephadex G-25層析分離

將上步中收集到的IR最高的組分通過Sephadex G-25柱進一步分離純化，樣品質量濃度為0.2 g/mL，離心取上清液，過0.22 μm濾膜濾后進行洗脫。分離條件：柱尺寸2.6 cm×60 cm；填料為葡聚糖凝膠G-25；柱料顆粒直徑50～150 μm；上樣量2 mL；洗脫液為蒸餾水；流速1.1 mL/min；檢測波長280 nm；收集體積為3.5 mL/管。收集各峰，濃縮冷凍干燥，通過MTT法選出活性較好峰組分進一步分離。

1.3.1.6 高效液相分離純化

將抑制A549細胞增殖最強的收集峰分進一步的分離純化，色譜條件：色譜柱為ZORBAX SB-C18分析型色譜柱（9.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長280 nm；流速0.5 mL/min；流動相A為乙腈（含0.05%三氟乙酸），流動相B為超純水（含0.05%三氟乙酸），采用梯度洗脫方式（20%～100% A洗脫5～20 min）；柱溫25 ℃；自動進樣，進樣量100 μL。收集活性最高組分，冷凍干燥，測定氨基酸序列。

1.3.1.7 目標肽的N端測序

由北京億譜生物技術有限公司完成蛋白質的N端序列檢測工作，測序儀器為PPSQ-31A蛋白自動測序儀。最終以PAP命名該活性多肽。

1.3.2 細胞培養

將A549細胞在含有雙抗溶液（青霉素G 100 IU/mL、鏈霉素100 IU/mL）以及10%胎牛血清的1640培養液中培養。置于37 ℃、5% CO2的培養箱中孵育，待長滿80%以上時用0.25%胰蛋白酶進行消化傳代，取處于對數生長期的細胞進行實驗。

1.3.3 抗肺癌A549細胞活性檢測

1.3.3.1 MTT法測定細胞增殖抑制活性

將A549細胞以1×105個/mL細胞數接種于96 孔培養板中，每孔培養液200 μL常規條件下培養24 h后，去培養液后，設空白對照組和用藥組（PAP質量濃度為1 000、2 000、4 000 mg/L），作用規定時間后棄液，加含有10% MTT的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS），孵育4 h后，實驗畢棄液，加入150 μL的DMSO充分振蕩。酶標儀在490 nm波長處測定吸光度，按以下公式計算細胞IR值，并用SPSS計算半數抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

式中：A1為空白對照組的吸光度；A2為用藥組的吸光度。

1.3.3.2 倒置顯微鏡下觀察細胞形態

將泡酸處理的蓋玻片放入96 孔板中，接種密度為1×105個/mL的A549細胞，常規培養24 h，去除培養液，設空白對照組和藥物組（藥物質量濃度分別為1 000、2 000、4 000 mg/L），培養24 h后，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.3.3 AO/EB熒光染色觀察細胞形態

細胞接種與實驗分組同1.3.3.2節。24 h后，取蓋玻片，PBS（pH 7.2）洗2～3 次，用95%乙醇溶液固定30 min，進行吖啶橙/溴化乙錠（acridine orange/ethidium bromide，AO/EB）染色觀察。觀察前于載玻片上滴加50 μL PBS和6 μL AO/EB混合液，有細胞的一面朝下，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.3.4 Hoechst 33258染色觀察細胞形態

細胞接種與實驗分組同1.3.3.2節。24 h后，取蓋玻片，用4%多聚甲醛固定20 min，PBS沖洗2 次，用Hoechst33258熒光染液（0.5～10 μg/mL）常溫染色15 min，PBS清洗2 次后在熒 光顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 沙蠶多肽酶解工藝優化

2.1.15 種酶的酶解結果

圖1 5 種蛋白酶解物對A549細胞的IR值Fig.1 Inhibitory percentages against A549 cells of hydrolysates with five different enzymes

從圖1可知，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶5 種蛋白酶解物對A549細胞IR值分別為56.67%、46.29%、62.07%、47.78%、60.51%，其活性大小順序為：堿性蛋白酶＞胃蛋白酶＞胰蛋白酶＞中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶。根據細胞IR大小選定堿性蛋白酶進行下一步的篩選實驗。

2.1.2 單因素試驗結果

圖2 酶解溫度對ANN含量的影響Fig.2 Influence of temperature on ANN

由圖2可知，溫度35～45 ℃范圍內，ANN含量隨溫度升高而增加，當達到酶最佳酶解溫度45 ℃時達到最大，達到9.20 mg/g。當溫度繼續升高，酶活性下降明顯，ANN含量下降到5.95 mg/g。故溫度45 ℃為最佳。

由圖3可知，ANN含量隨pH值升高而增加，當達到堿性蛋白酶最佳酶解pH值時達到最大，pH 12時，ANN含量開始下降。因此選擇pH值為11。

圖3 pH值對ANN含量的影響Fig.3 Influence of pH on ANN

圖4 料液比對ANN含量的影響Fig.4 Influence of solid-to-liquid ratio on ANN

由圖4可知，隨酶解液溶劑用量的增加，ANN含量隨之下降。沙蠶體內含水量較大，當料液比為1∶1時，堿性蛋白酶即達到最佳酶解效果，而隨溶劑用量增加，ANN含量下降，因此選擇料液比為1∶1。

圖5 酶解時間對ANN含量的影響Fig.5 Influence of hydrolysis time on ANN

由圖5可知，隨酶解時間的延長，ANN含量隨之增加，到8 h時達到6.83 mg/g，酶解時間繼續增加，ANN增加趨于平穩，因此，選擇酶解時間為8 h。

圖6 加酶量對ANN含量的影響Fig.6 Influence of enzyme dosage on ANN

由圖6可知，加酶量由300 U/g增加至600 U/g時，ANN含量略有增加，之后加酶量增加，ANN含量則下降，因此選擇600 U/g。

2.1.3 正交試驗結果

表3 正交試驗設計及結果Table3 Orthogonal array design in terms of experimental and coded data with response values

以酶解溫度、酶解pH值、料液比、酶解時間和加酶量為因素，在不同酶解條件下檢測IR，其結果如表3所示。利用極差法分析得到影響IR的各因素主次關系為：C＞E＞A＞B＞D。對于IR影響最大的因素是C（料液比）；此時的最佳酶解條件為A4B4C1D3E1，即酶解溫度50 ℃、酶解pH 11、料液比1∶1、酶解時間6 h、加酶量300 U/g。每個試驗重復3 次，得到的結果均為此組合效果最好。在此條件下進行驗證實驗，8 000 mg/L酶解產物對A549的IR為（97.42±0.83）%，為最優實驗結果。

2.2 沙蠶多肽的分離純化

2.2.1 沙蠶多肽的超濾截留

圖7 不同分子質量的沙蠶多肽對A549細胞增殖的影響Fig.7 Effects of hydrolates with different molecular weights on the growth of A549 cells

將堿性蛋白酶解獲得的沙蠶多肽經超濾得到5 個組分PAP-1、PAP-2、PAP-3、PAP-4和PAP-5，得率分別為0.36%、1.76%、1.24%、0.72%和0.6%。采用MTT法得到對A549細胞的IR值，結果如圖7所示，PAP-2組分的IR值最高。

2.2.2 DEAE Sepharose Fast Flow分離結果

將上述步驟得到的PAP-2經DEAE分離得到PAP-2-1、PAP-2-2、PAP-2-3和PAP-2-4四個洗脫峰如圖8所示。

圖8 陰離子DEAE Sepharose Fast Flow洗脫峰Fig.8 Elution peaks on DEAE Sepharose Fast Flow

圖9 陰離子分離組分對A549細胞增殖的作用Fig.9 Effects of different fractions from DEAE Sepharose Fast Flow chromatography on the growth of A549 cells

由圖9可知，以2 000 mg/L的質量濃度作用于A549細胞24 h后的IR分別為（14.1±2.7）%、（24.3±3.0）%、（41.9±1.5）%和（46.7±5.0）%；4 000 mg/L時對A549細胞的IR值則為（28.0±3.0）%、（49.6±2.2）%、（79.3±4.1）%、（77.3±1.8）%。綜合故選定PAP-2-3進行進一步分離純化。

2.2.3 Sephadex G-25分離結果

圖10 葡聚糖凝膠柱洗脫峰Fig.10 Elution peaks on Sephadex G-25

由圖10可知，將上述步驟得到的PAP-2-3經Sephadex G-25分離得到PAP-2-3-1、PAP-2-3-2兩個洗脫峰。

圖11 凝膠柱分離組分對A549細胞增殖的作用Fig.11 Effects of different fractions from Sephadex G-25 chromatography on the growth of A549 cells

由圖11可知，當質量濃度為1 000 mg/L時，PAP-2-3-1和AP-2-3-2對細胞的IR值分別是（48.2±3.3）%、（74.4±2.4）%；2 000 mg/L時，IR值分別為（75.9±2.1）%、（95.1±1.8）%。PAP-2-3-2的活性最高，故用高效液相色譜儀將峰PAP-2-3-2進一步分離純化。

2.2.4 活性肽的純化及其N端氨基酸檢測結果

圖12 高效液相色譜柱洗脫峰Fig.12 RP-HPLC elution peaks

PAP-2-3-2經高效液相色譜洗脫純化，當洗脫時間分別為：4.296、4.584、4.968、5.602、6.075 min時，出現如圖12所示的5 個洗脫峰（Ⅰ～Ⅴ）。由于峰Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ產率不高，多次收集后仍然很少，因此未進行進一步的收集；峰V產率較高，收集并進行凍干，命名為PAPH。測定800 mg/L PAPH作用于A549細胞24 h后的IR值為（78.3±1.5）%。

圖13 PAP經高效液相色譜洗脫圖Fig.13 Elution peaks of PAP by HPLC

由圖13可知，在280 nm檢測波長處，保留時間為12.16 min時出現主要單一峰，對其收集并進行凍干，命名為PAP。

圖14 PAP的質譜圖Fig.14 Mass spectrum of PAP

由圖14可知，經氨基酸測序確定其氨基酸序列為Ile-Glu-Pro-Gly-Thr-Val-Gly-Met-Met-Phe。經質譜鑒定，其分子質量為1 081.20 D，與氨基酸測序獲得的多肽的分子質量一致。

2.3 抗肺癌A549細胞活性

2.3.1 PAP對A549細胞增殖活性的影響

圖15 PAP對A549細胞活性的影響Fig.15 Effect of PAP on the proliferation of A549 cells

由圖15可知，當250 mg/L PAP作用細胞24 h時，對A549的IR為17.02%，當PAP質量濃度增加至1 000 mg/L時，IR達到83.44%，IC50為662 mg/L；隨著作用時間的延長，作用48 h時，IC50為571 mg/L；作用72 h時，IC50為487 mg/L。隨著PAP質量濃度的增加和作用時間的延長，抑制指數明顯上升，與對照組相比有顯著性差異（P＜0.05）。

2.3.2 倒置顯微鏡觀察結果

圖16 倒置顯微鏡下的A549細胞（×200）Fig.16 Morphological changes of A549 cells under an inverted microscope (× 200)

如圖16所示，空白對照組的A549細胞生長良好，細胞間排列緊密，形態飽滿。PAP作用24 h后，如250 mg/L組A549細胞出現細胞間隙增大，輪廓模糊，形態不規則；1 000 mg/L組細胞變圓變亮，形態和正常細胞有明顯的區別，同時可見在培養液中懸浮著較多的死細胞。

圖17 AO/EB染色后的A549細胞形態（×200）Fig.17 Morphological changes of A549 cells treated with PAP analyzed by AO/EB staining (× 200)

2.3.3 AO/EB熒光染色檢測結果PAP作用于A549細胞24 h后，經過AO/EB染色，出現了明顯的早期凋亡的形態學特征。實驗結果如圖17所示，空白對照組無明顯凋亡細胞出現，細胞大小均勻，細胞核形態規則，胞核呈現綠色熒光；250 mg/L組細胞出現早期凋亡的現象，胞質出現空泡，核呈現強黃綠色熒光。隨著用藥質量濃度的增加，1 000 mg/L組早期凋亡的細胞和晚期凋亡的細胞明顯增多，細胞核呈固縮狀，呈現橘紅色熒光。

2.3.4 Hoechst 33258染色檢測結果

圖18 Hoechst 33258染色后的A549細胞形態（×200）Fig.18 Morphological changes of A549 cells treated with PAP analyzed by Hoechst 33258 staining (× 200)

如圖18所示，當不同質量濃度的沙蠶多肽作用于A549細胞24 h后，空白對照組呈現均勻的藍色熒光，PAP作用后，細胞的染色質聚集及邊集化明顯，且藍色的熒光變亮，細胞核斷裂皺縮呈現出塊狀或點狀的藍色熒光，視野中細胞數明顯減少，細胞形態學的變化隨著藥物質量濃度的增加也顯得越明顯。

3 討 論

生物活性多肽是一類由多個氨基酸通過肽鍵相連形成的化合物，具有調節人體多種生理功能如抗腫痛、提高免疫、抗病毒和降血壓等作用[24]。目前生物活性肽提取方法主要有3 種：直接提取法、合成法和水解法。直接提取法只適合于動植物中存在的一些含量少結構復雜的天然生物活性肽實驗室提取；合成法較易獲得生物活性肽純品，但限制于試劑、儀器成本高、副反應多等原因難以實現大規模生產；水解法分為化學水解和生物酶水解，酶解法是通過適當蛋白酶水解蛋白制備生物活性肽的一種方法[25-26]，具有條件溫和、過程可控、肽得率高和安全的優勢。眾多學者從海洋生物中提取多肽采用了酶解的方法且表現出較好的抗腫瘤活性，如周軍明[27]復合酶解法提取褐藻糖膠，使用Sevag法脫蛋白，經DEAESepharose FF離子交換柱和Sephadex-G150葡聚糖凝膠柱層析獲得了具有還原能力和淬滅脂質過氧化能力的均一組分。朱森君等[28]采用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶兩步酶解獲得單環刺螠多糖，得率為6.2%。單環刺螠內臟多糖分子質量約為4.1×103u，為類糖胺聚糖。經過初步體外抗氧化活性研究后發現其具有顯著的脂質過氧化物清除活性，半數清除質量濃度為2.47 mg/mL。黃芳芳等[29-30]采用酶解法從烏賊墨中提取獲得烏賊多肽，研究結果表明其可以抑制前列腺癌細胞DU-145、PC-3、LNCaP，且具有時間與劑量依賴性。因此本實驗使用了胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶5 種酶，以細胞IR為指標，確定沙蠶多肽的最佳蛋白酶是堿性蛋白酶。為確定堿性蛋白酶的適宜酶解條件范圍，以酶解物ANN含量為指標，對每個因素分別進行試驗，根據單因素試驗結果設計正交試驗。通過L16（45）正交試驗優化酶解工藝，得到沙蠶多肽的關鍵技術為：酶解溫度50 ℃、酶解pH 11、料液比1∶1、酶解時間6 h、氨基酸序列Ile-Glu-Pro-Gly-Thr-Val-Gly-Met-Met-Phe。

MTT法是一種測定細胞存活和增殖能力的比色法，其原理是黃色的MTT能被活細胞線粒體脫氫酶還原成藍紫色的甲瓚，而死細胞無這種能力[31]。細胞增殖抑制活性檢測中常常會采用MTT法。馬艷春等[32]采用MTT法檢測不同濃度地龍有效成分對人腎小球系膜細胞（HMC細胞）增殖的影響。結果顯示中劑量組40 μg/mL效果最佳。陳美珍等[33]采用MTT法檢測發現龍須菜藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）對人宮頸癌細胞Hela有抑制作用并呈劑量-效應關系，流式細胞術結果顯示PE通過阻滯Hela細胞從G2/M期進入S期發揮抑制作用。本實驗采用MTT法對PAP對A549細胞的增殖抑制活性進行了檢測，實驗結果表明，沙蠶多肽對于A549細胞的抑制活性具有時間和劑量依賴關系，即隨著PAP質量濃度的增加和時間的延長，細胞的抑制率明顯上升。從海洋生物中尋找新型抗癌藥物是目前抗癌藥物研究的新領域，包括肽類，糖胺聚糖類、大環內脂類等。其中，海洋多肽分子質量小、活性高、毒性低等優點，成為國內外學者研究熱點。1987年，Pettit[34]和曹王麗[35]等從海兔（Dolabella auricu-laria）體內分離得到一個線性小肽Dolastatin-10。經Ⅱ期臨床實驗研究，與其他抗癌藥物聯合使用可發揮較好的抗癌效果。其衍生物如TZT-1027（auristatin PE）和auristatin PYE在臨床也顯示出顯著的治療效果。Chi Changfeng等[36]從泥蚶中分離獲得了2 種多肽BCP-A（Trp-Pro-Pro）和BCP-B（Gln-Pro），其中BCP-A對PC-3、DU-145、H-1299和HeLa細胞具有很好的增殖抑制活性，且具有時間與劑量依賴性。15 mg/mL的BCP-A作用后，PC-3的早期凋亡率從11.22%增至22.78%。姚如永等[37]提取了一種泥蚶多肽，對A549和Ketr-3細胞具有明顯的抑制作用，對A549和Ketr-3的周期阻滯分別為G2/M期和G0/G1期，體內對小鼠移植性腫瘤具有顯著的抑制作用。王翠翠等[38-39]通過離子交換、凝膠過濾等方法從文蛤中提取分離獲得了一種多肽Mere15，研究發現Mere15可抑制A549細胞生長，抑制率呈劑量和時間依賴性；隨著處理時間的增加，使A549細胞的細胞周期阻滯在G2/M期，其作用機制與抑制微管蛋白聚合相關。本實驗研究發現當質量濃度為250 mg/L的PAP作用于A549細胞24 h，A549細胞出現凋亡特征。當質量濃度為1 000 mg/L的PAP作用于A549細胞72 h后，IR值達到95.08%，IC50為487 mg/L。

細胞在形態學上的特征性改變是證明其發生凋亡的有力證據[40-41]。通過倒置顯微鏡、熒光染色實驗的變化可以很直觀地看到細胞早期凋亡的形態學上變化。在本實驗中，通過細胞形態學實驗，觀察到PAP作用后，A549細胞表現出明顯的細胞形態學變化，如細胞間隙變大、形態不規則、體積變小、部分細胞出現空泡及凋亡小體等，隨濃度增加效果更加顯著。

總之，經堿性蛋白酶提取的沙蠶多肽PAP在體外可以有效抑制A549細胞的增殖，作用24 h后A549細胞即表現出明顯的細胞凋亡特征。

4 結 論

本實驗采用堿性蛋白酶，在酶解溫度50 ℃、酶解pH 11、料液比1∶1、酶解時間6 h、加酶量300 U/g條件下對沙蠶勻漿液進行酶解，經超濾、離子交換色譜、凝膠過濾色譜和制備色譜分離純化，獲得沙蠶酶解多肽PAP，經氨基酸測序發現其氨基酸序列為Ile-Glu-Pro-Gly-Thr-Val-Gly-Met-Met-Phe。研究結果表明，PAP對A549細胞具有增殖抑制活性且具有劑量和時間依賴性。PAP作用后，A549細胞出現凋亡特征，但PAP導致A549細胞凋亡的途徑還需通過進一步的實驗進行驗證。

[1] JEMAL A, SIEGEL R, WARD E, et al. Cancer statistics, 2009[J]. A Cancer Journal for Clinicians, 2009, 59(4)： 225-249. DOI：10.3322/ caac.20006.

[2] WINTER E, GRALOW J, DILLER L, et al. Clinical cancer advances 2008： major research advances in cancer treatment, prevention, and screening-a report from the American Society of Clinical Oncology[J]. Journal of Clinical Oncology, 2009, 27(5)： 812-826. DOI：10.1200/ JCO.2008.21.2134.

[3] 王淑媛, 王素英. 海洋抗腫瘤活性物質的研究進展[J]. 食品與藥品, 2007, 9(3)： 55-59. DOI：10.3969/j.issn.1672-979X.2007.03.019.

[4] MARGOLIN K, LONGMATE J, SYNOLD T W, et al. Dolastatin-l0 in melanoma： a phase and pharmokinetic trial of the California cancer consortium[J]. Invest New Drwgs, 2001, 19(4)： 335. DOI：10.1002/ cncr.21265.

[5] 王曉琴. 小球藻抗腫瘤多膚的分離及其微囊化研究[D]. 廣州： 華南理工大學, 2012.

[6] 張玉艷. 文蛤抗腫瘤多肽的分離純化及抗腫瘤機理的研究[D].青島： 中國科學院海洋研究所, 2009.

[7] 管華詩. 中華海洋本草[M]. 上海： 上海科學技術出版社, 2009： 68.

[8] 張云龍. 沙蠶纖溶蛋白酶的生化與分子生物學研究[D]. 長春： 吉林大學, 2007.

[9] 李奇. 沙蠶蛋白酶及同工酶的分離純化、性質及藥用生物活性研究[D]. 長春： 吉林大學, 2008.

[10] 王少華. 日本刺沙蠶蛋白酶的純化、鑒定及日本刺沙蠶纖溶酶的部分藥效學研究[D]. 長春： 吉林大學, 2011.

[11] 白若倫, 李奇, 劉佳, 等. 沙蠶蛋白酶對血小板聚集及血液流變學的影響[J]. 中國新藥雜志, 2009, 18(10)： 930-933.

[12] 薄其青, 葛鑫, 崔佳樂, 等. 酸性絲氨酸蛋白酶ASPNJ對K562白血病細胞的抑制與損傷作用研究[J]. 中國生化藥物雜志, 2012, 33(6)：736-739.

[13] 李春花. 酸性絲氨酸蛋白酶對淋巴細胞白血病Jurkat細胞的抑制作用及可能的機制[D]. 長春： 吉林大學, 2015.

[14] GE Xin, BO Qiqing, HONG Xinyu, et al. A novel acidic serine protease, ASPNJ inhibits proliferation, induces apoptosis and enhances chemosusceptibility of acute promyelocytic leukemia cell[J]. Leukemia Research, 2013, 37(12)： 1697-1703.

[15] 薄其青. 酸性絲氨酸蛋白酶對人慢性髓性粒細胞株K562細胞作用的初步研究[D]. 長春： 吉林大學, 2012 .

[16] 張國梅, 楊最素, 丁國芳, 等. 沙蠶活性蛋白酶誘導人肺癌SPC-A-1細胞凋亡的機制研究[J]. 現代食品科技, 2015, 31(3)： 6-11. DOI：10.13982/j.mfst.1673-9078.2015.3.002.

[17] 蔣霞敏, 林少珍, 王春琳. 雙齒圍沙蠶營養成分分析[C]//全國首屆海洋生物化學與分子生物學學術會議暨全國第五屆海洋生命活性物質與天然生化藥物學術研討會. 宜昌： 中國生物化學與分子生物學會, 2004： 250-254.

[18] 曹啟猛. 養殖雙齒圍沙蠶營養成分分析及其纖溶酶的分離純化[D].青島： 青島科技大學, 2016.

[19] 鄧志會, 孫賀, 林巖, 等. 一種新型具有纖溶活性的沙蠶金屬蛋白酶的分離純化及鑒定[J]. 中國生物化學與分子生物學報, 2011(8)： 768-774.

[20] 宋淑梅, 馬睿霄, 金楓清, 等. 雙齒圍沙蠶化學成分及其浸膏抗腫瘤活性的研究[J]. 河北漁業, 2015(11)： 4-7.

[21] 曹榮, 劉淇, 殷邦忠. 響應面法優化海參性腺酶解工藝[J]. 食品科學, 2012, 33(2)： 29-33.

[22] 曹艷萍, 楊秀利, 薛成虎, 等. 馬鈴薯蛋白質酶解制備多肽工藝優化[J].食品科學, 2010, 31(20)： 246-250.

[23] 劉麗莉, 王煥, 李丹, 等. 雞蛋清卵白蛋白酶解工藝優化及其結構性質[J]. 食品科學, 2016, 37(10)： 54-61.

[24] KITTS D D, WEILER K. Bioactive proteins and peptides from food sources. Applications of bioprocesses used in isolation and recovery[J]. Current Pharmaceutical Design, 2003, 9(16)： 1309-1323. DOI：10.2174/1381612033454883.

[25] 張巖, 吳燕燕, 李來好, 等. 酶法制備海洋活性肽及其功能活性研究進展[C]//廣東省食品學會第六次會員大會暨學術研討會. 廣州： 廣東省食品學會, 2012： 42-48.

[26] 趙謀明. 酶法制備生物活性肽[C]//中國工業生物技術發展高峰論壇. 天津： 中國生物工程學會, 2013： 51.

[27] 周軍明. 褐藻糖膠提取純化、結構分析及抗氧化研究[D]. 杭州： 浙江大學, 2006.

[28] 朱森君, 陳米娜, 牛慶鳳, 等. 單環刺螠內臟多糖結構的分析及其對脂質過氧化物的清除作用[J]. 食品科學, 2015, 36(5)： 67-71. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201505013.

[29] HUANG F F, YANG Z S, YU D, et al. Sepia ink oligopeptide induces apoptosis in prostate cancer cell lines via caspase-3 activation and elevation of Bax/Bcl-2 ratio[J]. Marine Drugs, 2012, 10(10)： 2153-2165. DOI：10.3390/md10102153.

[30] 丁國芳, 黃芳芳, 楊最素, 等. 烏賊墨酶解肽提取方法及其抗腫瘤活性[J]. Chinese Journal of Natural Medicines, 2011, 9(2)： 151-155. DOI：10.3724/SP.J.1009.2011.00151.

[31] 卜書紅, 李方, 田懷平. MTT比色法進行體外腫瘤藥敏實驗的影響因素[J]. 北京醫學, 2002, 24(5)： 349. DOI：10.3969/ j.issn.0253-9713.2002.05.021.

[32] 馬艷春, 周波, 孫許濤, 等. MTT法檢測地龍有效成分對腎小球系膜細胞增殖的影響[J]. 中醫藥信息, 2010, 27(1)： 34-36. DOI：10.3969/ j.issn.1002-2406.2010.01.013.

[33] 陳美珍, 葛安山, 崔鵬舉, 等. 龍須菜藻紅蛋白對Hela細胞增殖抑制及其機制的研究[J]. 食品科學, 2007, 28(9)： 549-552. DOI：10.3321/ j.issn：1002-6630.2007.09.136.

[34] PETTIT G R, KAMANO Y, HERALD C L, et al. The isolation and structure of a remarkable marine animal antineoplastic constituent, dolastatin 10[J]. Journal of the American Chemical Society, 1987, 109(22)： 6883-6885. DOI：10.1021/ja00256a070.

[35] 曹王麗, 宋佳希. 海洋生物抗腫瘤多肽海兔毒素10及其衍生物的研究進展[J]. 醫學研究生學報, 2011, 24(11)： 1208-1211. DOI：10.3969/ j.issn.1008-8199.2011.11.023.

[36] CHI C F, HU F Y, WANG B, et al. Antioxidant and anticancer peptides from the protein hydrolysate of blood clam (Tegillarca granosa) muscle[J]. Journal of Functional Foods, 2015, 15： 301-313. DOI：10.1016/ j.jff.2015.03.045.

[37] 姚如永, 初曉, 陳守國, 等. 海洋泥蚶多肽抗腫瘤作用的實驗研究[J]. 中國藥學雜志, 2006, 41(11)： 868-870. DOI：10.3321/ j.issn：1001-2494.2006.11.021.

[38] 王翠翠. 文蛤多肽的分離純化及抗腫瘤機制研究[D]. 青島： 中國科學院海洋研究所, 2011.

[39] 王翠翠, 劉明, 王鳳霞, 等. 文蛤多肽抑制腫瘤細胞微管蛋白聚合[J].中國生化藥物雜志, 2012, 33(3)： 225-228.

[40] 楊連君, 司曉輝, 王文亮, 等. 六種染色后光鏡觀察法檢測肝癌細胞凋亡[J]. 實用醫技雜志, 2006, 13(1)： 8-10. DOI：10.3969/ j.issn.1671-5098.2006.01.004.

[41] 朱秀敏. 細胞凋亡的形態特征與分子機制研究進展[J].中國老年學雜志, 2011, 31(13)： 2595-2597. DOI：10.3969/ j.issn.1005-9202.2011.13.105.

Anticancer Activity of a Novel Peptide Derived from Hydrolysates of Perinereies aibuhitensis against Lung Cancer A549 Cells

JIA Yinglu1, DING Guofang1,2,*, YANG Zuisu1, YU Fangmiao1, ZHENG Yuanyuan1, WU Zongze1, CHEN Rui1
(1. Key Engineering Research Centers of Marineorganisms Medical Products, School of Food Science and Medical, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China; 2. Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang, Zhoushan 316021, China)

The key steps for preparing antitumor peptide from enzymatic hydrolysates of Perinereies aibuhitensis were investigated in the present work. The most suitable enzyme preparation was selected and the optimal hydrolysis conditions allowing high inhibition of cancer cell proliferation were determined using one-factor-at-a-time method and orthogonal array design. A fraction containing peptides with molecular weights of1 3 ku was obtained by ultrafilation of hydrolysates, and it was further purified by sequential ion exchange chromatography, gel filtration chromatography and preparative chromatography. Then, lung cancer A549 cells were used to test the anticaner effect of the purified peptide PAP by methylthiazolyldiphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. The morphological changes were observed through an inverted microscope, dual acridine orange/ethidium bromide (AO/EB) fluorescent staining and Hoechst fluorescent staining. The results showed that alcalase was found to be the optimal enzyme for the production of anticancer peptide and that the optimal hydrolysis conditions were determined as follows： temperature, 50 ℃; pH value, 11; solid-to-liquid ratio, 1：1; hydrolysis time,6 h; and enzyme dosage, 300 U/g. The peptide PAP was identified as Ile-Glu-Pro-Gly-Thr-Val-Gly-Met-Met-Phe. Moreover, our results demonstrated that PAP suppressed the proliferation of A549 cells in a time- and dose-dependent manner with morphological features of apoptosis being observed. Therefore, our findings suggest that PAP could inhibit the proliferation of lung cancer A549 cells and induced apoptosis.

Perinereies aibuhitensis; polypeptide; anti-cancer; A549 cell lines; cell apoptosis

10.7506/spkx1002-6630-201712005

R734.2

A

1002-6630（2017）12-0027-09

2016-08-31

國家自然科學基金青年科學基金項目（81001393）；2015年度國家星火計劃項目（2015GA700044）；國家海洋重大計劃項目（2015862）；浙江省科技廳重大專項（2013C03036）；浙江省自然科學基金項目（LS15H30001）；浙江省自然科學基金青年資金項目（LQ16H300001）；舟山市科技計劃項目（2015C31012）

賈盈露（1992—），女，碩士研究生，研究方向為海洋藥物、海洋功能食品。E-mail：m18768013696@163.com

*通信作者：丁國芳（1958—），男，教授，本科，研究方向為海洋藥物、海洋功能食品。E-mail：dinggf2007@163.com

賈盈露, 丁國芳, 楊最素, 等. 雙齒圍沙蠶多肽的制備及其抗肺癌A549細胞活性[J]. 食品科學, 2017, 38(12)： 27-35.

10.7506/spkx1002-6630-201712005. http：//www.spkx.net.cn

JIA Yinglu, DING Guofang, YANG Zuisu, et al. Anticancer activity of a novel peptide derived from hydrolysates of Perinereies aibuhitensis against lung cancer A549 cells[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 27-35. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201712005. http：//www.spkx.net.cn