HPLC法測定渝東南地區傳統土家特色酸鲊肉中的組胺含量

冉春霞，陳光靜，胡 江

（1.重慶三峽醫藥高等專科學校醫學技術系，重慶 404120；2.重慶市抗腫瘤天然藥物工程技術研究中心，重慶 404120；3.西南大學食品科學學院，重慶 400715；4.重慶市萬州區農產品質量安全監督檢測中心，重慶 404120）

HPLC法測定渝東南地區傳統土家特色酸鲊肉中的組胺含量

冉春霞1,2，陳光靜3，胡 江4

（1.重慶三峽醫藥高等專科學校醫學技術系，重慶 404120；2.重慶市抗腫瘤天然藥物工程技術研究中心，重慶 404120；3.西南大學食品科學學院，重慶 400715；4.重慶市萬州區農產品質量安全監督檢測中心，重慶 404120）

建立測定渝東南地區傳統土家特色酸鲊肉中組胺含量的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）方法，并進行樣品中組胺含量的測定。以1,7-庚二胺為內標物，丹磺酰氯為樣品衍生劑；Agilent C18柱為固定相，70%甲醇和30%超純水為流動相，于波長254 nm處進行紫外檢測。用0.4 mol/L高氯酸溶液提取樣品中的組胺，然后測定酸鲊肉中的組胺含量。結果表明：內標物和組胺標準品分別在4.335 min和7.723 min出峰，且分離效果良好。經實驗驗證，組胺鹽酸鹽標準品的峰面積和內標物峰面積的比值與組胺質量濃度之間存在良好的線性關系，樣品加標實驗回收率在98.5%～102.2%之間；儀器檢出限為0.50 mg/L，定量限為1.00 mg/L，精密度相對標準偏差為1.0%。經檢測10 個樣品中組胺含量在19.68～44.15 mg/kg之間，不同樣品組胺含量有顯著性差異（P＜0.05）。本研究表明HPLC方法的靈敏度和精密度較高，是檢測酸鲊肉中組胺含量的可靠方法。

渝東南地區；傳統土家特色酸鲊肉；組胺；高效液相色譜法

酸鲊肉屬于“鲊”的一種，其傳統制作工藝距今已有2 000多年的歷史。渝東南地區傳統土家特色酸鲊肉是一種以新鮮豬肉為原料，洗凈后切片，同時將大米（玉米或糯米）、花椒、八角、山柰等放入鍋內，用小火炒出焦香味，取出磨成粉。然后將米粉、豬五花肉片、白酒、糟辣椒按一定比例混合均勻，再裝入壇子里，在自然條件下利用微生物的厭氧發酵作用而形成的一種乳酸細菌型發酵肉制品[1]。酸鲊肉具有肉質細膩、風味獨特、肥而不膩、營養豐富、保存期長、綠色和原生態等特點，同時現代營養學研究表明其具有降血清膽固醇、調節胃腸道、抗氧化等生理保健功能[2-4]，因而越來越受到廣大消費者的喜愛。

組胺是游離的組氨酸在微生物產生的組氨酸脫羧酶的作用下脫羧或醛、酮類物質氨基化形成的一類具有生物活性的小分子質量含氮有機化合物，同時也是生物胺中毒性最強的一種，對人類健康影響最大。適量的組胺是人體神經系統、消化系統以及心血管系統的正常功能所必需的，但高濃度攝入可能會引起食物過敏和食物中毒，并表現出一系列癥狀：噴嚏、面部潮紅、嘔吐、腹瀉、頭痛、呼吸困難、發熱、高血壓等[5-7]，嚴重時還可能引起腦出血，甚至是死亡。據統計：2000—2006年期間，英國發生組胺中毒事件187 例；1998—2008年期間，日本發生組胺中毒事件1 500 例[8]；2002—2012年期間，中國發生食品組胺中毒事件約140 例[9]，組胺中毒已經成為主要的公共衛生和食品安全問題。組胺廣泛存在于發酵香腸、發酵豆制品、奶酪、發酵酒等發酵食品中，其含量越來越受到國內外研究人員的關注[10-14]。傳統酸鲊肉在自然發酵過程中有大量不同種類微生物的參與，可能含有組胺。組胺的分析方法有分光光度法、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、薄層色譜法、氣相色譜法、毛細管電泳法、電化學生物傳感器法等[15]，其中HPLC法具有分析速度快、柱效高、檢測靈敏度高、定量分析準確等特點，是目前食品中生物胺分析檢測的主要手段。大量研究[16-20]采用HPLC法檢測發酵香腸、發酵豆制品等食品中的生物胺的含量，但目前未見有關傳統酸鲊肉中組胺含量測定的報道。因此，本研究采用HPLC法測定渝東南地區傳統土家特色酸鲊肉中組胺的含量，從組胺的角度考察傳統酸鲊肉的安全性，以期為渝東南地區土家特色酸鲊肉中組胺的定量風險評估提供試驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸鲊肉樣品（10 個）分別購于重慶市石柱、黔江、豐都、彭水、秀山等土家族聚居地的農貿市場和超市（表1）；0.22 μm濾膜針頭濾器。

表1 渝東南地區傳統土家特色酸鲊肉的來源和特點Table1 The origin and characteristics of traditional Tujia special Suanzharou meat in southeast area of Chongqing

組胺鹽酸鹽標準品（純度≥99%）、丹磺酰氯（純度≥98%）、1,7-庚二胺（內標物）（純度≥99%）美國Sigma公司；甲醇（色譜純） 天津四友精細化工廠；氫氧化鈉、碳酸氫鈉、丙酮、乙酸酐、濃氨水（均為分析純） 成都科龍化工試劑廠；高氯酸、鹽酸、冰醋酸（均為分析純） 重慶川東化工有限公司；水為超純水。

1.2 儀器與設備

1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司；GTR16-2高速冷凍離心機 北京時代北利離心機有限公司；DS-1高速組織搗碎機 上海標本模型廠；XH-C旋渦混勻器無錫沃信儀器有限公司；RE-2000B旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；WITOPET premium（20～200 μL）移液槍 上海安譜實驗科技股份有限公司；Hitech-Kflow超純水儀 上海和泰儀器有限公司；KQ-100E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；PTX-FA300電子分析天平 美國康州HZ電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

準確稱取已絞碎和勻漿的酸鲊肉5 g置于50 mL離心管中，加入20 mL 0.4 mol/L高氯酸溶液和2.0 mL（100 mg/L）內標使用液，混勻，振蕩提取60 min，放入高速冷凍離心機中4 ℃、4 000 r/min離心10 min，取上清液，移入50 mL容量瓶中，連續提取兩次，合并上清液，用0.4 mol/L高氯酸溶液定容至刻度，待衍生。

1.3.2 組胺相關試劑的配制

準確稱取10 mg組胺鹽酸鹽標準品于10 mL容量瓶中，用0.4 mol/L高氯酸溶液稀釋至刻度，混勻，配制成質量濃度為1 000 mg/L的標準儲備溶液，置4 ℃冰箱貯存。

準確吸取5.00 mL組胺標準儲備溶液，置于50 mL容量瓶中，用0.4 mol/L高氯酸溶液稀釋至刻度，混勻，配制成質量濃度為100 mg/L的標準使用液，置4 ℃冰箱貯存。

吸取0.10、0.25、0.50、1.00、1.50、2.5、5.0 mL組胺標準使用液（100 mg/L），分別置于10 mL容量瓶中，用0.4 mol/L高氯酸溶液稀釋至刻度，混勻，使質量濃度分別為1.00、2.50、5.00、10.0、15.0、25.0、50.0 mg/L，同時做標準品空白實驗。

1.3.3 內標標準儲備液和標準使用液的配制

準確稱取1,7-庚二胺內標物質10 mg于10 mL容量瓶中，用0.4 mol/L高氯酸溶液稀釋至刻度，混勻，配制成質量濃度為1 000 mg/L的標準儲備溶液，置4 ℃冰箱貯存。

準確吸取5.00 mL 1,7-庚二胺內標標準儲備溶液，置于50 mL容量瓶中，用0.4 mol/L高氯酸溶液稀釋至刻度，混勻，配制成質量濃度為100 mg/L的標準使用液，置4 ℃冰箱貯存。

1.3.4 丹磺酰氯衍生劑溶液的配制

準確稱取500 mg丹磺酰氯于50 mL容量瓶中，以丙酮稀釋定容，混勻，配制成10 mg/mL的衍生劑標準使用液，置4 ℃冰箱貯存。

1.3.5 組胺標準系列溶液和樣品溶液的衍生

參照孫霞等[21]的方法，并經預實驗進行相關參數的優化。分別移取1.00 mL組胺標準系列溶液于具塞試管中，加入200 μL2 mol/L氫氧化鈉溶液調至中性，然后加入300 μL飽和碳酸氫鈉溶液緩沖，再加入40 μL內標物和2.0 mL丹磺酰氯衍生劑，振蕩混勻。置于60 ℃培養箱中反應30 min，中間振蕩兩次，取出，分別加入100 μL濃氨水混勻，置于暗處20 min以終止反應。40 ℃減壓蒸餾除去丙酮，剩余樣液用甲醇定量至5 mL，振蕩混勻，過0.22 μm微孔濾膜，濾液待測。

分別移取1.00 mL樣品溶液于具塞試管中，加入200 μL2 mol/L氫氧化鈉溶液調至中性，然后加入300 μL飽和碳酸氫鈉溶液緩沖，再加入2.0 mL丹磺酰氯衍生劑，振蕩混勻。置于60 ℃培養箱中反應30min，中間振蕩兩次，取出，分別加入100 μL濃氨水混勻，置于暗處20 min以終止反應。40 ℃減壓蒸餾除去丙酮，剩余樣液用甲醇定量至5 mL，振蕩混勻，過0.22 μm微孔濾膜，濾液待測。

1.3.6 高效液相色譜分析條件

色譜柱為Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），紫外檢測器，檢測波長254 nm。進樣量20 μL，柱溫35 ℃，流動相A為甲醇溶液，B為超純水，A-B比例70∶30（V/V），流速1.0 mL/min。

1.3.7 檢出限、定量限和精密度的測定[17,22]

將1.00 mg/L的組胺標準溶液用甲醇適當稀釋，按

1.3.5 節的方法進行衍生后測定，以信噪比確定檢出限（RSN=3）和定量限（RSN=10）。

取質量濃度為15.00 mg/L的組胺標準溶液按1.3.5節方法進行衍生后測定，連續進樣5 次，根據組胺與內標物的峰面積比計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.8 組胺加標回收率的測定

從5 個樣品產地采集的酸鲊肉樣品中分別選擇1 個樣品作為研究對象，向樣品中添加一定量組胺標準溶液（20、50 mg/kg），每個加標水平平行測定5 次，計算不同加標水平的回收率和平均回收率。

1.3.9 組胺含量的計算

按下式計算樣品中組胺的含量：

式中：ρ為樣品中組胺的含量/（mg/kg或mg/L）；m1為樣品中組胺色譜峰與內標色譜峰的峰面積比值對應的組胺質量/μg；f為試樣稀釋倍數；m為取樣量/（g或mL）。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2007和Origin 7.5（美國Origin Lab公司）分析和處理數據，實驗平行測定5 次并計算平均值和標準偏差。同時采用t檢驗和方差分析各測定結果在95%置信區間（P＜0.05）水平下是否存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 組胺標準品圖譜和標準曲線

圖1 內標物質1,7-庚二胺的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of internal standard substance 1,7-heptanediamine

在本實驗建立的色譜條件下得到HPLC圖，從圖1和圖2可知：內標物質1,7-庚二胺和組胺鹽酸鹽標準品的保留時間分別為4.335 min和7.723 min，兩組峰得到有效分離，且峰形比較對稱、無基線漂移和拖尾現象，分離效果較理想。

圖2 組胺鹽酸鹽標準品的HPLC圖Fig.2 HPLC chromatogram of histamine dihydrochloride standard

將1.00、2.50、5.00、10.0、15.0、25.0、50.0 mg/L的標準溶液依次進樣，以組胺鹽酸鹽標準品的峰面積與內標物峰面積的比值為縱坐標，標準系列溶液的質量（μg）為橫坐標繪制標準曲線，并計算標準曲線的回歸方程及相關系數。組胺衍生物的標準曲線回歸方程為y = 2.027x－1.455。標準回歸曲線圖中各點偏離曲線的幅度很小，回歸分析結果顯示相關系數R2為0.999 0。因此，在1.00～50.0 mg/L線性范圍內標準品和內標物的峰面積比與相應標準系列溶液的質量呈現良好的線性關系，符合測定要求。

2.2 檢出限、定量限和精密度的測定結果

將質量濃度為1.00 mg/L的組胺標準溶液稀釋成不同的低質量濃度溶液，經衍生后進樣測定。結果表明：當RSN為3時，組胺標準溶液的質量濃度為0.50 mg/L；當RSN為10時，組胺標準溶液的質量濃度為1.00 mg/L。因此，儀器的檢出限為0.50 mg/L，定量限為1.00 mg/L。將質量濃度為15.00 mg/L的組胺標準溶液經衍生后測定，連續進樣5 次，組胺的保留時間穩定且峰面積與內標物的峰面積比值的RSD為1.0%。根據《中國藥品檢驗標準操作規程》規定：HPLC分析的允許RSD范圍為±2%，說明儀器精密度較好。

2.3 樣品中組胺加標回收率的測定

表2 組胺加標回收率的測定（ =5）Table2 Recovery of histamine in spiked samples ( = 5)

由表2可知，樣品中組胺加標回收實驗RSD在0.59%～1.95%之間，在±2%范圍內；平均回收率在98.5%～102.2%之間，經t檢驗分析平均回收率數據間差異水平，在置信區間95%范圍內得到P值為1.0（＞0.05），表明各組加標實驗平均回收率之間無顯著性差異。可見該方法回收率高，可靠性高。

2.4 渝東南地區傳統土家特色酸鲊肉中組胺含量的測定結果

圖3 酸3 鲊肉樣品中組胺的HPLC圖HPLCFig.3 HPLC chromatogram of histamine in Suanzharou

圖4 酸鲊肉中的組胺含量（n=5）=5Fig.4 The content of histamine in Suanzharou (n = 5)

歐盟規定除魚類以外的其他食品中組胺含量不得超過100 mg/kg[23]；美國食品和藥品管理局標準規定食品中組胺含量應低于500 mg/kg[24]；到目前為止，我國僅僅在食品安全標準GB 2733—2005《鮮（凍）動物性水產品衛生標準》中規定了魚類的組胺含量，而其他食品中組胺含量的尚未限定[25]。從圖3和圖4可知，酸鲊肉中存在組胺且組胺含量在19.68～44.15 mg/kg之間，其含量低于歐盟和美國食品和藥品管理局的規定。組胺含量在樣品2和樣品4之間、樣品8和樣品10之間無顯著性差異（P＞0.05），其他各樣品之間均存在顯著性差異（P＜0.05），即不同來源的樣品組胺含量不同。

圖5 農貿市場（A）和超市（B）酸鲊肉中組胺含量的比較（ =5）Fig.5 Comparison of histamine content in Suanzharou from farmer’s market and supermarket (n = 5)

食品中組胺的形成受到很多因素的影響，如原料的pH值、種類、組分、微生物種類、貯藏溫度、包裝條件以及輔料等[11,26]。結合表1和圖5可知，來源于超市的樣品中組胺含量普遍低于農貿市場的樣品，同時采用t檢驗分析兩類樣品組胺含量是否存在顯著性差異，結果表明在置信區間95%內P值為0.025（＜0.05），即來源于超市的樣品與農貿市場的樣品中組胺含量存在顯著性差異。發酵時間越長的樣品組胺含量越高；肥肉較多的樣品中組胺含量會相應低于瘦肉較多的樣品，可能的原因：1）來源于農貿市場的酸鲊肉的貯藏溫度、包裝條件不當或環境衛生條件較差，有研究[27-28]表明貯藏在4 ℃、真空或氣調包裝的肉制品組胺含量更少，這與產組氨酸脫羧酶微生物的生長受到抑制有關；2）發酵時間越長，受到腸細菌、乳酸菌的某些種、假單胞菌等雜菌污染的幾率就越大，在一定程度上也增加了組胺大量產生的風險[29]；3）脂肪含量會影響組胺的形成，原料肉中脂肪含量越高則組胺生成量越低，這可能是因為水分活度抑制了微生物的生長和游離組氨酸的形成，從而降低了生物胺的生成量[30]。

3 結 論

本研究采用丹磺酰氯衍生，高效液相色譜-紫外檢測方法測定渝東南地區傳統土家特色酸鲊肉中的組胺含量，組胺在7.723 min出峰且峰形對稱、無漂移和拖尾現象。該方法快速、靈敏、精密度和回收率較高，能夠滿足酸鲊肉中組胺的測定。采用該方法測得渝東南地區土家特色酸鲊肉中組胺含量在19.68～44.15 mg/kg之間，低于歐盟和美國食品和藥品管理局的標準，但我國還沒有相關標準規定。酸鲊肉中組胺的形成受多種因素的影響，要確定各種因素在組胺形成中的作用，還需要進一步的實驗驗證，從而為渝東南地區傳統土家特色酸鲊肉的安全食用提供理論依據。

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Determination of Histamine Content in Suanzharou, a Unique and Traditional Fermented Meat Product of the Tujia Nationality in Southeastern Chongqing by High Performance Liquid Chromatography

RAN Chunxia1,2, CHEN Guangjing3, HU Jiang4
(1. Department of Medical Technology, Chongqing Three Gorges Medical College, Chongqing 404120, China; 2. Chongqing Engineering Research Center of Antitumor Natural Drugs, Chongqing 404120, China; 3. School of Food Science, Univerisity of Southwest, Chongqing 400715, China; 4. Chongqing District of Wanzhou City Agricultural Products Quality Safety Supervision and Inspection Center, Chongqing 404120, China)

The purpose of this study was to establish a high performance liquid chromatography (HPLC) method for the qualitative and quantitative detection of histamine in Suanzharou, a unique and traditional fermented meat product of the Tujia nationality in southeastern Chongqing. 1,7-Heptanediamine was used as an internal standard substance. Dansyl chloride was used as a derivatization agent. The chromatographic separation was accomplished using an Agilent C18column as stationary phase and a mixture of 70% methanol and 30% ultra pure water as mobile phase, and the UV detector was set at 254 nm. The analyte was extracted with 0.4 mol/L HClO4solution and analyzed by HPLC. Results showed that the peaks for 1,7-heptanediamine and histamine dihydrochloride appeared at 4.335 min and 7.723 min, respectively, and an acceptable separation was achieved. The proposed method showed a good linearity between the ratio of peak area (histamine dihydrochloride and 1,7-heptanediamine) and the mass concentration of histamine. The recovery of spiked samples was between 98.5%-102.2%, the instrumental limit of detection (LOD) was 0.50 mg/L and the limit of quantitation (LOQ) was 1.00 mg/L. The precision expressed as relative standard deviation (RSD) was 1.0%. The histamine content of10 real samples was detected to be in the range of 19.68-44.15 mg/kg, with significant differences existing among these samples (P ＜ 0.05). In conclusion, this method is reliable for the detection of histamine in Suanzharou with high sensitivity and precision.

southeastern Chongqing; Suanzharou; histamine; HPLC

10.7506/spkx1002-6630-201712044

TS207.3

A

1002-6630（2017）12-0286-06

2016-07-30

重慶市教委科學技術研究項目（KJ1502608）

冉春霞（1985—），女，講師，碩士，研究方向為食品化學與營養學、食品安全與質量控制。E-mail：chunxiaran@126.com

冉春霞, 陳光靜, 胡江. HPLC法測定渝東南地區傳統土家特色酸鲊肉中的組胺含量[J]. 食品科學, 2017, 38(12)：286-291.

10.7506/spkx1002-6630-201712044. http：//www.spkx.net.cn

RAN Chunxia, CHEN Guangjing, HU Jiang. Determination of histamine content in Suanzharou, a unique and traditional fermented meat product of the Tujia nationality in southeastern Chongqing by high performance liquid chromatography[J]. Food Science, 2017, 38(12)：286-291. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712044. http：//www.spkx.net.cn