植物乳桿菌天然質粒分類

孫大慶，李洪飛，宋大巍，楊 建,

（1.黑龍江八一農墾大學 國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319）

植物乳桿菌天然質粒分類

孫大慶1，李洪飛1，宋大巍2，楊 建1,2

（1.黑龍江八一農墾大學 國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319）

為建立植物乳桿菌天然質粒分類方法，以質粒復制起始蛋白（replication initiation protein，Rep）作為分類標記，通過系統進化樹分析方法，將植物乳桿菌53 個編碼Rep天然質粒劃分為6 個質粒類型，包括5 個質粒家族和1 個新的復制類型質粒，之后進一步提出了每個質粒家族特有的骨干序列，最終建立了一種簡單、有效的植物乳桿菌天然質粒的分類方法和標準。與以往質粒功能和不相容性分類方法相比較，本方法具有較好的實用性和通用性。關鍵詞：植物乳桿菌；質粒；基因組；復制起始蛋白；復制子

植物乳桿菌廣泛分布于動物、植物、人類體表和體內，以及眾多發酵食品等自然和人工環境中，是乳酸菌中環境適應能力最強的菌種之一，并且它們已經廣泛應用于食品、藥品、飼料等工業產品加工中。由于具有十分重要的經濟和社會價值，近年來植物乳桿菌生理、遺傳、進化和分類學研究得到了廣泛關注[1-2]，已成為乳酸菌研究領域的模式菌種，并有人將它形象地稱為“自然代謝工程師”[3]。

生物學研究發現，植物乳桿菌具有良好的環境適應能力和多種益生功能，不但得益于植物乳桿菌擁有乳酸菌中最大的基因組，并且植物乳桿菌含有的天然質粒很可能在其中扮演了重要角色。目前，越來越多的研究發現，質粒對植物乳桿菌在特殊環境下的生存和生產加工性狀具有至關重要的作用，因為這些質粒編碼了很多重要的功能蛋白質，例如碳水化合物利用、細菌素和胞外多糖合成、抗生素抗性等[4-5]。此外，天然質粒經常被用于構建穿梭載體，這些載體是植物乳桿菌分子生物學研究中不可或缺的研究工具[6-7]。因此，開展植物乳桿菌天然質粒的相關研究可以更好的促進植物乳桿菌基礎和應用研究。

1989年第1個植物乳桿菌質粒完整基因組確定[8]，至今NCBI Genome數據庫中已收錄68 個完整質?；蚪M。經過統計和對比分析，與其他乳桿菌或乳酸菌比較，植物乳桿菌天然質粒在大小、數量和多樣性方面都是最豐富的菌種[9]。近年來，隨著測序技術的飛速發展，以往基于質粒功能和不相容性的分類方法由于費時、低效，已經越來越不能滿足質?；蚪M數量快速增加的需要，而基于比較基因組學的分類方法可能會更加方便且有效[10]。本研究以植物乳桿菌質粒豐富的基因組數據為基礎，采用比較基因組學統計和分析方法，以質粒Rep作為分類標記，嘗試建立一種簡單、有效的天然質粒系統分類方法，希望為今后植物乳桿菌天然質粒的系統分類研究提供有益的探索和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

表1 Genome數據庫中收錄的68 個植物乳桿菌質粒Table1 Sixty-eight plasmids of Lactobacillus plantarum recorded in the Genome database

植物乳桿菌68 個質?；蚪M序列由NCBI Genome數據庫下載獲得，基本信息見表1。質粒pC194、pMV158、pUCL287基因組登錄號分別為NC_002013.1、NC_010096.1、X75607.1。質粒pAD1和pIP501基因組序列來自文獻[11-12]。

1.2 方法

從NCBI Genome數據庫下載植物乳桿菌質?；蚪M序列。利用BLAST-P在線軟件進行Rep同源序列檢索和保守結構域鑒定。利用DNAman5.5和MEGA6.0[13]軟件進行多序列同源性比對和系統進化樹構建，系統進化樹采用Neighbor-Joining模型建樹，并采用Bootstrap1 000計算置信度。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌質粒Rep特征

表2 53 個植物乳桿菌質粒基因組和Rep蛋白的基本特征Table2 Basic characteristics of the genome of fifty-three plasmids and Rep protein in Lactobacillus plantarum

經序列比對和統計分析，在所有68 個質粒中發現15 個質粒沒有編碼已知的Rep，53 個質粒編碼Rep，其中51 個質粒含有1 個Rep，質粒pMRI5.2和pZL3含有2 個Rep。根據Rep含有的保守結構域和同源性，可以將55 個Rep劃分為5 個蛋白家族（表2）。

2.2 編碼Rep蛋白的質粒

圖1 植物乳桿菌質粒Rep蛋白氨基酸序列系統進化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on amino acid sequences of Rep proteins in Lactobacillus plantarum plasmids

2.2.1 Rep系統進化樹基于Rep氨基酸序列同源性，構建了植物乳桿菌質粒和5 個蛋白家族參考質粒Rep系統進化樹（圖1）。沒有包括假基因或截短基因編碼Rep的質粒，這些質粒將在下文討論。由圖1可以看出，植物乳桿菌45 個質粒分別與5 個參考質粒聚類，只有質粒pG6302未按Rep家族聚類，單獨成枝。因此植物乳桿菌46 個質粒根據Rep氨基酸序列同源性，可以有效地劃分為6 個類型，包括5 個質粒家族和質粒pG6302。質粒pZL3含有2 個Rep，都屬于Family 3，因此質粒pZL3屬于Family 3。質粒pMRI5.2也含有2 個Rep，分屬于Family 1和2，由于該質粒屬于特殊的復合質粒，即2 個不同家族質粒正在發生融合[14]，因此質粒pMRI5.2

可歸類為Family 1和Family 2。上述結果表明，Rep是質粒分類研究中一個比較理想的遺傳標記，基于Rep同源性可以建立一種簡單、快速、有效的質粒分類方法，進而為植物乳桿菌天然質粒分類學研究提供分子水平的佐證和依據。盡管特殊的復合質粒一定程度上降低了本方法對它們分類的有效性，但這個局限性并不影響此分類方法的有效性和實用性。

2.2.2 RCR質粒Family 1分析

表3 Family 1質粒Rep蛋白保守基序Table3 Conservative motifs of Rep proteins in plasmid Family 1

植物乳桿菌質粒Family 1由14 個質粒組成（圖1），與參考質粒pC194聚類，屬于第1類滾環復制（rolling circle replication，RCR）質粒。Family 1質粒大小1.91～3.51 kb，GC含量35.81～39.49%，Rep蛋白大小317～319 aa（表2）。經進一步序列比對分析，Family 1質粒Rep與質粒pC194 Rep（232 aa）序列大小差異顯著，顯示了較低的同源性（20.94%～24.30%），但Family 1質粒和pC194 Rep蛋白均含有3個保守的Motifs，并且Motif中關鍵功能位點高度一致（表3），這些Motifs已被證明是pC194家族質粒復制起始的關鍵功能位點[15-16]。這進一步表明Family 1質粒屬于RCR pC194家族。

pC194家族質粒最小復制子通常由rep基因、雙鏈復制起點（double strand origin，dso）和單鏈復制起點（single strand origin，sso）組成。通過進一步的序列分析發現，Family 1質粒均含有高度保守的rep和dso序列，稱為骨干序列，該序列與pC194家族質粒高度同源。雖然sso也是pC194家族質粒復制的必需元件，但近年研究發現該家族質粒sso可能并不保守[17]。共同骨干序列的存在進一步證明Family 1質粒屬于pC194家族，并且該骨干序列比Rep氨基酸序列具有更好的特異性，因此，由rep和dso序列組成骨干序列可以作為Family 1特異性的遺傳標記用于該家族質粒的分類。

2.2.3 RCR質粒Family 2分析

表4 Family 2質粒Rep蛋白保守基序Table4 Conservative motifs of Rep proteins in plasmid Family 2

植物乳桿菌質粒Family 2由6 個質粒組成（圖1），與參考質粒pMV158聚類，屬于第2類RCR質粒。Family 2質粒大小1.80～4.03 kb，GC含量34.33～38.24%，Rep蛋白大小196～237 aa（表2）。經序列比對分析，Family 2質粒Rep與質粒pMV158 Rep具有20.55%～62.56%同源性。質粒pMV158家族Rep蛋白含有5 個保守的Motifs（Ⅰ～Ⅴ），Motif Ⅲ和Motif Ⅳ對質粒前導鏈復制起始具有關鍵作用[16,18]。Family 2質粒中，除了pA1 Rep含有3 個保守Motifs，其余5 個質粒Rep均含有5 個保守的Motifs，并且這些Motifs的保守位點與pMV158 Rep的相應位點是完全一致的（表4）。因此根據Rep大小、同源性，尤其Motifs序列一致性可以看出，Family 2質粒屬于RCR pMV158家族。

基因組序列分析發現，Family 2質粒含有一個共同保守的骨干序列，該序列由cop、ctRNA、rep和dso組成，它們是pMV158家族質粒復制和拷貝數調控典型的基因元件。這進一步證明Family 2屬于RCR pMV158家族，同時由多個序 列組成的骨干序列可以作為Family 2質粒高特異性的分類標記。

2.2.4 theta復制質粒Family 3分析

植物乳桿菌質粒Family 3主要由12 個質粒組成（圖1），與參考質粒pUCL287聚類，屬于第1類theta型復制質粒。Family 3質粒大小5.52～93.54kb，GC含量33.37～42.41%，Rep蛋白大小307～311 aa（表2）。經比對分析，Family 3質粒Rep與質粒pUCL287 Rep（311 aa）序列具有68.17%～95.18%同源性，Rep蛋白在大小和序列同源性上顯示了高度保守性，這表明Family 3質?？赡軐儆趖heta型復制pUCL287家族[19]。前面提到質粒pZL3含有2 個Rep，即RepB（311 aa，YP_009062124）和RepA（304 aa，YP_009062132）。RepB和RepA與質粒pUCL287 Rep蛋白同源性分別為82.64%和45.03%，因此基于氨基酸序列大小和一致性，采用RepB作為質粒pZL3的Rep進行后續分析。

進一步序列分析發現，Family 3質粒與pUCL287家族質粒復制子具有共同的骨干序列，該序列包括復制起點（origin of replication initiation，ori）（4 個11 bp和4.5 個22 bp正向重復序列）和rep基因。高度保守骨干序列的存在有力地證明了Family 3質粒屬于theta型復制pUCL287家族，并且骨干序列可以作為特異性的遺傳標記用于Family 3質粒的分類。質粒LZ206p3的rep基因發生了移碼突變，Rep部分缺失，但在這個rep基因上游發現含有Family 3質粒典型的ori及其重復序列特征，因此質粒LZ206p3可歸屬為Family 3。

2.2.5 theta復制質粒Family 4分析

植物乳桿菌質粒Family 4主要由9 個質粒組成（圖1），與參考質粒pAD1聚類，屬于第2類theta型復制質粒。Family 3質粒大小16.10～45.41 kb，GC含量39.04～42.14%，Rep蛋白大小102～373 aa（表2）。質粒pAD1是theta型復制質粒RepA_N家族典型代表。經氨基酸序列比對分析，Family 4質粒Rep與質粒pAD1 Rep（336 aa）顯示了很低的同源性（4.44%～29.07%），但Family 4質粒較大的Rep（大于200 aa）與pAD1 Rep N端顯示高度同源性；Family 4質粒4 個較小的Rep（小于200 aa）與pAD1 Rep幾乎沒有同源性，但Family 4所有質粒Rep C端顯示高度同源性；Rep蛋白N和C末端之間序列顯示了很低的同源性。Family 4質粒Rep三個區域顯示的同源性特征與近年RepA_N家族質粒Rep獲得的研究結果一致，這與每個區域負責的復制起始功能密切相關[20-21]。RepA_N家族質粒Rep蛋白C端結構域是宿主菌屬特異的復制體組件，決定了質粒的宿主范圍[22]，因此Family 4質粒Rep蛋白C端顯示了高度同源性，而它們與質粒pAD1 Rep C端幾乎沒有同源性。這些分析結果表明Family 4質?？赡軐儆趖heta型復制RepA_N家族。

RepA_N家族質粒最大特征是ori在rep編碼序列內部，具有一個非常簡單、緊湊的復制子。該復制子僅由一個rep基因序列組成，rep上游編碼Rep N端結構域，中間是ori，下游編碼Rep C端結構域[21]。上文提到，Family 4質粒4 個小的Rep不含有RepA_N家族質粒Rep N端，而Family 4所有質粒Rep均含有家族特異的高保守的C端結構域，因此Rep高保守的C端序列可以作為Family 4質粒特異的骨干序列和遺傳標記，用于該家族質粒的分類。

基于Family 4質粒Rep C端保守序列，經全基因組序列分析發現，有6 個質粒存在Rep C端同源序列，這些序列在數據庫多數沒有注釋，僅有一個注釋為推測蛋白，同時6 個質?；蚪M中沒有發現任何其他已知的Rep，因此這些與Family 4質粒Rep C端具有同源性蛋白的存在，暗示這6 個質?？赡軐儆贔amily 4，因此，將這6 個質粒歸為Family 4類型質粒。

2.2.6 theta復制質粒Family 5分析

植物乳桿菌質粒Family 5由3 個質粒組成（見圖1），與參考質粒pIP501聚類，屬于第3類theta型復制質粒。Family 5質粒大小51.85～74.17 kb，GC含量41.33～42.56%，Rep蛋白大小510～512 aa（表2）。經氨基酸序列比對，Family 5的3 個Rep具有97.98%同源性，與無乳鏈球菌質粒pIP501 Rep（496 aa）具有31.47%～32.49%同源性。它們均含有保守的PriCT-1和HTH結構域，PriCT-1是引發酶C末端，可以引發復制體組裝；HTH則是最常見的DNA結合結構域，但2 個結構域在復制起始中的分子作用機制仍是未知的[22]。根據Rep大小、同源性和2 個保守結構域，推測Family 5屬于質粒pIP501相似的theta型復制質粒家族，盡管這個家族的復制機制目前仍是未知的[22-23]。

質粒pIP501最小復制子由rep基因及其下游的ori組成[24]。經進一步序列分析發現，Family 5家族質粒具有相似的復制子序列特征。因此，將rep基因和ori區域定義為Family 5質粒的骨干序列，該序列可以作為Family 5家族特有的遺傳標記用于該家族質粒的分類。

2.2.7 theta復制質粒pG6302分析

植物乳桿菌質粒pG6302大小9.11 kb，GC含量36.39%，Rep蛋白200 aa（表2）。根據質粒大小、GC含量和Rep家族（pfam01051），質粒pG6302可能屬于theta型復制質粒pUCL287家族，即Family 3。但經過進一步比對分析發現，質粒pG6302和pUCL287的Rep序列同源性僅為9.55%，遠低于Family 3質粒和pUCL287 Rep同源性。另外，在質粒pG6302 rep基因上游約1.4 kb處，發現由4 個27 bp正向重復序列組成的ori，這個ori序列特征與Family 3質粒ori明顯不同[25]。因此，根據Rep序列大小和同源性，尤其是ori中重復子的序列特征，推測質粒pG6302不屬于Family 3，屬于一種新的theta型復制質粒家族。

2.3 非編碼Rep蛋白的質粒分析

經基因組序列分析，植物乳桿菌其余15 個質粒既不含有已知的Rep，也不含有上述質粒家族骨干序列的典型特征，因此它們可能屬于新的未知的質粒家族。15 個質粒中p256、pLP9000和pG6303已有文獻報道，但質粒pLP9000[26]和pG6303[25]的復制類型和調控機制仍是未知的，只有質粒p256進行了比較深入的研究。質粒p256大小7.22 kb，GC比例36.73%，表現出一些非典型特征：1）不存在RCR質粒dso和單鏈中間體；2）最小復制子688 bp，包含一個開放閱讀框（open reading frame，ORF）、重復序列和4 個DnaA盒；3）最小復制子中ORF與任何已知蛋白沒有同源性，并且移碼突變不影響復制功能；4）質?？截悢?～10 個/染色體；5）最小復制子具有很窄的宿主范圍[27]。這些特征表明，質粒p256與植物乳桿菌上述6 個類型質粒明顯不同，推測它屬于一個新的不依賴Rep蛋白的theta型復制質粒家族。質粒p256最小復制子序列與其他14 個質粒進行比對，發現質粒LBPp7含有一個幾乎完全一致的區域（3 個堿基不配），因此質粒LBPp7和p256很可能屬于同一個質粒家族。

3 討 論

以往由于質?；蚪M遺傳變異率較高，加之完整基因組數量有限，基于基因組序列同源性進行分類是一件相當困難的事，因此，至今質粒的分類仍主要是以質粒編碼的功能基因或質粒之間的不相容性作為分類標準，但這兩種分類方法存在很大的局限性[10]。2000年以后隨著DNA測序技術的飛速發展，大量質?；蚪M數據快速增加，使基于基因組序列同源性進行質粒分類成為可能，并將在后基因組時代成為質粒系統進化分類學研究的熱點和前沿[10]。

本研究以質粒編碼Rep作為分類標記，并輔助參考質粒復制子序列特征，利用比較基因組學方法，對植物乳桿菌68 個完整測序質粒進行了分類研究。經序列比對和系統進化樹分析，植物乳桿菌53個編碼Rep質粒被劃分為6 個質粒類型，包括5個質粒家族和1個新復制類型質粒。Family 1、2和復合質粒pMRI5.2屬于小型（1～5 kb）RCR質粒，Family 3和質粒pG6302屬于中型（6～15 kb）theta型復制質粒，Family 4、5屬于大型（＞15 kb）theta型復制質粒家族。Family 3質粒LZ227p4（93.54 kb）遠遠超出了該家族其他質粒大小，但該質粒基因組中含有2 個11 kb完全相同的大片段序列，且具有眾多大小相同或相似的轉座酶基因，因此推測該質粒很可能是測序的一個拼接產物，而非天然質粒，其真實基因組可能較小。在Rep分類基礎上，提出了5 個質粒家族特異的骨干序列，為這些家族質粒的分類提供了更加準確和特異性的遺傳標記。因此上述研究結果表明，Rep是植物乳桿菌天然質粒系統分類學研究中一個理想的遺傳標記，基于Rep同源性可以建立一種簡單、有效的質粒分類方法，進而可以為植物乳桿菌天然質粒系統分類學研究提供分子水平的佐證和依據。利用該方法進行更廣泛宿主質粒的系統分類學研究，理論上本方法可適用于所有編碼Rep蛋白的天然質粒的分類，與質粒功能和不相容性分類方法比較，具有十分優越的實用性和通用性。

顯然對于非編碼Rep蛋白質粒，本研究建立的分類方法是無效的，但今后或許可以通過質粒上ori序列的深入研究加以解決。植物乳桿菌含有15 個無Rep質粒，除了質粒p256和LBPp7被證明采用一種不依賴Rep蛋白的theta型機制，其他13 個質粒的復制機制和分類地位仍是未知的。這13 個質粒的復制有2 種可能，一種可能是與質粒p256相似，其復制起始不依賴質粒編碼的Rep，而是完全依賴宿主提供的酶系進行，例如著名的ColE1家族質粒[28]；另一種可能是這些質粒依賴于同細胞中其他質粒編碼的Rep進行復制起始。然而，不論這些質粒屬于哪種復制類型，即不論Rep由質粒還是染色體編碼，質粒復制起始都需要其基因組中存在Rep-D NA作用位點，即ori，而這些ori通常具有特殊的序列和結構特征[29-30]，例如AT富集、重復序列、回文序列、二級莖環結構等。因此，這些質粒ori序列的鑒定和解析，以及這些ori序列是否可以作為非編碼Rep蛋白質粒分類的遺傳標記，都需要今后對這些質粒進行更加深入的研究。

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Classification of Natural Plasmids in Lactobacillus plantarum

SUN Daqing1, LI Hongfei1, SONG Dawei2, YANG Jian1,2
(1. National Coarse Cereals Engineering Research Center, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China; 2. College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China)

This study aimed to establish a classification method for natural plasmids of Lactobacillus plantarum (L. plantarum) by using plasmid replication initiation protein (Rep) as a taxonomic marker. Fifty three plasmids encoding Rep in L. plantarum were divided into six plasmid types by the method of phylogenetic analysis, including five plasmid families and one novel replication type of plasmid. Then, the backbone sequence specific to each plasmid family was further proposed. Finally, a simple and effective classification method and criterion for L. plantarum natural plasmids was established. Compared with the previous classification methods based on plasmid function and incompatibility, this method displayed relatively better practicability and versatility.

Lactobacillus plantarum; plasmid; genome; replication initiation protein; replicon

10.7506/spkx1002-6630-201712011

Q19

A

1002-6630（2017）12-0069-06

孫大慶, 李洪飛, 宋大巍, 等. 植物乳桿菌天然質粒分類[J]. 食品科學, 2017, 38(12)： 69-74.

10.7506/spkx1002-6630-201712011. http：//www.spkx.net.cn

SUN Daqing, LI Hongfei, SONG Dawei, et al. Classification of natural plasmids in Lactobacillus plantarum[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 69-74. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712011. http：//www.spkx.net.cn

2016-10-28

黑龍江省青年科學基金項目（QC2014C020）

孫大慶（1979—），男，副研究員，博士研究生，研究方向為食品微生物與生物技術。E-mail：sundaqing1979@163.com