甜葉菊毛狀根的誘導培養及茉莉酸甲酯對其綠原酸類物質積累的影響

鄒 凱，劉澤波，陳繼光，尹忠平*，上官新晨，許小向

（江西農業大學食品科學與工程學院，江西省天然產物與功能食品重點實驗室，江西 南昌 330045）

甜葉菊毛狀根的誘導培養及茉莉酸甲酯對其綠原酸類物質積累的影響

鄒 凱，劉澤波，陳繼光，尹忠平*，上官新晨，許小向

（江西農業大學食品科學與工程學院，江西省天然產物與功能食品重點實驗室，江西 南昌 330045）

以發根農桿菌ACCC10060誘導甜葉菊毛狀根，建立毛狀根培養生產綠原酸類物質體系，研究茉莉酸甲酯對綠原酸類化合物積累的影響。經發根農桿菌ACCC10060侵染的甜葉菊葉片外植體，共培養14 d后產生毛狀根。聚合酶鏈式反應檢測結果表明，發根農桿菌Ri質粒的rolB和rolC基因已成功整合到甜葉菊毛狀根基因組中。MS液體培養基較B5、WPM更利于甜葉菊毛狀根生長及綠原酸類物質的積累，培養35 d后，干質量增加約30 倍，綠原酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸、4,5-二咖啡酰奎寧酸最高含量分別為3.47、11. 47、3.04 mg/g。毛狀根在MS液體培養基中培養至第3周時分別添加15、45、100 μmol/L的茉莉酸甲酯進行誘導，處理后第1、2、4、8天收獲，毛狀根的生長量和綠原酸類物質含量均有提高，其中以45 μmol/L茉莉酸甲酯的促進作用最為顯著，3 種綠原酸類物質的總產量是對照組的2.68 倍（P＜0.01）。以上結果表明，甜葉菊毛狀根培養可用于綠原酸類物質的生產，經茉莉酸甲酯處理可顯著提高綠原酸類物質的產量。

甜葉菊；發根農桿菌；毛狀根；茉莉酸甲酯；綠原酸類化合物

甜葉菊（Stevia rebaudiana Bertoni）是一種多年生菊科草本植物[1]，其葉片中含有豐富的次生代謝產物。Karak? se等[2]以高效液相色譜-質譜儀鑒定出甜葉菊葉片中的24 種奎寧酸和莽草酸的衍生物，其中綠原酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸和4,5-二咖啡酰奎寧酸的含量分別為35.5、145.6、37.2 μg/g。研究發現綠原酸類物質具有多種功能活性，如抗氧化性[3]、增強肝糖原利用能力[4]、抑制HIV-1整合酶[5-6]、抑制致癌物質的突變型[7]等。

目前綠原酸類化合物主要是從杜仲[8]、金銀花[9]、咖啡豆[10]等天然植物中提取，需要大量的植物資源，成本較高，毛狀根培養生產次生代謝物有望解決此難題。研究表明，毛狀根培養有很多優點，如生化和遺傳性狀的穩定性高、對季節和地理環境的依賴性低、生長速率快、能高效地合成次生代謝物等[11]，因此具有很好的應用前景。但從目前的研究報道來看，毛狀根生產次生代謝產物還存在產量較低等問題，影響了其在實際生產中的應用，通過誘導子刺激提高產量是解決這一問題的較好途徑之一[12]。茉莉酸甲酯是目前研究較多的一種誘導子，其在植物次生代謝過程中起信號分子的作用，能有效地刺激植物次生代謝產物的合成，如萜類、黃酮類、生物堿類等[13]。研究表明，茉莉酸甲酯可促進野葛毛狀根內總異黃酮的積累，提高其含量和產量[14]。根據Yukimune等[13]研究報道，向培養基中添加100 μmol/L的茉莉酸甲酯能有效提高紫衫醇含量。王學勇等[15]研究了茉莉酸甲酯對丹參毛狀根中丹參酮類成分積累和釋放的影響，經茉莉酸甲酯處理后第2、6、9天隱丹參酮的含量分別達0.039、0.204、0.572 mg/g，分別是同時期未經茉莉酸甲酯處理的2.2、8.5、23.8 倍；丹參酮ⅡA的含量達0.251、0.601、1.563 mg/g，分別是未經茉莉酸甲酯處理的1.9、4.1、6.2 倍。本研究利用發根農桿菌ACCC10060誘導甜葉菊毛狀根，建立了毛狀根培養生產綠原酸類化合物體系，在此基礎上研究茉莉酸甲酯對綠原酸類化合物積累的影響，旨在為毛狀根培養生產植物次生代謝物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

甜葉菊種子：購于安徽宿州，品種為豐農3號。甜葉菊無菌苗的培養參考Fu Xiao等[16]的方法，培養后的無菌苗在MS培養基+1.0 mg/L吲哚丁酸（indole-3-butytric acid，IBA）培養基繼代培養，2 周后剪下甜葉菊葉片，用于誘導實驗。

MS、WPM、B5培養基 青島高科園海博生物技術有限公司；甲醇（色譜純） 美國Tieda試劑有限公司；綠原酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸、4,5-二咖啡酰奎寧酸（均為色譜純） 上海同田生物科技有限公司；茉莉酸甲酯美國Sigma公司；DNA Marker 北京全式金生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

電熱恒溫鼓風干燥箱 上海三發科學儀器有限公司；1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Agilent科技有限公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、水平電泳儀 美國Bio-Rad有限公司；電泳成像儀 美國UVP公司；臺式離心機 上海安亭儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 農桿菌的活化

挑取保存于－8 0 ℃甘油中的發根農桿菌ACCC10060，于酵母甘露醇培養基（yeast mannitol broth，YMB）上進行活化，2 d后挑選單菌落，轉接到YMB液體培養基，在27 ℃、115 r/min黑暗條件下進行培養，當生長到對數期時用于侵染甜葉菊葉片。

1.3.2 外植體的制備

取甜葉菊幼嫩葉片，剪成2.5～3.0 cm2左右，用無菌針頭在葉片上戳若干小孔，置于1/2 MS+100 μmol/L乙酰丁香酮的固體培養基中，（27±1）℃暗培養2 d后用于毛狀根誘導實驗。

1.3.3 毛狀根的誘導與除菌

毛狀根的誘導與除菌參考Fu Xiao等[16]的方法。將預培養的葉片浸入已重懸浮的發根農桿菌菌液中，115 r/min條件下暗培養25 min。然后將侵染的葉片用無菌濾紙吸干表面多余菌液，轉入1/2 MS+100 μmol/L乙酰丁香酮的固體培養基中，（27±1）℃、暗條件下共培養2 d，空白對照組用無菌水代替菌液。共培養結束后，將葉片轉接至1/2 MS+50 mg/mL頭孢噻肟鈉中進行一次除菌培養，7 d后轉至1/2 MS+50 mg/mL頭孢噻肟鈉培養基中進行第2次繼代除菌培養，以后每7 d除菌一次。

1.3.4 液體培養基的篩選

挑選生長旺盛、分枝較多的毛狀根根系，接種于無激素MS液體培養基，（27±1）℃、115 r/min黑暗條件下培養2 周，再分別稱取濕質量為0.3 g左右的毛狀根，接種到裝有50 mL的MS、B5、WPM液體培養基（蔗糖3%，pH 6.0）中，培養5 周后收獲，烘干，稱質量，并測定其綠原酸類物質含量。

1.3.5 毛狀根生長曲線的繪制

將培養10 d后的毛狀根，接入到裝有50 mL、pH 6.0的MS液體培養基中，每瓶接入毛狀根鮮質量為0.3 g，27 ℃、115 r/min暗培養，每7 d收獲一次，烘干，稱質量。以培養時間為橫坐標、干質量為縱坐標繪制生長曲線圖。

1.3.6 毛狀根rolB和rolC基因的PCR檢測

取在無激素培養基上快速生長的無菌毛狀根100 mg，按照TransGen EasyPure Plant Genomic DNA Kit的方法提取毛狀根基因組DNA，同時采用同樣的方法提取發根農桿菌基因組DNA，以非轉化根基因組作為對照組，進行rolB和rolC基因的PCR檢測。在進行PCR檢測時，采用周偉等[17]設計的引物，擴增rolB（423 bp）、rolC（626 bp）基因，引物序列如表1所示。

表1 rolB rolC基因PCR擴增引物序列Table1 Primer sequences of rolB and rolC for PCR amplification

PCR體系（15 μL）：1 μL DNA、7.5 μL 2×Easy Taq PCR SuperMix（Taq DNA polymerase、MgCl2、dNTP）、5.5 μL ddH2O、0.5 μL上游引物和0.5 μL下游引物。

PCR擴增條件[16]：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，進行35 個循環；72 ℃終延伸10 min。PCR產物在1.0%瓊脂糖（Gel View染色）上電泳30 min，電泳結束后在UVP凝膠成像儀上觀察結果。

1.3.7 茉莉酸甲酯誘導處理

毛狀根培養至第3周時，分別加入15、45、100 μmol/L的茉莉酸甲酯誘導子溶液，pH值調至6.0，繼續培養，分別在處理后的第1、2、4、8天后收獲，烘干并稱質量，同時測綠原酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸、4,5-二咖啡酰奎寧酸的含量。

1.3.8 毛狀根綠原酸類成分的提取

稱取0.2 g毛狀根干燥粉末，置于10 mL離心管中，加入4 mL 50%的甲醇溶液，30 ℃、180 W超聲輔助提取30 min，冷卻，5 000 r/min離心10 min，收集上清液。重復提取一次，合并2 次提取液，并定容至10 mL，待測。

1.3.9 綠原酸類化合物HPLC測定

檢測條件[16]：色譜柱：Waters Symmetry C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.2%醋酸水（A）和甲醇（B）；流速：1 mL/min；洗脫條件：0～10 min：70% A；10～15 min：70%～45% A；15～25 min：45% A；25～26 min：45～70% A；26～30 min：70% A；檢測波長：327 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL。

2 結果與分析

2.1 毛狀根的誘導與培養

圖1 甜葉菊毛狀根誘導、固體培養和液體培養過程照片Fig.1 Pictures showing hairy root induction, solid-state culture and liquidstate culture of Stevia rebaudiana Bertoni

經發根農桿菌ACCC10060侵染的甜葉菊葉片外植體共培養10 d左右，傷口周圍出現白色半透明的小突起，14 d左右陸續長出白色的誘導根，出根的部位多在外植體下端靠近葉柄及傷口處（圖1C）。待根長至3～5 cm時，將其剪下并轉至1/2 MS+250 mg/mL羧芐青霉素的固體培養基上，1 周后轉接到1/2 MS+50 mg/mL頭孢噻肟鈉固體培養基上繼續除菌培養，重復除菌5～6 次，除菌完全。無菌毛狀根在1/2 MS固體培養基上能快速生長，呈現出多分枝、無向地性等特點（圖1D）。以上這些特征與Fu Xiao等[16]研究報道一致，因此從形態學上可以初步判定經發根農桿菌ACCC10060誘導所獲得的根為毛狀根。挑選生長旺盛且帶有較多分枝的毛狀根單根，置于無激素的MS液體培養基中進行培養，其以初始部位為中心快速生長，25 d左右可以長滿整瓶（圖1E、F）。將所獲得的有代表性的無菌毛狀根置于MS液體培養基進行繼代培養，供后續實驗及毛狀根rolB和rolC基因鑒定用。

2.2 毛狀根rolB和rolC基因檢測結果

圖2 甜葉菊毛狀根rolB rolC基因PCR擴增產物的凝膠電泳分析圖Fig.2 Gel electrophoresis analysis of PCR amplified fragments of rolB and rolC genes from Stevia rebaudiana Bertoni hairy roots

研究表明，毛狀根的形成與發根農桿菌Ri質粒T-DNA上的rol家族基因有著密切關系[18]。現已證實，轉入rolB和rolC基因的植物能產生毛狀根如煙草、胡蘿卜等，這種毛狀根主要表現出生長快、分枝多和無向地性等特點[19-20]。因此，檢測rolB和rolC基因成為了毛狀根鑒定的主要方法。黃偉劍等[21]根據rolB基因序列設計引物，進行PCR擴增反應，從轉化的廣藿香毛狀根DNA中擴增出一條423 bp特異片段，表明發根農桿菌TL-DNA中的rolB已成功整合到廣藿香毛狀根中。本研究首先從外觀形態特征上對發根農桿菌ACCC10060所誘導出的根進行了甄別，選取生長快、分枝多和無向地性的根進行進一步鑒定，以未經農桿菌感染的正常甜葉菊無菌苗的根為陰性對照，檢測了其基因組中的rolB和rolC基因，結果表明（圖2），所誘導的根基因組中均擴增出423 bp和626 bp的特異性目標片段，且該片段與從發根農桿菌ACCC10060 Ri質粒中所擴增出的基因片段相同，而未轉化的正常根中未能擴增出目標片段。因此，可以據此鑒定本實驗以發根農桿菌ACCC10060所誘導出的根為毛狀根。

2.3 毛狀根綠原酸類成分檢測結果

圖3 毛狀根綠原酸類化合物HPLC圖Fig.3 HPLC chromatograms of chlorogenic acids of hairy roots

收集甜葉菊毛狀根，以超聲輔助提取法提取其中的綠原酸類成分，參考Fu Xiao等[16]的HPLC法測定提取物中3 種綠原酸類單體成分的含量。從圖3可知，綠原酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸和4,5-二咖啡酰奎寧酸3 個標準品的保留時間分別為6.497、17.547、19.190 min（圖3A），所測毛狀根樣品中同時檢測出了以上3 種成分，且這3 種組分有很好的分離度（圖3B）。本研究基于此HPLC法，建立了3 種綠原酸成分的檢測標準曲線，結果如表2所示。

表2 綠原酸類化合物標準曲線Table2 Standard curve of chlorogenic acids

2.4 培養基優選

圖4 毛狀根在B5、MS和WPM3 種培養基中培養至第5周后的生物量（A）及綠原酸類化合物含量（B）BFig.4 Biomass and contents of chlorogenic acids of hairy roots cultured in B5, MS and WPM culture medium for5 weeks

培養基是毛狀根生長及代謝產物積累的重要影響因素。在毛狀根培養過程中，發現毛狀根在WPM、B5和MS3 種液體培養基里的生長特性和生物量積累有明顯的差別。檢測結果表明（圖4），培養基種類對毛狀根生物量的積累影響非常大，在第5周收獲時MS培養基中的生物量積累最高，干質量增加倍數約為30 倍，顯著高于B5和WPM培養基；綠原酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸、4,5-二咖啡酰奎寧酸產量均在MS培養中最高，分別高達3.47、11.47、3.04 mg/g。因此，MS培養基有利于毛狀根的生長與綠原酸類化合物的積累，選取MS培養基進行后續實驗。研究結果與王麗等[22]報道MS液體培養基更利于龍葵毛狀根生長一致。MS與B5培養基無機氮源的含量較高，但兩者所培養的毛狀根的生物量相差很大，說明甜葉菊毛狀根的生長可能與無機氮源關系不太大，主要可能是受其中有機氮源的影響，王沖之等[23]有類似的研究報道。

2.5 毛狀根生長曲線的建立

圖5 甜葉菊毛狀根生長曲線Fig.5 Growth curve of Stevia rebaudiana Bertoni hairy roots

由圖5可知，在MS液體培養基中毛狀根生長曲線總體上呈“S”型，第1周為毛狀根生長延滯期，可能是毛狀根在適應新的生長環境，表現出生長遲滯的現象；2～4 周為指數生長期，此期間毛狀根快速生長；至第4周末生長達到最高峰，這時干質量可達0.66 g/50 mL；在生長周期的第5周，由于培養基中的營養物質基本上被消耗掉了，毛狀根由初期的乳白色變逐漸變為黃褐色，呈現老化狀態（圖1G），干質量呈現下降的趨勢。由以上分析可知，生長周期的第3周左右為毛狀根繼代的最佳時期，也可能是添加誘導子最佳添加的最好時間，而第4周則是收獲毛狀根的最佳時間。

2.6 外源添加茉莉酸甲酯對毛狀根生長的影響

圖6 茉莉酸甲酯對毛狀根生長的影響Fig.6 Effect of methyl jasmonate on the growth of hairy roots

當毛狀根培養到第3周時，添加3 種濃度的茉莉酸甲酯誘導，分別處理1、2、4、8 d后稱其干質量，結果如圖6所示。與對照組相比，添加3 種濃度的茉莉酸甲酯誘導1、2、4、8 d后都提高毛狀根的生物量，其中添加15 μmol/L茉莉酸甲酯誘導第8天后，干質量增值倍數最大，生物量高達0.533 g/50 mL，為對照的1.20 倍（P＜0.05），這表明茉莉酸甲酯對毛狀根生長存在一定程度的促進作用。此外，茉莉酸甲酯處理的毛狀根在后期培養中褐化現象比對照組更明顯，可能是因為茉莉酸甲酯引起了毛狀根的過敏反應，進而促進了酚酸類物質的釋放。

2.7 茉莉酸甲酯對毛狀根綠原酸類成分積累的影響

圖7 茉莉酸甲酯對毛狀根綠原酸類成分的影響Fig.7 Effect of methyl jasmonate on the production of chlorogenic acids by hairy roots

由圖7可知，添加3 種濃度的茉莉酸甲酯誘導第1、2天，綠原酸類化合物積累量增加不明顯。當誘導到第4天時，綠原酸類化合物積累量開始增加，至第8天時綠原酸類化合物積累量顯著性提高。當茉莉酸甲酯誘導濃度為45 μmol/L時，綠原酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸、4,5-二咖啡酰奎寧酸以及總產量分別為5.85、23.45、4.28 mg/g和27.71 mg/50 mL，總產量是對照組的2.68 倍（P＜0.01）。以上結果表明，外源添加茉莉酸甲酯對毛狀根進行誘導，激發了植物細胞的信號響應機制，促進了毛狀根更快地積累次生代謝物。

3 討 論

發根農桿菌是一種土壤農桿菌，可以侵染雙子葉植物，誘發產生毛狀根。目前對于毛狀根的研究主要集中在植株再生與新品種培育方面，如紫高杯花和長壽花等[23]。在利用毛狀根生產植物中次生代謝產物方面，目前已有不少研究報道，如利用鼠尾草[24]、丁香羅勒[25]、藿香[26]等毛狀根生產酚酸類成分。

從已有的文獻報道來看，發根農桿菌誘導植物產生毛狀根，主要機制可能有2 個：一是葉片產生傷口后48 h會形成并且釋放乙烯丁香酮等酚類物質，該類化合物可能是誘導發根農桿菌識別的信號分子；二是葉片傷口處的細胞正處于生長活躍期，會形成大量的新細胞，使得外植體更容易侵染成功，從而產生毛狀根[27]。本實驗室已利用發根農桿菌C58C1成功從甜葉菊葉片中誘導出毛狀根，并在毛狀根中檢測出含量較高的綠原酸類化合物。在此基礎上，利用發根農桿菌ACCC10060從預培養48 h的甜葉菊葉片外植體中誘導出毛狀根，這種毛狀根易于在MS液體培養基中生長，培養3 周后可積累較多的綠原酸類物質，綠原酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸、4,5-二咖啡酰奎寧酸含量分別為1.58、3.73、0.39 mg/g。對培養基成分進行比較分析發現，MS培養基中NO3－、NH4+、NaH2PO4、CaCl2使用量較WPM、B5高，其中NaH2PO4的使用量均比B5、WPM高出4 倍，CaCl2的使用量比B5高出2 倍。此外，MS中KI（0.83 mg/L）的使用量也高于B5、WPM，但VB1（0.5 mg/L）的使用量均比WPM、B5少1 倍；3 種培養基的鐵鹽均采用EDTA類化合物和Fe2SO4。通過以上分析，猜測NH4NO3、KNO3、NaH2PO4、CaCl2、VB1可能是影響甜葉菊毛狀根生長及次生代謝物積累的主要因素，但這些化合物對毛狀根培養具體有何作用及作用的機理還有待進一步研究。

本研究建立了甜葉菊毛狀根的培養體系，優化了其液體培養條件，并通過采用在液體培養體系中添加一定濃度的外源誘導子方法來提高次級代謝物的產量。實驗結果表明，茉莉酸甲酯誘導能大幅度提高綠原酸類物質的產量，其主要原因可能有2 個方面：一是茉莉酸甲酯的加入提高了細胞活力，導致了生物量上升；另一方面，茉莉酸甲酯的加入可提高綠原酸類物質合成代謝途徑中某些酶的活力，從而使綠原酸類物質的合成速率提高，進而提高了產量，但加入茉莉酸甲酯對綠原酸類物質代謝途徑中關鍵酶的影響還需進一步深入研究。

添加誘導子是提高次級代謝產物含量的一種有效途徑，能專一、選擇性地誘導植物合成特定信號分子，產生防御反應并促進次生代謝產物的積累[12]。目前，常用的誘導子有水楊酸、茉莉酸甲酯、寡聚糖、稀土元素以及重金屬等，其中茉莉酸甲酯是近年來研究的熱點，它作為一類信號物質，被辨認并結合細胞膜上特定的受體，刺激細胞內產生特定細胞內信息分子，在毛狀根培養中可使次生代謝相關基因激活，最終提高次生代謝物的產量[28]。誘導子在誘導植物次生代謝產物的合成過程中，其濃度效應有2 種，一種是反應飽和型，即次生產物的合成隨誘導子濃度增加而增加，達到最大值后穩定；另一種是最適濃度型，即誘導反應要求最適濃度下誘導子表現出最強的活性[29]。本實驗中茉莉酸甲酯濃度效應屬于后者，在毛狀根培養過程中添加茉莉酸甲酯，當濃度為45 μmol/L時，誘導效果最佳。

關于茉莉酸甲酯信號分子轉導作用機理，目前一些相關研究報道認為，當植物處于逆境時，會自發啟動相應的防御機制來抵御外來環境對自身生長的影響。首先通過細胞膜上的受體感知外界的刺激,然后通過信號轉導系統,激活相應的基因,最后誘發合成次生代謝物[30]。研究發現,植物體通過積累特定次生代謝物來抵抗外界不良環境的傷害，而植物體的這種從感知到發生相應生理生化反應的過程被認為是信號轉導系統，在信號轉導途徑中,當遇到誘導子時，首先會被植物體細胞膜上特定的受體感知,經信號轉換,轉變成胞內信號,形成的胞內信號再與其特定的受體結合,活化其下游的通路,最后會引發相應酶活性的變化,最終做出相應的生理生化反應[30]。在這個途徑中,胞內信號通常包含有鈣離子、超氧陰離子、腺苷酸環化酶[30]，以及活性氧迸發的產物（H2O2和O2－?）[30-31]。文獻表明當植物體遇到外源誘導子處理時,通常會誘發氧迸發，植物發生氧迸發反應后,會在其體內迅速積累較多的活性氧（如H2O2和O2－?）物質，而這些物質在植物體誘發合成次生代謝物過程中發揮著重要的信號分子作用，在活性氧大量產生的同時也會提高一些氧化酶活性,而這些具有活性的氧化酶又可以清除過多的活性氧物質,從而保護植物體免受過多活性氧的毒害,以此達到保護植物體[30]。在活性氧迸發的產物中由于O2－?的半衰期特別短，對此，大多數學者認為H2O2是次生代謝途徑中不可忽視的信號分子[30]，但H2O2在甜葉菊毛狀根的次生代謝途徑中是否同樣發揮著信號分子的作用以及H2O2與茉莉酸甲酯信號分子在代謝途徑中的具體作用都有待于進一步考察與研究。

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Induction and Culture of Stevia rebaudiana Bertoni Hairy Roots and Effect of Methyl Jasmonate on the Accumulation of Chlorogenic Acids

ZOU Kai, LIU Zebo, CHEN Jiguang, YIN Zhongping*, SHANGGUAN Xinchen, XU Xiaoxiang
(Jiangxi Key Laboratory of Natural Products and Functional Food, College of Food Science and Technology, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

In the present study, hairy roots of Stevia rebaudiana were induced by Agrobacterium rhizogenes ACCC10060, and then cultured to produce chlorogenic acids. Furthermore, the effect of methyl jasmonate on the synthesis of chlorogenic acids was also investigated. Leaf explants of Stevia rebaudiana were infected with Agrobacterium rhizogenes ACCC10060, and then co-cultured for inducing hairy roots. After14 days, hairy roots grew out. The PCR analysis results indicated that the rolB and rolC genes of Ri plasmid in Agrobacterium rhizogenes were successfully transferred into the hairy root genome, which confirmed that the tested induced roots were hairy roots. Compared with B5 and WPM liquid medium, MS was more suitable for hairy root growth and the accumulation of chlorogenic acids. After 35-day culture, the dry weight of hairy roots increased about 30 times, and the maximum contents of chlorogenic acid, 3,5-dicaffeylquinic acid, and 4,5-dicaffeylquinic acid were 3.47, 11.47 and 3.04 mg/g, respectively. Methyl jasmonate solutions at 15, 45 and 100 μmol/L were added into the medium, respectively as an inducer for higher production of chlorogenic acids after three weeks of culture. Both biomass and chlorogenic acid content were increased when the hairy roots were treated with methyl jasmonate for 1, 2,4 and8 days respectively. The optimal concentration of methyl jasmonate was 45 μmol/L for chlorogenic acid production. The total yield of chlorogenic acids was increased to 2.68 folds as compared to that of the control group (P ＜ 0.01). These results suggested that Stevia rebaudiana hairy roots could be used to produce chlorogenic acids and that methyl jasmonate treatment could significantly increase chlorogenic acid production.

Stevia rebaudiana; Agrobacterium rhizogenes; hairy root; methyl jasmonate; chlorogenic acids

10.7506/spkx1002-6630-201712014

?圖分類號：Q943.4

A

1002-6630（2017）12-0089-07

2016-09-28

江西省食品藥品監督管理局科技計劃項目（2015yp17）；江西省科技支撐計劃項目（2010BNB00503）；國家自然科學基金地區科學基金項目（31260368）

鄒凱（1990—），男，碩士研究生，研究方向為天然產物與功能食品。E-mail：455016597@qq.com

*通信作者：尹忠平（1971—），男，副教授，博士，研究方向為天然產物與功能食品。E-mail：364207482@qq.com

鄒凱, 劉澤波, 陳繼光, 等. 甜葉菊毛狀根的誘導培養及茉莉酸甲酯對其綠原酸類物質積累的影響[J]. 食品科學, 2017, 38(12)： 89-95.

10.7506/spkx1002-6630-201712014. http：//www.spkx.net.cn

ZOU Kai, LIU Zebo, CHEN Jiguang, et al. Induction and culture of Stevia rebaudiana Bertoni hairy roots and effect of methyl jasmonate on the accumulation of chlorogenic acids[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 89-95. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712014. http：//www.spkx.net.cn