大豆發(fā)芽富集γ-氨基丁酸的培養(yǎng)液組分優(yōu)化及鹽脅迫下的富集機(jī)理

曾 晴，謝 菲，尹京苑，高海燕,*

（1.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海市能源作物育種及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200444；2.上海大學(xué)計(jì)算機(jī)工程與科學(xué)學(xué)院，上海 200444）

大豆發(fā)芽富集γ-氨基丁酸的培養(yǎng)液組分優(yōu)化及鹽脅迫下的富集機(jī)理

曾 晴1，謝 菲1，尹京苑2，高海燕1,*

（1.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海市能源作物育種及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200444；2.上海大學(xué)計(jì)算機(jī)工程與科學(xué)學(xué)院，上海 200444）

以東北大豆為原料，研究培養(yǎng)液組分對(duì)大豆發(fā)芽富集γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的影響，利用響應(yīng)面法優(yōu)化了大豆發(fā)芽富集GABA的培養(yǎng)液組分，在此基礎(chǔ)上對(duì)低鹽脅迫下大豆發(fā)芽富集GABA的機(jī)理進(jìn)行研究。結(jié)果表明：優(yōu)化后有效的培養(yǎng)液組分為谷氨酸鈉1.0 mg/mL、磷酸吡哆醛2.0 mmol/L、CaCl22.0 mmol/L、NaCl 100 mmol/L，在此條件下，富集得到的發(fā)芽大豆中GABA含量較高，為（269.93±4.73）mg/100 g，比大豆發(fā)芽前提高了約10 倍；鹽脅迫下，發(fā)芽大豆谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）活性和GABA含量隨NaCl濃度加大和脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而提高，同時(shí)大豆發(fā)芽期間GABA含量與其他指標(biāo)之間相關(guān)性分析表明，鹽脅迫下發(fā)芽大豆GABA含量與芽長(zhǎng)、GAD活性、游離氨基酸和可溶性蛋白含量之間呈顯著正相關(guān)，在低鹽脅迫下，大豆發(fā)芽受到抑制，但促進(jìn)了GAD活性的升高，游離氨基酸和可溶性蛋白質(zhì)含量增加，富集產(chǎn)生了較多的GABA。

γ-氨基丁酸；響應(yīng)面優(yōu)化；鹽脅迫；富集工藝

大豆?fàn)I養(yǎng)豐富，除了富含優(yōu)質(zhì)蛋白外，還含有人體必需的多種維生素和礦物質(zhì)以及不飽和脂肪酸、大豆異黃酮、大豆多肽、大豆卵磷脂、大豆低聚糖等功能性成分[1-3]。眾多研究表明，種子萌發(fā)過(guò)程中生理代謝旺盛[4-6]，此時(shí)種子中的酶不斷形成或被活化，細(xì)胞生理活動(dòng)加強(qiáng)，一些大分子物質(zhì)如淀粉和蛋白質(zhì)被分解。種子發(fā)芽后，可降低或消除豆類中有毒、有害或抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)含量，并且提高營(yíng)養(yǎng)成分和蛋白質(zhì)的消化率以及某些限制性氨基酸和維生素等物質(zhì)含量[7-9]，尤其可富集對(duì)人體有生理調(diào)節(jié)功能的γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）等物質(zhì)[10-11]。

GABA是一種四碳非蛋白質(zhì)氨基酸，具有降血壓、改善腦功能、抗癲癇和抗衰老等多種功效[12]。然而欲利用動(dòng)植物中的GABA加工為功能產(chǎn)品，則需要對(duì)生物體中的GABA含量富集提高。植物正常生長(zhǎng)條件下體內(nèi)GABA產(chǎn)量很低，通常在0.3～32.5 μmol/g之間[13]，但受到鹽脅迫[14-16]、熱激[17]、機(jī)械損傷[18]、低氧[19-20]等逆境脅迫或植物激素作用時(shí)會(huì)提高數(shù)倍甚至數(shù)十倍。

大豆發(fā)芽時(shí)GABA的富集量除受發(fā)芽條件影響外，還受培養(yǎng)液組分的影響。培養(yǎng)液組分中，L-谷氨酸是谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）的唯一底物，可以促進(jìn)GAD的活性，從而富集GABA[21]。由于谷氨酸鈉（monosodium glutamate，MSG）價(jià)格比較便宜，大豆發(fā)芽培養(yǎng)時(shí)一般都采用MSG；磷酸吡哆醛（pyridoxal-5-phosphate，PLP）是GAD的輔酶，有促進(jìn)GAD活性的作用；植物來(lái)源的GAD是一種鈣調(diào)素（CaM）結(jié)合蛋白，其活性受Ca2+/CaM控制，研究表明[22-24]，CaM與GAD結(jié)合可以調(diào)節(jié)GAD的活性，從而控制谷氨酸和GABA的代謝，這是植物的正常生長(zhǎng)需要；有報(bào)道表明，NaCl的影響與抗逆機(jī)制有關(guān)，植物在鹽逆境下會(huì)促進(jìn)GABA的產(chǎn)生[25]。

毛健[7]、郭元新[22]等研究了發(fā)芽條件對(duì)大豆發(fā)芽富集GABA的影響，但培養(yǎng)液組分對(duì)大豆發(fā)芽富集GABA效果的影響目前鮮有報(bào)道。本研究以東北大豆為原料，以MSG、Ca2+、PLP和NaCl添加量為考察對(duì)象，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。在此條件下，對(duì)低鹽脅迫下大豆發(fā)芽富集GABA的機(jī)理進(jìn)行了初步研究，以期為開(kāi)發(fā)富含GABA的芽類食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆（云鶴YH-NJ，產(chǎn)自中國(guó)東北吉林省） 沃爾瑪超市；GABA標(biāo)準(zhǔn)品、甲醇（均為色譜純）、鄰苯二甲醛（o-phthaldialdehyde，OPA）（生化試劑） 美國(guó)Sigma公司；其他化學(xué)試劑均為分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；DHG-970電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；1100 Series高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司；MDFU32v超低溫冰箱 松下電器公司。

1.3 方法

1.3.1 浸泡工藝

用自來(lái)水沖洗大豆，除去雜質(zhì)和懸浮的癟粒，用體積分?jǐn)?shù)1%的次氯酸鈉浸泡消毒5 min，再用去離子水清洗大豆3 遍。稱取200 g大豆移入大燒杯，添加3 倍體積的培養(yǎng)液，25 ℃水浴12 h。

1.3.2 發(fā)芽工藝

將浸泡后的大豆取出，瀝干種子表面水分，分裝平鋪于墊有兩層濾紙的培養(yǎng)皿上，轉(zhuǎn)入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱發(fā)芽51 h，大豆發(fā)芽期間，用去離子水噴灑，保持濕潤(rùn)。

1.3.3 培養(yǎng)液組分對(duì)大豆發(fā)芽GABA富集的影響

1.3.3.1 單因素試驗(yàn)

不同培養(yǎng)液配制如下：MSG質(zhì)量濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL，PLP濃度為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L，CaCl2濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L，NaCl濃度為5、50、100、150、200、250 mmol/L。所有溶液都是由磷酸緩沖液配制而成，調(diào)節(jié)pH 5.5，每個(gè)處理按1.3.1節(jié)工藝浸泡、1.3.2節(jié)工藝發(fā)芽，取樣用液氮速凍處理后，貯藏在－40 ℃冰箱中，備用測(cè)定GABA含量，每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.3.3.2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用軟件JMP，選擇Box-Behnken設(shè)計(jì)評(píng)價(jià)各因素之間的交互作用對(duì)大豆發(fā)芽富集GABA含量的影響，因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素與水平Table1 Actual and coded values for variables used in Box-Behnken design

1.3.4 鹽脅迫下大豆發(fā)芽富集GABA機(jī)理

將用最優(yōu)組分培養(yǎng)液浸泡后的大豆進(jìn)行下列處理：1）用濃度分別為100 mmol/L的NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、FeCl3、AlCl3溶液在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)大豆48 h，測(cè)定GABA含量，以去離子水培養(yǎng)的發(fā)芽大豆作對(duì)照；2）用0、50、100、150、200 mmol/L NaCl溶液在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)大豆48 h，研究不同NaCl濃度脅迫對(duì)GABA含量的影響；3）用100 mmol/L NaCl在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)大豆60 h，每隔12 h取樣一次，研究鹽脅迫下大豆富集GABA含量的變化、生長(zhǎng)情況、GAD活性，以去離子水培養(yǎng)的發(fā)芽大豆作對(duì)照。所有處理的樣品取出后，鮮樣用于直接測(cè)定芽長(zhǎng)，對(duì)于游離氨基酸、可溶性蛋白、GAD及GABA含量等指標(biāo)的測(cè)定，樣品用去離子水清洗，吸水紙吸干表面水分后，迅速用液氮速凍，然后貯藏于－40 ℃冰箱中備用待測(cè)，每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.3.5 GABA含量測(cè)定

1.3.5.1 樣品處理

將樣品用中藥粉碎機(jī)粉碎后過(guò)60 目篩，準(zhǔn)確稱取3 g，置入100 mL容量瓶中，加適量60%乙醇溶液，55 ℃恒溫水浴中提取6 h，其間每隔30 min搖勻樣品30 s。冷卻至室溫后定容至100 mL，取20 mL提取液置入50 mL離心管中，10 000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，備用。

1.3.5.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取適量GABA標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水稀釋配成0.1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液待用。

1.3.5.3 衍生化處理

稱取0.5 g OPA，加10 mL甲醇溶解后，加入1 mL 0.4 mol/L的硼酸鹽緩沖液（pH 9.6）和400 μL 2-巰基乙醇，此衍生劑溶液可保持2 d。取樣品或標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，加入上述溶液100 μL，混勻進(jìn)樣。

1.3.5.4 色譜條件[27]

Waters色譜柱C18反相柱（3.9 mm×150 mm，4 μm）；流動(dòng)相A：醋酸鈉20 mmol/L，pH 5.86；流動(dòng)相B：甲醇100%；A-B體積比72∶28；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。檢測(cè)波長(zhǎng)338 nm；柱溫40 ℃。

1.3.6 芽長(zhǎng)的測(cè)定

隨機(jī)選取20 粒大豆，將大豆置于平面，用游標(biāo)卡尺測(cè)量芽長(zhǎng)，計(jì)算平均值。

1.3.7 游離氨基酸含量的測(cè)定

采用水合茚三酮顯色法[28]。

1.3.8 可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[29]。

1.3.9 GAD活性測(cè)定

將處理完成的大豆置于濾紙上吸干水分，用鑷子剝?nèi)シN皮，用研缽研磨后分別稱兩份，每份1 g，一份加入10 mL磷酸緩沖液（內(nèi)含l%谷氨酸，pH 5.5），另一份加入10 mL磷酸緩沖液（pH 5.5）做空白，兩份樣品在40 ℃水浴振蕩2 h后，迅速放入沸水浴中煮沸5 min滅酶活，離心取上清液，再加入8%三氯乙酸溶液10 000 r/min離心10 min，取上清液按照1.3.5節(jié)方法測(cè)定GABA含量。以每克GAD每30 min生成1 μmol的GABA作為一個(gè)酶活力單位（U/g）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 MSG質(zhì)量濃度對(duì)大豆發(fā)芽富集GABA含量的影響

圖1 MSG質(zhì)量濃度對(duì)GABA含量的影響Fig.1 Effect of MSG concentration on the GABA content

從圖1可以看出，MSG質(zhì)量濃度在0.5～3.0 mg/mL范圍內(nèi)，大豆發(fā)芽GABA富集量隨MSG質(zhì)量濃度的變化呈先升后降的趨勢(shì)。達(dá)到1.0 mg/mL時(shí)，GABA含量達(dá)到最大值，之后開(kāi)始下降，可能是此時(shí)底物與酶達(dá)到一個(gè)最適比例。這表明大豆發(fā)芽富集GABA時(shí)，MSG的最佳質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL。

2.1.2 PLP濃度對(duì)大豆發(fā)芽富集GABA含量的影響

圖2 PLP濃度對(duì)GABA含量的影響Fig.2 Effect of PLP concentration on the GABA content

從圖2可以看出，PLP濃度在0.5～3.0 mmol/L范圍內(nèi)，大豆發(fā)芽GABA富集量隨PLP濃度的升高呈先升后降的趨勢(shì)，可能是由于PLP顯著促進(jìn)了GAD活性，提高了大豆中GABA的含量。這表明大豆發(fā)芽富集GABA時(shí)，PLP的最佳濃度為2.00 mmol/L。

2.1.3 CaCl2濃度對(duì)大豆發(fā)芽富集GABA含量的影響

從圖3可以看出，CaCl2濃度在0.5～3.0 mmol/L范圍內(nèi)，大豆發(fā)芽GABA富集量隨CaCl2濃度的升高呈先升后降的趨勢(shì)。CaCl2濃度為2.0 mmol/L時(shí)大豆中GABA富集量最高。這表明大豆發(fā)芽富集GABA時(shí)，CaCl2的最佳濃度為2.0 mmol/L，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[30]。

圖3 CaC12濃度對(duì)GABA含量的影響Fig.3 Effect of CaCl2concentration on the GABA content

2.1.4 NaCl濃度對(duì)大豆發(fā)芽富集GABA含量的影響

圖4 NaCl濃度對(duì)GABA含量的影響Fig.4 Effect of NaCl concentration on the GABA content

從圖4可以看出，NaCl濃度在5～250 mmol/L范圍內(nèi)，大豆發(fā)芽GABA富集量呈先升后降的趨勢(shì)。可能是NaCl在一定濃度范圍內(nèi)造成植物處于鹽脅迫逆境，而植物在逆境情況下會(huì)促進(jìn)GABA的生成。NaCl添加量100 mmol/L，GABA富集量達(dá)到最大。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

使用JMP軟件進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Box-Behnken design with experimental and predicted GABA contents

續(xù)表2

2.2.2 方差分析

利用JMP軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸統(tǒng)計(jì)分析，回歸系數(shù)及其顯著性檢驗(yàn)見(jiàn)表3。

表3 回歸系數(shù)及其顯著性檢驗(yàn)Table3 Significance test of each of the regression coefficient for the quadraticTable3 Significance test of ea model odel

從表3可以看出，X2、X4、X1X2、X2X3、X2X4、X3X4、X12、X22、X32、X42對(duì)GABA富集量都有顯著影響（P＜0.05），四因素對(duì)GABA含量影響大小順序?yàn)閄4＞X2＞X1＞X3，即NaCl濃度＞CaCl2濃度＞MSG質(zhì)量濃度＞PLP濃度。根據(jù)試驗(yàn)分析結(jié)果得到各因素效應(yīng)系數(shù)，建立GABA含量與3 個(gè)變量之間關(guān)系的多元二次方程：

Y=271.88－8.07X1+9.044 650X2+4.887 871 6X3－10.438 27X4+19.870 014X1X2+11.152 951X1X3+ 36.355 053X1X4－5.914 092X2X3+14.562 692X2X4－15.299 17X3X4－73.217 66X12－38.350 91X22－45.371 81X3

2－76.176 76X42該回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2為96%，說(shuō)明該模型方程能夠較好地用于大豆發(fā)芽富集GABA培養(yǎng)條件的預(yù)測(cè)。從表4回歸方差分析可以看出，模型的回歸效果顯著，說(shuō)明該模型能夠較好地模擬試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

表4 回歸方程的方差分析Table4 Analysis of variance for the quadratic model

2.2.3 響應(yīng)面分析

圖5 不同培養(yǎng)液組分對(duì)GABA含量影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the effects of various medium components on the GABA content

圖5是根據(jù)多元回歸方程繪制出的響應(yīng)面及其等高線圖，可以看出當(dāng)4 個(gè)變量中的兩個(gè)因素水平固定的條件下，其他兩個(gè)因素共同作用對(duì)GABA含量影響呈曲面效應(yīng)，變化趨勢(shì)都是先增大后減小，且響應(yīng)面均存在一個(gè)極大值點(diǎn)。等高線呈圓形說(shuō)明兩因素之間交互作用不顯著，呈橢圓形則表明作用顯著。從圖5a、d、e、f可以看出，等高線呈橢圓形，表明圖中的兩因素交互作用顯著。從圖5b、圖5c等高線圖可以看出，等高線較圓，表明圖中兩因素交互作用不顯著，即MSG質(zhì)量濃度和PLP濃度、MSG質(zhì)量濃度和NaCl濃度的交互作用對(duì)GABA含量影響不顯著，與顯著性分析結(jié)論一致。

2.2.4 最優(yōu)條件驗(yàn)證

得到優(yōu)化的培養(yǎng)條件為MSG質(zhì)量濃度0.98 mg/mL、PLP濃度2.08 mmol/L、CaCl2濃度2.06 mmol/L、NaCl濃度96.78 mmol/L，在此培養(yǎng)條件下，GABA含量為（273.34±4.17）mg/100 g。為了實(shí)際操作方便將最佳工藝參數(shù)整理為MSG質(zhì)量濃度l.0 mg/mL、PLP濃度2.0 mmol/L，CaCl2濃度2.0 mmol/L、NaCl濃度100 mmol/L。在最佳工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3 次，平均值為（269.93±4.73）mg/100 g，與預(yù)測(cè)值的誤差為1.24%，兩者吻合較好，證明模型可行。

2.3 低鹽脅迫下大豆發(fā)芽富集GABA機(jī)理

2.3.1 鹽種類對(duì)于大豆發(fā)芽富集GABA的影響

圖6 鹽種類對(duì)GABA含量的影響Fig.6 Effect of salt species on the GABA content

由圖6可知，實(shí)驗(yàn)中大豆發(fā)芽在所考察的不同種類鹽的脅迫下均比空白對(duì)照的GABA含量要高。鹽的種類不同，在相同濃度條件下，大豆發(fā)芽富集GABA的含量不同，NaCl脅迫下GABA含量最高，差異性顯著（P＜0.05），且NaCl為食用鹽，因此在后面的鹽脅迫實(shí)驗(yàn)研究中均采用NaCl進(jìn)行處理。

2.3.2 NaCl濃度對(duì)于大豆發(fā)芽富集GABA的影響

圖7 NaCl的濃度對(duì)GABA含量的影響Fig.7 Effect of NaCl concentration on the GABA content

NaCl脅迫處理顯著的提高了發(fā)芽大豆中GABA含量，發(fā)芽大豆中GABA含量隨NaCl濃度的增加呈先升高后降低趨勢(shì)，在100 mmol/L NaCl處理下發(fā)芽大豆GABA富集量最高，且差異性顯著（P＜0.05），是對(duì)照組的1.48 倍。

2.3.3 NaCl脅迫對(duì)于大豆發(fā)芽過(guò)程中理化指標(biāo)的影響

由圖8a可知，大豆在100 mmol/L NaCl脅迫下，芽生長(zhǎng)速率顯著低于對(duì)照，培養(yǎng)60 h時(shí)，大豆芽長(zhǎng)僅為對(duì)照的75%。方差分析表明，處理組芽長(zhǎng)顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），即NaCl脅迫抑制了發(fā)芽大豆的生長(zhǎng)。

由圖8b可知，隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)芽大豆中可溶性蛋白含量都在升高，處理組中可溶性蛋白含量始終顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），且可溶性蛋白增長(zhǎng)速率也高于對(duì)照組。48 h后，處理組可溶性蛋白含量開(kāi)始下降。

由圖8c可知，鹽脅迫處理下發(fā)芽大豆60 h內(nèi)游離氨基酸含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，處理組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。在48 h時(shí)，處理組游離氨基酸含量達(dá)到最大值22.24 mg/g，這對(duì)于人體必需氨基酸的攝入和快速補(bǔ)充具有重要意義。據(jù)報(bào)道，鹽脅迫下氨基酸的積累不僅僅是由于蛋白質(zhì)水解的加劇，其自身合成能力的增強(qiáng)和蛋白質(zhì)合成能力下降可能是氨基酸含量上升的主要原因[30-31]。

由圖8d可知，在NaCl脅迫條件下，隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)，GAD活性逐步增高，且處理組與對(duì)照組具有顯著差異（P＜0.05）。在48 h時(shí)，處理組達(dá)到最大值1.43 U/g，是對(duì)照組的1.35 倍。發(fā)芽48 h后，發(fā)芽大豆中GAD活性有下降的趨勢(shì)。

圖8 NaCl脅迫下發(fā)芽大豆生理生化指標(biāo)的變化Fig.8 Changes in physiological indexes of soybean during germination under NaCl stress

2.3.4 鹽脅迫對(duì)于大豆發(fā)芽過(guò)程中GABA含量的影響

圖9 NaCl脅迫下發(fā)芽大豆中GABA含量的變化Fig.9 Changes in GABA content of soybean during germination under NaCl stress

由圖9可知，鹽脅迫下發(fā)芽大豆中GABA含量呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，且處理組含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。鹽脅迫處理48 h時(shí)，GABA含量達(dá)到最大值244.40 mg/100 g，是脅迫前的1.14 倍。48 h后，GABA含量開(kāi)始下降。

2.3.5 鹽脅迫下大豆發(fā)芽生理活性和GABA等物質(zhì)含量的相關(guān)性分析

表5 鹽脅迫下大豆發(fā)芽生理活性和GABA等物質(zhì)含量的相關(guān)性分析Table5 Correlation coefficients between GABA content and physiological and biochemical properties of germinated soybean under NaCl stress

鹽脅迫下大豆發(fā)芽期間GABA含量與其他指標(biāo)之間相關(guān)性分析表明，鹽脅迫下發(fā)芽大豆GABA含量與芽長(zhǎng)（r=0.852）、GAD活性（r=0.939）、游離氨基酸含量（r=0.848）和可溶性蛋白含量（r=0.812）之間顯著或極顯著正相關(guān)。

以上研究表明，鹽脅迫下發(fā)芽大豆GABA的富集與大豆的生長(zhǎng)、GAD活性、游離氨基酸和可溶性蛋白質(zhì)密切相關(guān)，在低鹽脅迫下，大豆發(fā)芽受到抑制，但促進(jìn)了GAD活性的升高，游離氨基酸和可溶性蛋白質(zhì)含量增加，從而富集產(chǎn)生了較多的GABA。

3 結(jié) 論

大豆發(fā)芽富集GABA有效的培養(yǎng)液組分為MSG 1.0 mg/mL、PLP 2.0 mmol/L、CaCl22.0 mmol/L、NaCl 100 mmol/L。在最佳工藝參數(shù)下得到的發(fā)芽大豆，其中GABA含量為（269.93±4.73）mg/100 g，比大豆發(fā)芽前提高了約10 倍。

不同鹽類脅迫下，大豆發(fā)芽富集GABA含量不同，NaCl脅迫下GABA富集量最高；發(fā)芽大豆中GABA含量隨NaCl濃度的增加呈先升高后降低趨勢(shì)，在100 mmol/L NaCl處理下發(fā)芽大豆GABA富集量最高。

發(fā)芽大豆游離氨基酸含量、GAD活性和GABA含量隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)先升高后下降，在48 h時(shí)都達(dá)到最佳點(diǎn)；鹽脅迫下大豆發(fā)芽期間GABA含量與芽長(zhǎng)、GAD活性、游離氨基酸和可溶性蛋白含量之間顯著正相關(guān)；隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)，鹽脅迫下發(fā)芽大豆生長(zhǎng)越好，發(fā)芽大豆的芽長(zhǎng)更長(zhǎng)，GAD活性更高，可溶性蛋白和游離氨基酸含量更高，從而使干物質(zhì)含量降低。同時(shí)，在蛋白酶的作用下，大分子蛋白分解為小分子的可溶性蛋白和游離氨基酸，這為GABA富集提供了充足的底物，從而富集產(chǎn)生了較多的GABA。

[1] XU Maojun, DONG Jufang, ZHU Muyuan. Effects of germination conditions on ascorbic acid level and yield of soybean sprouts[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2005, 85(6)： 943-947. DOI：10.1002/jsfa.2050.

[2] BAU H, VILLAUME C, NICOLAS J, et al. Effect of germination on chemical composition, biochemical constituents and antinutritional factors of soya (Glycine max) seeds[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1997, 73(1)： 1-9. DOI：10.1002/(SICI)1097-0010(199701)73：1＜1：AID-JSFA694＞3.0.CO;2-B.

[3] CHEN Yu, ZENG Lizhen, SHENG Kuang, et al. γ-Aminobutyric acid induces resistance against Penicillium expansum by priming of defence responses in pear fruit[J]. Food Chemistry, 2014, 159： 29-37. DOI：10.1016/j.foodchem.2014.03.011.

[4] 白青云, 唐軍濤, 顧振新. 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)芽大豆富集多肽的培養(yǎng)液組分[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(24)： 172-177.

[5] KIM H S, LEE E J, LIM S T, et al. Self-enhancement of GABA in rice bran using various stress treatments[J]. Food Chemistry, 2015, 172：657-662. DOI：10.1016/j.foodchem.2014.09.107.

[6] 鄭向華, 陳榮, 葉寧, 等. 溫度和時(shí)間對(duì)發(fā)芽糙米中γ-氨基丁酸含量的影響[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 2009, 24(9)： 1-4.

[7] 毛健, 馬海樂(lè). 大豆發(fā)芽富集γ-氨基丁酸的工藝優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(24)： 227-231.

[8] SHELP B, BOZZO G, TROBACHER C, et al. Hypothesis/revire：contribution of putrescine to 4-aminobutyrate (GABA) poduction in response to abiotic stress[J]. Plant Science, 2012, 193： 130-135. DOI：10.1016/j.plantsci.2012.06.001.

[9] KOMATSUZAKI N, TSUKAHARA K, TOYOSHIMA H. Effect of soaking and gaseous treatment on GABA content in germinated brown rice[J]. Journal of Food Engineering, 2007, 78(2)： 556-560. DOI：10.1016/ j.jfoodeng.2005.10.036.

[10] THITINUNSOMBOOM S, KEERETIPIBUL S, BOONSIRIWIT A. Enhancing gamma-aminobutyric acid content in germinated brown rice by repeated treatment of soaking and incubation[J]. Food Science and Technology International, 2013, 19(1)： 25-33. DOI：10.1177/1082013212442180.

[11] 劉暢. 大豆中γ-氨基丁酸富集及提取的研究[D]. 哈爾濱： 東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013.

[12] LIU Taiti, TSENG Yiwei, YANG Tsungshi. Functionalities of conjugated compounds of γ-aminobutyric acid with salicylaldehyde or cinnamaldehyde[J]. Food Chemistry, 2016, 190： 1102-1108. DOI：10.1016/j.foodchem.2015.06.077.

[13] CRISTINA M, KUO Y, FEMAND L, et al. Kinetics of free protein amino acids, free non-protein amino acids and trigonelline in soybean (Glycine max L.) and lupin (Lupinus angustifolius L.) sprouts[J]. European Food Research and Technology, 2006, 224(2)： 177-186. DOI：10.1007/s00217-006-0300-6.

[14] 王淑芳, 楊潤(rùn)強(qiáng), 顧振新. 低氧脅迫下大豆發(fā)芽富集γ-氨基丁酸品種篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(21)： 159-163. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201421031.

[15] LIMON A, GALLEGOS J, REYES J M, et al. The endogenous GABA bioactivity of camel, bovine, goat and human milks[J]. Food Chemistry, 2014, 145： 481-487. DOI：10.1016/j.foodchem.2013.08.058.

[16] BAI Q, CHAI M, GU Z, et al. Effects of components in culture medium on glutamate decarboxylase activity and gamma-aminobutyric acid accumulation in foxtail millet (Setaria italic L.) during germination[J]. Food Chemistry, 2009, 116(1)： 152-157. DOI：10.1016/ j.foodchem.2009.02.022.

[17] 楊晶晶, 曲媛, 崔秀明. γ-氨基丁酸的制備方法與含量測(cè)定研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技, 2014, 35(3)： 351-356. DOI：10.13386/ j.issn1002-0306.2014.03.078.

[18] 王輝, 項(xiàng)麗麗, 張峰華. γ-氨基丁酸(GABA)的功能性及在食品中的應(yīng)用[J]. 食品工業(yè), 2013, 34(6)： 186-189.

[19] HAO Jianxiong, WU Tongjiao, LI Huiying, et al. Dual effects of slightly acidic electrolyzed water (SAEW) treatment on the accumulation of γ-aminobutyric acid (GABA) and rutin ingerminated buckwheat[J]. Food Chemistry, 2016, 201： 87-93. DOI：10.1016/ j.foodchem.2016.01.037.

[20] 申迎賓, 范子劍, 麻浩. 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)芽豇豆積累γ-氨基丁酸工藝條件的研究[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(2)： 10-16.

[21] 韓永斌, 顧振新, 蔣振輝. Ca2+浸泡處理對(duì)發(fā)芽糙米生理指標(biāo)和GABA等物質(zhì)含量的影響[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(10)： 58-61.

[22] 郭元新, 楊潤(rùn)強(qiáng), 陳慧, 等. 鹽脅迫富集發(fā)芽大豆γ-氨基丁酸的工藝優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(10)： 1-5.

[23] WANG Yansehng, LUO Zisheng, MAO Linchun, et al. Contribution of polyamines metabolism and GABA shunt to chillingtolerance induced by nitric oxide in cold-stored banana fruit[J]. Food Chemistry, 2016, 197： 333-339. DOI：10.1016/j.foodchem.2015.10.118.

[24] 何夢(mèng)秀, 陳芳艷, 鐘楊生, 等. γ-氨基丁酸富集方法的研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 43(15)： 15-17. DOI：10.13989/ j.cnki.0517-6611.2015.15.007.

[25] 謝菲, 尹京苑, 高海燕, 等. 大豆發(fā)芽過(guò)程理化特性和γ-氨基丁酸關(guān)系的研究[J]. 食品科技, 2013, 38(4)： 49-52. DOI：10.13684/j.cnki. spkj.2013.04.043.

[26] 鄭藝梅. 發(fā)芽糙米營(yíng)養(yǎng)特性、γ-氨基丁酸富集及生理功效的研究[D].武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006.

[27] KIM H, LEE E, LIM S. Self-enhancement of GABA in rice bran using various stress treatments[J]. Food Chemistry, 2015, 172： 657-662. DOI：10.1016/j.foodchem.2014.09.107.

[28] HU Xiaohui, XU Zhiran, XU Weinan, et al. Application of γ-aminobutyric acid demonstrates a protective role of polyamine and GABA metabolism in muskmelon seedlings under Ca(NO3)2stress[J]. Plant Physiology and Biochemistry, 2015, 92： 1-10. DOI：10.1016/ j.plaphy.2015.04.006.

[29] LIMON R I, PENAS E, TORINO I, et al. Fermentation enhances the content of bioactive compounds in kidney bean extracts[J]. Food Chemistry, 2015, 172： 343-352. DOI：10.1016/j.foodchem.2014.09.084.

[30] XU Jianguo, HU Qingping. Changes in γ-aminobutyric acid content and related enzyme activities in Jindou 25 soybean (Glycine max L.) seeds during germination[J]. Food Science and Technology, 2014, 55(1)： 341-346. DOI：10.1016/j.foodchem.2014.09.084.

[31] 於丙軍, 章文華, 劉友良. NaCl對(duì)大麥幼苗根系蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量的影響[J]. 西北植物學(xué)報(bào), 1997(4)： 439-445.

Optimization of Medium Composition for γ-Aminobutyric Acid Accumulation in Germinated Soybean and Mechanism of γ-Aminobutyric Acid Accumulation under Salt Stress

ZENG Qing1, XIE Fei1, YIN Jingyuan2, GAO Haiyan1,*
(1. Shanghai Key Laboratory of Bio-Energy Crops, School of Life Science, Shanghai University, Shanghai 200444, China; 2. School of Computer Engineering and Science, Shanghai University, Shanghai 200444, China)

The aim of this study was to investigate the inf l uence of medium components on γ-aminobutyric acid (GABA) enrichment during soybean sprouting and further to optimize the variables by response surface methodology (RSM). Furthermore, the mechanism of GABA accumulation in germinated soybean under low salt stress was also preliminarily investigated. The results demonstrated that soybean germination in the optimized medium containing 1.0 mg/mL sodium glutamate (MSG), 2.0 mmol/L pyridoxal phosphate (PLP), 2.0 mmol/L CaCl2and 100 mmol/L NaCl yielded accumulation of a high level of GABA, (269.93 ± 4.73) mg/100 g dry weight, which was around11 times higher compared with ungerminated soybeans (control). With increasing concentration of NaCl and extending stress time, glutamine acid decarboxylase activity and GABA content of sprouted soybean increased. Correlation analysis indicated that there was a signif i cantly positive correlation between the GABA content of sprouted soybean and sprout length, glutamine acid decarboxylase activity, free amino acids content or soluble protein content. The germination of soybeans was restrained, the GAD activity was enhanced, and the contents of free amino acid and soluble protein were increased under low salt stress. Finally, GABA was accumulated at a high level.

γ-aminobutyric acid; response surface methodology; salt stress; enrichment process

10.7506/spkx1002-6630-201712015

TS201.1

A

1002-6630（2017）12-0096-08

曾晴, 謝菲, 尹京苑, 等. 大豆發(fā)芽富集γ-氨基丁酸的培養(yǎng)液組分優(yōu)化及鹽脅迫下的富集機(jī)理[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(12)：96-103.

10.7506/spkx1002-6630-201712015. http：//www.spkx.net.cn

ZENG Qing, XIE Fei, YIN Jingyuan, et al. Optimization of medium composition for γ-aminobutyric acid accumulation in germinated soybean and mechanism of γ-aminobutyric acid accumulation under salt stress[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 96-103. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712015. http：//www.spkx.net.cn

2016-07-01

上海大學(xué)“食品科學(xué)學(xué)科建設(shè)”項(xiàng)目

曾晴（1992—），女，碩士研究生，主要從事果蔬采后保鮮技術(shù)研究。E-mail：zengqing0403@163.com

*通信作者：高海燕（1975—），女，副教授，博士，主要從事果蔬采后保鮮技術(shù)研究。E-mail：hygao1111@126.com