實時熒光定量RT-PCR法快速定量檢測果蔬中星狀病毒

馬 丹，魏海燕，徐蕾蕊，魏詠新，汪 琦，張西萌，付溥博，劉 莉，趙曉娟，曾 靜*

（北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，北京 100026）

實時熒光定量RT-PCR法快速定量檢測果蔬中星狀病毒

馬 丹，魏海燕，徐蕾蕊，魏詠新，汪 琦，張西萌，付溥博，劉 莉，趙曉娟，曾 靜*

（北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，北京 100026）

目的：針對不同果蔬表面建立星狀病毒富集與RNA提取方法，結合已報道的實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）引物和探針，實現果蔬中星狀病毒的高靈敏快速定量檢測。方法：利用10 倍梯度稀釋的星狀病毒cRNA分子檢測Ct值及其對應的初始濃度，構建標準曲線，為星狀病毒的 定量檢測提供參考。將ISO/TS 15216-2：2013針對果蔬中諾如病毒和甲肝病毒RNA的提取方法用于星狀病毒的檢測，利用人工感染的大白菜和草莓樣品，分析病毒回收率、靈敏度及檢測重復性。最終通過60 份果蔬樣品的檢測驗證該方法的實用性。結果：所建立的實時熒光定量RT-PCR方法擴增效率達95.9%，檢測低限為5.6 拷貝/反應。人工感染的大白菜樣品中病毒回收率在0.94%～9.63%之間，而人工感染草莓樣品中病毒回收率最高達1.03%。對同一感染濃度的樣品在不同時間的檢測結果變異系數均小于2%。最終檢出1 份來自北京農貿市場的草莓樣品為星狀病毒陽性，檢測陽性率達1.67%。結論：建立的果蔬中星狀病毒熒光RT-PCR定量檢測方法快速、高效、靈敏，在食源性病毒的日常篩查和風險評估工作中具有重要的應用價值。

星狀病毒；實時熒光定量RT-PCR；果蔬；定量檢測

星狀病毒（human astrovirus，HAstV）是引起嬰幼兒、老年人及免疫功能低下者急性病毒性腸炎的重要病原之一[1-2]，有較強的離體存活力和感染性，一般10～200 個病毒粒子即可引發感染[3]，主要通過糞口途徑傳播[4-5]。20世紀70年代在兒童的腹瀉標本中使用電鏡發現了星狀病毒，隨著分子檢測技術不斷的發展，對該病毒的研究逐漸增多。目前，確認HAstV是導致病毒性腹瀉的重要病原體[6-7]，在一些國家的調查中發現HAstV的感染已相當普遍，陽性檢出率在2%～9%之間[8-9]，如肯尼亞為6.3%[10]，美國和英國的檢出率為4%，我國對1998—2005年來自7 個地區的1 668 份腹瀉患兒糞便標本進行檢測，HAstV感染平均陽性率為5.5%[11]，而據文獻報道，2011年南昌市發生一起HAstV暴發流行事件[12]。果蔬等生鮮農產品作為高風險的食品，通常不經烹飪直接生食，且在供應鏈中的不同環節都容易被污染，如人類糞便污染的灌溉用水、肥料、食物處理用水、食物處理者的不衛生操作、交叉污染等[13]，因而也成為HAstV的常見傳染源。目前國內對HAstV檢測的研究重點主要集中在臨床糞便樣品和水產品中，缺乏果蔬中HAstV污染的相關報道，因此亟需建立果蔬中HAstV快速定量檢測方法，為下步的食品安全風險評估和流行病學調查提供參考依據。

本實驗將國際標準ISO/TS 15216-2：2013[14]中提取果蔬表面諾如病毒和甲肝病毒RNA的技術應用到HAstV中，并結合已報道的實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）引物和探針[15]及通過體外轉錄構建的HAstV cRNA標準分子，建立起果蔬中HAstV的高靈敏快速定量檢測方法。利用人工感染的大白菜和草莓樣品，分析了不同果蔬中病毒回收率及檢測重復性，最終通過60 份實際樣品的檢測對該方法的實用性加以進一步驗證。

1 材料與方法

1.1 病毒陽性樣本

HAstV的陽性樣本為本實驗室收集的嬰幼兒腹瀉糞便，并經過透射電鏡、實時熒光定量RT-PCR等方法驗證含有HAstV。將含有病毒顆粒的糞便樣品用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）按1∶10稀釋，混勻，10 000 r/min離心2 min，收集上清液備用。

1.2 試劑

一步法實時熒光定量R T-P C R檢測試劑盒（SuperScript?Ⅲ Platinum?One-Step qRT-PCR System） 美國Invitrogen公司。

R N A提取試劑：P B S：K H2P O40.2 g、Na2HPO4·12H2O 1.15 g、NaCl8 g、KCl 0.2 g、無RNase超純水1 000 mL、pH 7.3、高壓滅菌；Tris/甘氨酸/牛肉膏緩沖液（Tris/glycine/beef extract buffer，TGBE）：Tris基質12 g、甘氨酸 3.8 g、牛肉膏10 g、無RNase超純水定容至1 000 mL、pH 7.3、高壓滅菌；5×PEG/NaCl溶液：聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）8000 500 g、NaCl 87 g、無RNase超純水定容至1 000 mL、高壓滅菌；黑曲霉果膠酶 美國Sigma公司；焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC） 北京天根生化科技有限公司；TRIzol、Dynabeads?mRNA Purification Kit美國Invitrogen公司；乙醇、異丙醇、氯仿 北京化學試劑公司；反轉錄試劑盒：Ribo MAXTMLarge Scale RNA Production system-T7 美國Promega公司；RNeasy MiniElute Cleanup kit 德國Qiagen公司。

1.3 儀器與設備

MAHFIA型組織勻漿器 瑞士Consul A.R.公司；Centrifuge 5810R型低溫冷凍高速離心機 德國Eppendorf公司；7900HT Fast實時熒光PCR儀 美國ABI公司；ROCHE LightCycler 480實時熒光PCR儀 瑞士羅氏公司。

1.4 方法

1.4.1 引物和探針

選用Grimm等根據HAstV的衣殼蛋白編碼基因（ORF2）5’端高度保守基因序列設計的引物和探針[15]，序列見表1。

表1 普通RT-PCR和實時熒光定量RT-PCR檢測所用引物和探針Table1 Primer and probe sequences for RT-PCR and real-time RT-PCR

1.4.2 實時熒光定量RT-PCR反應體系的構建

利用SuperScript?Ⅲ Platinum?One-Step qRT-PCR試劑盒構建一步法實時熒光定量RT-PCR反應。25 μL的反應體系包括：2×SuperScript?Ⅲ RT/Platinum?Taq Mix 12.5 μL、上游引物和下游引物（10 μmol/L）各1 μL、探針（10 μmol/L）各0.1 μL以及RNA 模板5 μL。于ABI 7900 PCR儀中按以下條件進行反應：50 ℃逆轉錄15 min，95預變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，40 個循環。

1.4.3 HAstV cRNA的構建與熒光RT-PCR檢測標準曲線的繪制

以糞便樣品中提取的HAstV RNA為模板，利用引物AstU1（+）和AstL1（－），擴增出約217 bp的特異性片斷，稱之為Ast；T-A克隆構建重組質粒pCR2.1-Ast（pCR2.1-T載體購自美國Invitrogen公司），于生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定，并將測序結果與GenBank中HAstV的基因序列進行同源性分析，保證其同源性達99%以上。提取并純化質粒D NA，以其為模板，用Ribo MAXTMLarge Scale RNA Production system-T7試劑盒進行體外轉錄（按試劑盒操作說明書進行），體外轉錄產物用DNase消化，去除其中的DNA。利用RNeasy MiniElute Cleanup kit進一步純化cRNA。紫外分光光度計測定cRNA的濃度，并通過以下公式計算模板分子的拷貝數。進而將cRNA進行10 倍梯度稀釋至單拷貝，進行熒光RT-PCR檢測，分別以cRNA模板的拷貝數對數值和相對應的檢測Ct值為橫坐標和縱坐標，繪制標準曲線。

1.4.4 人工感染果蔬樣品的檢測

1.4.4.1 人工感染果蔬樣品的制備

取已證實不含HAstV的白菜和草莓，分別作為食物接觸硬表面和軟表面的樣品代表。用PBS將含有HAstV的糞便樣品進行10 倍梯度稀釋至10－3，分別取各稀釋度糞便樣品200 μL均勻滴加到待測果蔬表面，白菜樣品添加表面積為40 cm2左右，草莓樣品添加表面積為20 cm2左右，靜置1 h。

1.4.4.2 人工感染果蔬樣品前處理

參照ISO/TS 15216-2：2013標準中針對果蔬中諾如病毒和甲肝病毒RNA的提取方法，分別對人工感染的白菜和草莓樣品進行如下處理：

白菜樣品的硬表面代表：將浸潤500 μL PBS的無菌棉用力擦拭硬表面（最大100 cm2）。迅速將無菌棉放入干凈的離心管中，按壓無菌棉，盡量將液體全部擠出，重復上述操作3～4 次，以確保病毒被最大程度的擠出無菌棉。保留病毒富集液用于提取RNA。

草莓樣品的軟表面代表：稱取樣品約25 g，轉移至400 mL帶濾網的均質袋中，加入40 mL TGBE緩沖液、30 U的黑曲霉果膠酶，在室溫、60 r/min振搖孵育20 min。對于酸性樣品，在孵育過程中，每10 min檢測洗脫液的pH值，如果pH值低于9.0，則用NaOH溶液調節pH值至9.5。每調節一次pH值，則需要延長10 min的孵育時間。透過濾網，將洗脫液倒入離心管中，4 ℃、10 319 r/min離心30 min，將上清液轉入干凈的離心管中，并用1 mol/L鹽酸溶液將pH值調節至7.0。加入0.25倍體積的5×PEG/NaCl溶液（最終為10 g/100 mL PEG，0.3 mol/L NaCl），振蕩60 s以混勻，之后在5 ℃、60 r/min孵育60 min。在5 ℃、10 319 r/min離心30 min，棄去上清液，然后在5 ℃、10 319 r/min離心5 min，以壓實沉淀物。棄上清液，加入500 μL PBS重懸沉淀。加入500 μL的氯仿-正丁醇，渦旋混合，然后在室溫條件下孵育5 min。于5 ℃、10 319 r/min離心15 min，將上層水相小心地轉移到一個新的離心管中，保留病毒富集液用于提取RNA。

1.4.4.3 人工感染果蔬樣品病毒RNA的提取

將1.4.4.2節的病毒富集液加入5 mL Trizol-reagent，劇烈渦旋混勻1 min，室溫放置5 min。將溶液轉移至10 mL無RNase的離心管中，加入1.2 mL氯仿，劇烈渦旋混勻1 min，室溫放置5 min。4 ℃、10 319 r/min離心5 min，小心吸取上清液至無RNase的10 mL離心管中。加入0.5 倍體積的異丙醇，顛倒混勻后室溫放置5 min。4 ℃、10 319 r/ min離心10 min，棄上清液，用預冷的75%乙醇溶液洗滌沉淀。加入100 μL無RNase的水，60 ℃加熱5～10 min，使沉淀完全溶解，得到總RNA。繼續按照Dynabeads?mRNA Purification Kit使用說明從總RNA中純化得到病毒RNA。

1.4.4.4 病毒回收率的計算及檢測低限分析

按照1.4.4.3節方法直接利用Trizol-reagent提取用于添加的HAstV陽性糞便樣本（原液至10－3）RNA，連同提取的人工感染果蔬樣品中病毒RNA一起進行實時熒光定量RT-PCR檢測，并根據病毒定量檢測的標準曲線計算各自所對應的RNA拷貝數，以此分別作為果蔬中添加的病毒基因拷貝數和實際提取到的病毒基因拷貝數。按照式（2）計算病毒回收率，并比較在不同果蔬中HAstV的檢測低限。

1.4.5 檢測重復性分析

按照1.4.4.1節的方法制備15 份人工感染HAstV的草莓樣本，將其分成3 組，分別在3 d內進行檢測，計算組內與組間檢測結果的變異系數（coefficient of variation，CV），評價該方法的重復性和穩定性。

1.4.6 實際果蔬樣品的檢測

選取出口冷凍草莓、冷凍樹莓，以及購自北京農貿市場和超市的新鮮草莓、蘋果、大白菜、油麥菜、生菜、圣女果、黃瓜9 種共計60 份果蔬樣品，利用建立的實時熒光定量RT-PCR法進行HAstV的檢測，進一步驗證該方法的有效性。

2 結果與分析

2.1 HAstV熒光定量RT-PCR標準曲線的繪制

對c R N A進行1 0 倍梯度稀釋，使其濃度達5.6×107～5.6 拷貝/μL，經熒光RT-PCR檢測，獲得擴增曲線如圖1所示，可見隨cRNA稀釋度的增加，其所對應的Ct值逐漸增大，呈一定的梯度關系。分別以cRNA模板的拷貝數對數值和相對應的檢測Ct值為橫坐標和縱坐標，繪制得到標準曲線，方程為y=－3.424x+39.696，其相關系數R2達0.997，斜率為－3.424，擴增效率達95.9%。因此后續檢測中，將待測樣本實時熒光定量RT-PCR的檢測Ct值代入標準曲線的回歸公式，即可計算出其對應的病毒RNA拷貝數，從而為HAstV的定量檢測提供參考。

圖1 HAstV cRNA進行實時熒光定量RT-PCR檢測的擴增圖譜Fig.1 Amplification plots of HAstV cRNA

2.2 病毒回收率計算及檢測低限分析

表2 糞便及人工感染樣本中HAstV實時熒光定量RT-PCR的定量檢測結果Table2 Quantitative test results of HAstV in artificially infected samples by real-time fluorescence RT-PCR

對人工感染不同濃度HAstV的大白菜和草莓樣品，提取病毒RNA，經實時熒光定量RT-PCR檢測，根據測得的Ct值和標準曲線回歸公式，可分別計算出添加的和提取到的病毒RNA拷貝數（表2），由此測得人工感染的大白菜樣品中病毒回收率在0.94%～9.63%范圍內，而人工感染草莓樣品中病毒回收率則明顯降低，最高達1.03%（圖2）；此外，兩種人工感染樣品的病毒回收率均呈現出隨添加量降低而下降的趨勢，在大白菜樣品中，添加糞便的稀釋度由10－2降為10－3時，病毒回收率下降了10 倍，而草莓中添加10－3稀釋度糞便樣本時，已檢測不到HAstV RNA的存在（圖2）。

圖2 不同添加糞便樣本稀釋倍數的大白菜和草莓樣本中HAstV回收率比較Fig.2 Recovery of HAstV from spiked cabbage and strawberry samples

2.3 人工感染樣品檢測重復性分析

對人工感染的草莓樣品進行檢測，結果發現無論是同一天內的5 次重復所得Ct值，還是3 d獨立實驗所得的平均Ct值都非常接近，經統計學計算同一天內檢測結果的CV（組內CV）分別為1.41%、1.67%和1.39%，而3 d間檢測結果的CV（組間CV）為1.06%（表3），說明本方法檢測果蔬中HAstV的效果非常穩定，具有良好的重復性。

表3 一步法實時熒光定量RT-PCR檢測HAstV重復性分析Table3 Repeatability analysis of real-time RT-PCR for detecting HAstV

2.4 實際樣品檢測結果

表4 實際樣品的檢測結果Table4 Results of HAstV detection of actual samples

利用建立的實時熒光定量RT-PCR法對60 份果蔬樣品進行HAstV的檢測，在購自北京農貿市場的1 份草莓樣品中檢出HAstV，檢測陽性率為1.67%（表4）。

3 討 論

HAstV的衣殼蛋白編碼基因（ORF2）5’端是一個核酸序列高度保守區，多用于引物和探針的設計。Sakon等[16]設計的RT-PCR引物AC230、AC1’以及探針Acom-prob就位于該區，然而這些引物和探針同HAstV的部分血清型核酸序列間不是很匹配，因此也就影響了其檢測的特異性。Grimm[15]在Sakon[16]等研究基礎上，綜合分析了HAstV8 個血清型[17-19]間的序列差異，選取了217 bp的片段作為擴增把序列，設計出一系列引物和探針，保證在一個反應體系中可同時檢測到HAstV的8 種血清型，大大提高了檢測效率。本實驗將該系列引物和探針引入果蔬中HAstV的檢測，通過對10 倍梯度稀釋的cRNA進行進行實時熒光定量RT-PCR擴增分析，發現該系列引物和探針的擴增效率達95%以上，最低檢測限可達5.6 拷貝/反應，且檢測Ct值同模板拷貝數的對數值存在良好的線性關系，R2達0.997，從而為實際樣品的定量檢測提供了技術參考。

雖然病毒是嚴格的細胞內寄生物，但在果蔬中不能繁殖，果蔬作為病毒的攜帶者，病毒載量往往較低，再加上其基質成分的復雜性[20-24]，使得病毒的有效富集和病毒RNA的高純度、完整提取成為決定食源性病毒檢測成敗的關鍵，也是近年來研究的熱點。我國已有針對HAstV的檢測標準SN/T 2519—2010《貝類中星狀病毒檢測方法 普通PCR和實時熒光PCR方法》[25]、SN/T 2518—2010《貝類食品中食源性病毒檢測方法 納米磁珠-基因芯片法》[26]和SN/T 3841—2014《出口貝類中諾如病毒和星狀病毒的快速檢測 反轉錄-環介導恒溫核酸擴增（RT-LAMP）法》[27]均是針對貝類食品，由于貝類和果蔬基質間的顯著差異，其病毒RNA的提取方法并不適用于果蔬類食品。ISO在2013年發布的“食品和動物飼料微生物學——食品中甲肝病毒和諾如病毒的實時熒光定量RT-PCR檢測水平方法（ISO/TS 15216-2：2013）”中給出了針對不同果蔬表面的病毒富集、洗脫與RNA的提取方法，但卻未涉及HAstV。鑒于HAstV同諾如和甲肝病毒存在相似的結構特點，即均為球形、無包膜病毒顆粒，內含單股正鏈RNA，并在基因結構3′端含有polyA尾[28-30]，因此，本研究將ISO/TS 15216-2：2013中諾如病毒和甲肝病毒的RNA提取技術應用到HAstV中，通過對人工感染的大白菜和草莓樣品檢測發現HAstV的回收率最高分別可達9.63%和1.03%（圖2），滿足國際標準ISO/TS 15216-2：2013檢測要求。同時，研究結果表明HAstV自食品硬表面（如大白菜）中的回收率普遍高于軟表面（如草莓），這可能是由于軟表面對病毒的吸附性更強，病毒不易洗脫，操作步驟更加繁雜，增加病毒損失的機率，且草莓中果膠等核酸擴增抑制成分的釋放，均會導致病毒回收率的降低。此外，研究還發現果蔬中病毒回收率會隨著污染水平的降低而急劇下降，特別是在大白菜樣品中這一趨勢更加明顯，其添加糞便的稀釋度由10－2降為10－3時，病毒回收率下降了10 倍（圖2），表明低污染水平的樣品檢測難度更大，需要開發更為高效靈敏的病毒富集提取技術，以期進一步提高病毒的檢出率。

實驗最終通過15 份人工感染和60 份實際果蔬樣品的檢測，證明該方法具有良好的重復性和穩定性，病毒檢出率達1.67%，其檢測時間約3～5 h，無需昂貴的試劑和特大型儀器設備，并可實現定量檢測，可作為食品安全檢測實驗室的常規方法，在食源性病毒篩查與風險評估中具有重要的應用價值。

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Development of a Real-Time Fluorescent RT-PCR Assay for Quantitative Detection of Astrovirus in Fruits and Vegetables

MA Dan, WEI Haiyan, XU Leirui, WEI Yongxin, WANG Qi, ZHANG Ximeng, FU Pubo, LIU Li, ZHAO Xiaojuan, ZENG Jing*
(Inspection and Quarantine Technical Center, Beijing Enter-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Beijing 100026, China)

Objective： Different procures for viral concentration and RNA extraction from fruits and vegetables were proposed taking into account the difference in surface structure between both materials and they were used to develop a sensitive and rapid real-time fluorescent reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) for the quantitative detection of astrovirus in fruits and vegetables using the primers and probes designed according to published sequences. Methods： A standard curve for quantitative detection of astrovirus was constructed by plotting the cycle threshold (Ct value) versus the starting concentration of 10-fold serially diluted cRNA. Then the method for norovirus and hepatitis A virus RNA extraction from fruits and vegetables described in the standard ISO/TS 15216-2：2013 was applied to detect astrovirus. The viral recovery rate, sensitivity and reproducibility of the assay were evaluated by using artificially contaminated cabbage and strawberry samples. Finally, 60 fruit and vegetable samples were tested to demonstrate the feasibility of this method. Results： The amplification efficiency of the real-time fluorescent RT-PCR was 95.9%, with a limit of detection (LOD) of 5.6 copies per reaction. The viral recovery rate of artificially contaminated cabbage samples was 0.94%-9.63%, compared to only 1.03% for the strawberries. Analysis of the artificially contaminated samples containing the same viral levels demonstrated high reproducibility with a coefficient of variation (CV) of less than 2%. Additionally, one strawberry sample collected from a retail market in Beijing was shown to be astrovirus-positive, and the detection rate was 1.67%. Conclusion： The developed method is rapid, efficient and sensitive for quantitative detection of astrovirus in fruits and vegetables, and will be a useful tool for routine screening and risk assessment of foodborne viruses.

astrovirus; real-time fluorescent RT-PCR; fruits and vegetables; quantitative detection

10.7506/spkx1002-6630-201712037

R155.5

A

1002-6630（2017）12-0240-06

2016-07-30

公益性行業（質檢）科研專項（201410080）

馬丹（1987—），女，工程師，碩士，研究方向為食品微生物檢測。E-mail：mad@bjciq.gov.cn

*通信作者：曾靜（1963—），女，研究員，博士，研究方向為食品安全微生物檢測。E-mail：zengj@bjciq.gov.cn馬丹, 魏海燕, 徐蕾蕊, 等. 實時熒光定量RT-PCR法快速定量檢測果蔬中星狀病毒[J]. 食品科學, 2017, 38(12)： 240-245. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712037. http：//www.spkx.net.cn

MA Dan, WEI Haiyan, XU Leirui, et al. Development of a real-time fluorescent RT-PCR assay for quantitative detection of astrovirus in fruits and vegetables[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 240-245. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201712037. http：//www.spkx.net.cn