微滴式數字PCR定量檢測轉基因玉米品系VCO-01981-5

張佳玲，潘 廣，章桂明，程穎慧，向才玉，陳枝楠，謝忠穩,*，凌杏園,*

（1.安徽農業大學茶與食品科技院，茶樹生物學與資源利用國家重點實驗室，安徽 合肥 230036；2.深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心，廣東 深圳 518045；3.深圳市檢驗檢疫科學研究院，廣東 深圳 518010）

微滴式數字PCR定量檢測轉基因玉米品系VCO-01981-5

張佳玲1，潘 廣2，章桂明2，程穎慧2，向才玉2，陳枝楠3，謝忠穩1,*，凌杏園2,*

（1.安徽農業大學茶與食品科技院，茶樹生物學與資源利用國家重點實驗室，安徽 合肥 230036；2.深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心，廣東 深圳 518045；3.深圳市檢驗檢疫科學研究院，廣東 深圳 518010）

建立基于QX100微滴式數字聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）平臺的我國未批準轉基因玉米品系VCO-01981-5的二重微滴式數字PCR定量檢測方法。該方法選擇基因組中單拷貝的玉米內源基因hmg和VCO-01981-5品系邊界序列為定量靶序列，分別設計不同的PCR擴增引物和TaqMan探針，并對兩種探針用不同的熒光進行標記，然后將上述探針和引物置于同一個PCR反應體系中以同時定量兩個靶標序列。特異性實驗結果顯示該法只有VCO-01981-5品系的兩個靶序列才都有擴增信號。靈敏度、線性和準確性實驗結果顯示在定量結果相對標準偏差不大于25%時，最低可穩定定量5 個拷貝的VCO-01981-5品系特異性序列分子和4 個拷貝的內源基因hmg分子；而在高達50 ng模板DNA以下范圍內，PCR反應模板量與測定樣品拷貝數之間呈高度正相關，相關系數達0.99以上；平均誤差小于10%。結果表明本研究建立的該玉米品系定量方法特異性強，穩定性好，精確性、準確性以及靈敏度高，定量范圍廣，可用于進、出口農產品和食品中該轉基因玉米品系成分的定量檢測。此外，該法還可為其他轉基因玉米品系及其他轉基因作物品系建立類似定量檢測方法提供參考。

轉基因玉米；品系VCO-01981-5；微滴式數字PCR；定量檢測

2015年是轉基因作物商業化第20周年，全球轉基因作物累計種植面積達到空前的20億 公頃。20年來，農民收益超過了1 500億 美元。然而轉基因農作物在給人們帶來巨大利益的同時也引發了公眾對其安全性的擔憂。同歐盟等國家一樣，我國高度重視轉基因農作物及食品的安全問題，不僅要求對轉基因產品進行標識，還要求對未批準的轉基因品系及其產品予以取締，因此，必須對農產品進行定性和定量的轉基因檢測[1-3]。

目前，轉基因檢測的方法主要有基于核酸檢測的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術[4]、核酸雜交技術[5]和基因芯片技術[6]，基于蛋白質檢測的Western Blot[7]、酶聯免疫吸附測定[8]等。其中應用最廣泛的是普通PCR方法和實時熒光PCR方法。如在定性檢測方面，Matsuoka等[9]利用多重PCR同時檢測玉米內源基因Ze1和5 種轉基因品系，該方法特異性強、靈敏度較高，可以檢出0.5%含量的轉基因玉米品系。在定量檢測方面，Kim等[10]用構建的含小麥內源基因acc和小麥品系MON71800特異性序列的標準質粒pGEM-M71800制作標準曲線，建立的普通PCR方法最低能檢測10 個拷貝品系特異序列分子；而建立的實時PCR方法最低能檢測5 個拷貝，定量限（limit of quantitation，LOQ）為10 個拷貝，其相對標準偏差在0.23%～1.12%范圍內，表明實時熒光PCR方法靈敏度更高、定量結果重復性更好。Wu Gang等[11]同樣采用實時熒光PCR方法建立了定量檢測轉基因油菜品系Topas 19/2的方法，該方法特異性強，只有品系Topas 19/2的內源基因HMG-I/Y和品系特異性序列兩者均有擴增；品系特異性基因的檢出限（limit of detection，LOD）和LOQ分別約為5 個和50 個拷貝數，相對標準偏差在0.260%～1.541%范圍內，表明方法靈敏度和重復性較高。

不管是常規PCR還是實時熒光PCR定量檢測，首先必須用已知拷貝數的標準DNA制定標準曲線，以確定PCR初始模板拷貝數與PCR產物量（普通PCR定量）或與Ct值（實時熒光PCR定量）的關系；再由PCR產物量或Ct值經由標準曲線公式計算得到樣品目標序列的拷貝數。由于樣品DNA與制作標準曲線的標準DNA在質量上（包括DNA降解程度、是否含有反應抑制物等）不可能完全一致，勢必造成兩者PCR反應擴增效率的差異，從而影響PCR反應的產物量或Ct值，進而影響定量結果的準確性。此外，常規PCR定量需要通過瓊脂糖凝膠電泳獲得目標條帶產物量，不僅操作繁瑣，且容易污染。實時熒光PCR盡管比普通PCR特異性強、污染少，但同樣需要制作標準曲線，檢測結果受擴增效率影響[12-13]。

微滴式數字PCR是最近興起的一種核酸單分子擴增技術。其原理是：一個PCR反應管中90 μL的油水反應體系被微滴發生器制 備成近20 000 個油包水小微滴；當待測DNA模板分子數低于一定的數目，微滴只含有一個分子的DNA模板和足夠量的用于熒光PCR反應所需的所有其他組分如dNTP、Taq DNA聚合酶以及探針和引物等。待所有微滴實時熒光PCR反應結束后，逐一檢查每個微滴。只要微滴有熒光信號檢出，就被認為有實時熒光PCR反應發生，記有一個分子的待測模板被檢出；統計所有陽性微滴數，就可得出樣品中待測DNA模板的分子數[14-18]。數字PCR技術的上述特點表明其對目標序列拷貝數的定量不依賴標準曲線，且定量結果不受PCR擴增效率影響，因此，具有比普通PCR和實時熒光PCR定量技術無法比擬的優越性[19-22]。

數字PCR在轉基因定量檢測方面也有應用[23-29]。Corbisier等[25]利用數字PCR檢測轉基因玉米MON810品系外源基因和內源參照基因的拷貝數比例，同時用實時PCR檢測質粒DNA標準物質，并將兩者的結果進行比較，獲得了一致性，說明兩種方法均能用于MON810品系拷貝數的分析測定。Demeke等[26]將外源基因和內源參照基因的探針引物混合到單個PCR反應中，利用二重ddPCR對轉基因油菜OXY235品系和大豆DP305423品系進行絕對定量，結果發現含量為1%、0.1%及0.01%的標準品樣品均能被ddPCR和實時PCR定量，而含量為0.001%的標準品樣品只能被ddPCR檢出。Fu Wei等[27]選取CaMV35s啟動子和NOS終止子作為篩選轉基因作物的通用元件，用數字PCR進行定量檢測，并對MON810等9 種轉基因品系進行特異性驗證，結果獲得LOD為0.1%，這一低于歐盟規定閾值的結果，表明該方法特異性好、靈敏度高，適于轉基因成分含量的精確定量。

轉基因玉米VCO-01981-5是有Genective S.A.公司開發的抗草甘膦除草劑的新品系，于2013和2014年分別在美國和加拿大獲準商業化生產和利用。該品系未獲我國農業部批準，國際、國內也未見有相應的品系特異性檢測方法公開報道。本研究以采購的VCO-01981-5標準品為實驗材料，根據文獻公開的外源基因插入位點附件序列設計該品系特異性檢測引物和探針，以Bio-Rad公司生產的QX100微滴式數字PCR為實驗平臺，研究建立了這一我國目前尚未批準進口的轉基因玉米品系的精準定量方法，以實現對該轉基因玉米成分的定量檢測。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

本研究共選取26 份實驗材料，分別為轉基因玉米品系MIR162、MON89034、Bt176、Bt11、MON88017、MON810、MON863、T25、MIR604、ES3272、GA21、59122、MON87460、98140、DAS40278-9、MON87427、VCO-01981-5（100%質量百分含量），轉基因油菜品系MS1、RF1、Topas19/2，轉基因水稻品系KF6，轉基因大豆品系A2704-12、MON89788、305423，轉基因棉花品系GHB614，轉基因馬鈴薯品系EH92-527-1，以上材料均于歐盟標準局和美國油脂化學協會。

ddPCR Super Mix、ddPCR Droplet Generation Oil、ddPCR Droplet Reader Oil、Droplet Generator DG8 Cartridge、Droplet Generator DG8 Gasket、plate holder和96孔板試劑和耗材 美國Bio-Rad公司；植物基因組DNA提取試劑盒DNeasy Plant Mini kit 德國Qiagen公司。

QX100TMDroplet Digital PCR系統（包括PCR儀、微滴生成儀和微滴讀取儀和封膜儀四部分） 美國Bio-Rad公司；Mcrofuge?16型離心機 美國貝克曼庫爾特公司；Vortex genie3型渦旋振蕩儀 德國IKA公司；恒溫水浴鍋 北京市六一儀器廠；Nanodrop 2000c核酸蛋白分析儀 美國Thermo Scientif i c公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取

轉基因玉米等供試材料的基因組DNA提取參照試劑盒說明書。

1.2.2 探針和引物

轉基因玉米內源基因選用玉米高速泳動蛋白（high mobility group proteins，HMG）基因，HMG是細胞核中一種與染色質結合在一起的高度豐富的非組蛋白，其分子質量比較小，但在染色質的結構與功能中可能起著重要的作用。該基因在GenBank的檢索號為AJ131373.1，在玉米基因組中僅一個拷貝。

轉基因玉米VCO-01981-5品系特有序列選擇外源基因插入位點5’端跨邊界序列，該序列在玉米基因組中為單拷貝。

用于數字PCR檢測轉基因玉米內源基因hmg和品系VCO-01981-5特異序列的探針、引物序列及探針標記信息見表1。

表1 研究用探針和引物信息Table1 Sequences of probes and primers used in this study

1.2.3 反應體系和反應條件

每個提取DNA樣品檢測時設置3 個平行PCR反應。

d d P C R反應體系共2 0 μ L，其中2×ddPCR Super Mix10 μL，品系特異性序列和內參照hmg基因正、反向引物各1 μL（6 μmol/L）、探針各1 μL（3.6 μmol/L），DNA模板（15 ng/μL）2 μL，補水至20 μL。分別將20 μL的反應體系和70 μL微滴生成油加在微滴生成卡槽相應的小室中，蓋上膠墊后放入微滴生成儀中，由儀器自主振蕩生成微滴。待振蕩結束后將產生的40 μL左右的微滴轉移到96 孔板中，并用熱封膜儀對其進行封膜，最后置于PCR儀進行PCR反應。

反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，56 ℃退火1 min，40 個循環，98 ℃、10 min酶熱失活，產物4 ℃保存。

擴增結束后，將96 孔板置入微滴分析儀中讀取信號，并使用QuantaSoft V1.3.2軟件分析實驗數據。樣品中轉基因品系含量以樣品基因組DNA中品系特異序列拷貝數占內源基因拷貝數的百分比即拷貝數含量表示。

1.2.4 穩定性實驗

以1 ng/μL轉基因玉米品系VCO-01981-5（100%質量百分含量）基因組DNA作為模板DNA的工作質量濃度，再按照上述反應體系要求配制反應體系并進行PCR反應。穩定性實驗設置3 個平行，要求3 個重復實驗結果的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）不超過25%。

1.2.5 特異性實驗

選用轉基因玉米品系MIR162、MON89034、Bt176、Bt11、MON88017、MON810、MON863、T25、MIR604、ES3272、GA21、59122、MON87460、98140、DAS40278-9、MON87427、VCO-01981-5（1 0 0%含量），轉基因油菜品系M S 1、R F 1、Topas19/2，轉基因水稻品系KF6，轉基因大豆品系A2704-12、MON89788、305423，轉基因棉花品系GHB614，轉基因馬鈴薯品系EH92-527-1為實驗材料。以這26 種轉基因樣品基因組DNA為模板配制ddPCR反應體系，并進行PCR反應。其中VCO-01981-5品系作為陽性對照。

1.2.6 定量線性范圍測定

轉基因玉米品系VCO-01981-5（100%質量百分含量）基因組DNA分別用純水稀釋至25、5、1、0.2、0.04、0.008、0.0016 ng/μL共7 個工作質量濃度。以2 μL上述各稀釋DNA作為模板進行ddPCR反應，每個質量濃度重復3 個反應。計算各質量濃度樣品3 次重復實驗結果的RSD，以起始樣品用量對RSD不超過25%的各質量濃度樣品的定量結果計算兩者的線性關系和相關系數。LOQ定義為檢測結果RSD不超過25%的最低樣品用量或樣品拷貝數；LOD定義為能夠檢測的樣品最低拷貝數或樣品用量。

1.2.7 LOQ驗證

取定量性范圍下限的DNA樣品用量進行LOQ驗證，共進行10 個平行反應，計算平行反應實驗結果的平均值和RSD，如RSD不大于25%，則為該方法目標序列的LOQ。

1.3 準確性檢測

本研究實驗材料VCO-01981-5標準品（100%）是玉米種子粉末，種子由轉基因父本和非轉基因母本雜交產生（F1代）。這種質量百分含量100%的雜合型玉米標準品，其拷貝數含量（品系特異序列和內源基因拷貝數比值）理論上僅為39%左右[25,30]。這里取1.2.6節中定量線性范圍測定中RSD不大于25%的實驗數據，計算不同模板DNA用量測定拷貝數含量和RSD、平均拷貝數含量和RSD，定量結果準確性以誤差百分數表示。

2 結果與分析

2.1 方法的建立和穩定性檢測結果

反應體系參照Morisset[17]建立的MON810品系的二重數字PCR方法。本實驗檢測VCO-01981-5品系特異性序列探針采用5’-FAM—3’-BHQ1熒光標記，檢測內源基因hmg探針采用5’-HEX—3’-BHQ1熒光標記，從而保證同一個反應體系中兩種目標序列的擴增產物可以同時檢出。反應酶采用Bio-Rad生產的與其平臺相適應的預混液（Super Mix），由于該預混液對體系中各種成分抗干擾性和適應性廣，探針和引物用量等同文獻[17]用量。

由于針對不同目標序列設計的引物、探針序列不同，其退火溫度不同，因而二重數字PCR反應條件中的退火和延伸溫度特別重要。本研究應用合成的內、外源基因引物、探針和轉基因玉米品系VCO-01981-5標準品基因組DNA按1.2.3節要求配制PCR反應體系并測試了7 種（65、63.8、62.0、59.1、55.7、52.9、51 ℃）不同的退火溫度，結果發現55.7 ℃有利于兩個目標序列的擴增（數據未提供）。

56 ℃反應條件下3 次重復實驗結果如圖1所示。圖1A為FAM通道，是各微滴VCO-01981-5品系特異序列擴增反應結果；圖1B圖為HEX通道，是各微滴內源基因hmg擴增反應結果。如圖1A中熒光擴增值介于10 000～14 000之間的圓點和圖1B中熒光擴增值介于4 000～6 000之間的圓點分別代表發生PCR擴增反應的微滴，熒光分析儀判讀為陽性信號；而位于本底熒光值附近的圓點代表未發生擴增的微滴，熒光分析儀判讀為陰性信號。陽性微滴的熒光增量大、信號強，代表擴增產物量大，說明該微滴擴增效率高；陰性微滴的熒光增量少、信號弱，表明該微滴擴增效率低。對數字PCR來說不管以上陽性微滴熒光信號強弱，均表示一個分子目標序列檢出，檢測結果不受微滴擴增效率影響。陽性微滴與陰性微滴熒光信號差別大，圖譜分得很開，表明在同一個PCR反應體系（微滴）中可以同時檢測內、外源兩個目標序列，且本研究所確立的探針、引物、反應體系和反應條件等適于該品系內源基因和外源序列的擴增反應。

圖1 各微滴品系標準品DNA內源基因和品系特異序列擴增反應情況Fig.1 Amplification results of endogenous gene and event-specific boundary sequences of standard DNA in the droplets

為考察研究建立方法的穩定性，本研究特地重復進行3 次實驗，如圖1和表2所示。內參基因3 次重復實驗測的內源基因拷貝數分別為25.6、22.5和25.8，平均檢測拷貝數為24.63，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）僅為7.51%；品系特異序列3 次擴增反應所的拷貝數分別為7.69、8.86和8.77，平均檢測拷貝數為8.44，RSD僅為7.71%。可見，3 次重復實驗所得實驗結果非常一致，表明該新建立的定量檢測方法具有很好的穩定性。

表2 玉米VCO-01981-5定量方法穩定性檢測結果

Table2 Stability evaluation of the quantitative method for event

表2 玉米VCO-01981-5定量方法穩定性檢測結果Table2 Stability evaluation of the quantitative method for event VCO-01981-5 with droplet digital PCR

2.2 特異性檢測結果

應用本研究建立數字PCR方法對品系VCO-01981-5和其他25 種轉基因玉米、油菜、水稻、大豆、棉花、馬鈴薯品系基因組DNA進行擴增的結果如圖2所示。17 個轉基因玉米品系基因組DNA在HEX通道下都能檢測到熒光信號，而轉基因油菜、水稻、大豆、棉花、馬鈴薯品系基因組DNA均未檢測到熒光信號，表明17 個品系的玉米內源基因hmg都發生了擴增反應。在FAM通道下，僅陽性對照樣品VCO-01981-5品系DNA檢測到熒光信號，其余品系的基因組DNA均未檢出熒光信號，說明品系特異性邊界序列發生了擴增反應。以上結果表明本研究所建立方法特異性強。圖2顯示陽性微滴很多且與陰性微滴區分不開，這是樣品DNA用量太多的緣故。

圖2 VCO-01981-5品系特異性雙重數字PCR定量方法特異性檢測實驗結果Fig.2 Specificity evaluation of the quantitative method for event VCO-01981-5 event with duplex digital PCR

2.3 定量線性范圍測定結果

表3 玉米VCO-01981-5數字PCR定量方法的線性范圍測定結果Table3 Linear range evaluation of the quantitative method for event VCO-01981-5 with droplet digital PCR

應用本研究建立二重數字PCR方法測定不同用量模板DNA目標序列拷貝數的結果如表3所示。單位是每微升反應體系（共20 μL）所含目標序列的拷貝數，每個測定3 次重復，以計算平均拷貝數和RSD。從表3可以看出，在RSD不大于25%的情況下，玉米內源基因hmg可以定量到3.8 拷貝（0.19×20），轉基因玉米品系VCO-01981-5特異性序列可以定量到4.8 拷貝（0.24×20）。若以PCR模板DNA用量為橫坐標，每微升目標序列拷貝數為縱坐標繪制曲線，發現兩者呈線性關系。從樣品DNA用量與所測品系特異序列拷貝數之間的關系圖中發現在樣品用量50～0.08 ng范圍內，本研究方法測定品系特異序列的拷貝數與樣品用量呈高度正相關，相關系數達0.99以上，其擬合曲線方程為 y=4.673x－0.631 3，表明本研究方法品系特異序列的定量線性范圍在4.8～4 666.6拷貝之間，跨越了3 個數量級。從樣品DNA用量與所測內源基因拷貝數之間的關系圖中發現在樣品用量50～0.016 ng范圍內內參基因拷貝數與樣品用量呈現出良好的線性關系，相關系數達0.99以上，其擬合曲線方程為y=13.669x－2.311 5，表明本研究方法內源基因序列的定量線性范圍在3.8～13 646.6拷貝之間，跨越了4 個數量級。以上研究結果表明本研究建立的數字PCR方法定量范圍廣、定量精度高，結果重復性好。

2.4 LOQ驗證結果

從表3可以看出，品系特異性序列定量線性范圍下限的樣品DNA用量為0.08 ng。取0.08 ng樣品DNA進行10 次平行定量檢測，結果如表4所示，10 次平行定量的品系特異性序列平均拷貝數為4.8 個，RSD為24%，符合要求（小于25%）。內源基因LOQ驗證實驗取用樣品DNA量0.016 ng，10 次定量結果如表5所示，10 次平行定量的內源基因平均拷貝數為4，RSD為22.91%，符合要求（小于25%）。以上結果證實內源基因的LOQ為4 拷貝，品系特異性序列的LOQ為4.8 拷貝，表明本研究建立的轉基因玉米VCO-01981-5品系特異性定量方法靈敏度高。

表4 玉米VCO-01981-5品系特異性序列LOQ驗證結果Table4 Limit of quantitative analysis for event-specific sequence of event VCO-01981-5 with droplet digital PCR

表5 玉米內源基因hmg LOQ驗證結果Table5 Limit of quantitative analysis for endogenous gene of event VCO-01981-5 with droplet digital PCR

2.5 定量準確性分析結果

定量準確性的驗證往往用已知準確含量的標準品或構建的質粒DNA作為實驗材料。對于轉基因玉米，如果供試標準品為葉片等除種子以外的組織，100%質量百分含量的轉基因玉米標準品，如果是純合子，則拷貝數含量理論上也為100%；如果是雜合子，則拷貝數含量理論上僅為50%。玉米種子由胚、果皮、種皮和胚乳4 部分構成，前3 部分拷貝數含量與質量百分含量的關系同葉片組織一樣。玉米種子胚乳細胞是三倍體，如果胚乳細胞是雜合基因型，且其外源基因來源于父本，則胚乳細胞三倍體中只有一個拷貝的外源基因，這樣的胚乳細胞拷貝數含量僅有質量百分含量的1/3（33.3%）；如果外源基因來源于母本，則胚乳細胞三倍體中有兩個拷貝的外源基因，這樣的胚乳細胞拷貝數含量是質量百分含量的2/3（66.6%）。對于全部（100%質量百分含量）由轉基因玉米整粒種子制成的粉末狀標準品，如果胚乳細胞是雜合基因型，且其外源基因來源于父本，該標準品拷貝數含量取決于胚乳在整顆種子中所占的比例。如果胚乳占比越小或無，則拷貝數含量接近50%；如果胚乳占比越大，則拷貝數含量接近33%。因此，這種100%的外源基因源于父本的雜合型轉基因玉米種子拷貝數含量在33%～50%之間，而根據Corbisier[20]和Zhang[30]等的研究，這樣的玉米種子平均拷貝數含量為39%左右。

依標準品證書說明，本研究實驗材料VCO-01981-5標準品（100%）是玉米種子粉末，種子由轉基因父本和非轉基因母本雜交產生（F1代），表明其拷貝數含量為39%左右。該標準品7 種模板DNA用量測定的內、外源基因拷貝數見表3，其中5 個用量測定數據的RSD均小于25%，表明精確性較高。本定量準確性驗證采用同樣的實驗數據，計算拷貝數含量和定量檢測誤差，計算結果見表6。結果發現最低模板DNA用量（0.08 ng）因內、外源序列拷貝數測定的RSD值已近25%，拷貝數比值計算進一步放大了誤差，比值計算結果的RSD超過25%；其他4 次定量的誤差均在15%以內，4 次定量平均誤差僅為9.23%。如果根據定量方法線性范圍擬合曲線計算，這4 次定量結果的誤差同樣都小于15%，有的誤差甚至為0%，平均誤差只有8.76%。以上結果表明本研究建立VCO-01981-5品系數字PCR定量方法定量準確性高。

表6 玉米VCO-01981-5數字PCR定量方法定量檢測準確性分析結果Table6 Accuracy analysis for quantitative detection method of event VCO-01981-5 with droplet digital PCR

3 結 論

本實驗利用微滴式數字PCR技術建立了針對我國未批準的轉基因玉米品系VCO-01981-5特異性定量方法。數字PCR是一種近年發展起來的第3代先進定量檢測手段，除具備不需要制作標準曲線、定量結果不受PCR擴增效率等實時熒光PCR定量不具有的優勢外，本研究建立的二重ddPCR定量方法比單重微滴式數字PCR定量方法優勢明顯：其一，同一個微滴PCR反應體系在同時定量內源和外源兩個靶序列，比一次反應只定量一個靶序列更經濟和快速。其二，二重微滴式數字PCR定量結果不受樣品DNA用量和質量如降解等的影響，因為同一DNA樣品，由于降解是隨機發生的，同一樣品DNA不同用量之間內、外源基因的比例是不會改變的，所以定量結果更為精確和準確。二重微滴式數字PCR上述特點非常重要，不僅避免了單重ddPCR定量因二次取樣所產生的樣品內的誤差，也可以消除不同樣品DNA因取樣不一致而造成的樣品間的誤差，因而在操作上使樣品間的比較更為簡單。針對本研究建立方法各項指標考察發現，該定量方法穩定性好、特異性強、定量范圍廣、定量檢測靈敏度高，同時定量結果準確性高、重復性好，完全可以滿足當前和今后對該品系精準定量的實際需要。

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Quantitative Detection of Transgenic Maize Event VCO-01981-5 with Droplet Digital PCR

ZHANG Jialing1, PAN Guang2, ZHANG Guiming2, CHENG Yinghui2, XIANG Caiyu2, CHEN Zhinan3, XIE Zhongwen1,*, LING Xingyuan2,*
(1. State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, College of Tea and Food Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 2. Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center, Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen 518045, China; 3. Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine, Shenzhen5 18010, China)

In this paper, a duplex droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) method was developed to detect the content of unauthorized genetically modified (GM) maize event VC O-01981-5 based on a QX100 ddPCR platform. Towards this goal, PCR primers and TaqMan probes were designed based on the maize endogenous gene hmg and VCO-01981-5 event specific boundary sequences, and the probes were labeled with different chromophores so that the two targets could be detected in one single droplet. Analysis of the specificity of the method showed that both endogenous gene hmg and foreign sequence could be detected only in event VCO-01981-5. Moreover, the sensitivity, linearity and accuracy were evaluated and it was found that when relative standard deviation (RSD) was 25% or less,5 copies of boundary sequences and4 copies of gene hmg could be quantitatively detected, and the quantitative results (target copy) were highly correlated with the amount of DNA template up to 50 ng (R2≥ 0.99), with an average error of less than 10%. All the above results indicated that the established method in this study was very specific, stable, accurate and sensitive, and had a wide quantitative range in quantitative analysis of GM maize VCO-01981-5. Therefore, this method can be applied practically in quantitatively determining this GM maize event in imported and exported agricultural product and foods. Besides, this reported method can be used as a reference to establish a quantitative method for the detection of other GM maize events and GM events of other plants.

transgenic maize; event VCO-01981-5; droplet digital PCR; quantitative detection

47,ebook=254

10.7506/spkx1002-6630-201712038

S513

A

1002-6630（2017）12-0246-07

2016-07-26

公益性行業（質檢）科研專項（201410014-2）；深圳市基礎研究計劃項目（JC201105190969A）；國家質檢總局科技司項目（2009IK257）

張佳玲（1991—），女，碩士研究生，研究方向為轉基因產品檢測技術。E-mail：1030798546@qq.com

*通信作者：謝忠穩（1962—），男，教授，博士，研究方向為營養與代謝生物學。E-mail：zhongwenxie@ahau.edu.cn凌杏園（1964—），男，研究員，博士，研究方向為植物基因工程和分子生物學。E-mail：lxy6421@qq.com

張佳玲, 潘廣, 章桂明, 等. 微滴式數字PCR定量檢測轉基因玉米品系VCO-01981-5[J]. 食品科學, 2017, 38(12)：246-252. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712038. http：//www.spkx.net.cn

ZHANG Jialing, PAN Guang, ZHANG Guiming, et al. Quantitative detection of transgenic maize event VCO-01981-5 with droplet digital PCR[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 246-252. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712038. http：//www.spkx.net.cn