固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定動物源性食品中多種獸藥殘留

郝 杰，姜 潔,*，余建龍，路 勇，毛 婷，孫曉冬，楊麗梅

（1.北京市食品安全監控和風險評估中心，北京 100041；2.沃特世科技有限公司，北京 100026）

固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定動物源性食品中多種獸藥殘留

郝 杰1，姜 潔1,*，余建龍2，路 勇1，毛 婷1，孫曉冬1，楊麗梅1

（1.北京市食品安全監控和風險評估中心，北京 100041；2.沃特世科技有限公司，北京 100026）

利用通過固相萃取法結合超高效液相色譜-串聯質譜法建立同時檢測豬肉、魚、蝦等動物源性食品中磺胺類、喹諾酮類、糖皮質激素類、大環內酯類、β-受體激動劑類、類固醇激素類、四環素類、青霉素類、氯霉素類、頭孢菌素類10大類72 種獸藥殘留的分析方法。樣品經80%乙腈溶液提取，直接通過不經活化的Prime HLB固相萃取柱進行凈化。使用C18色譜柱分離，電噴霧離子源分段多反應監測掃描模式檢測，外標法定量。72 種獸藥定量限為0.5～5 μg/kg，各基質中回收率在75.6%～122.3%之間，相對標準偏差為0.6%～10.7%。本方法極大地提高了多殘留獸藥的檢測效率，適用于食品安全突發事件應急處置中多殘留獸藥的快速分析。

固相萃取；超高效液相色譜-串聯質譜法；獸藥多殘留；動物源性食品

隨著農業養殖科技水平的不斷提高，獸藥在畜牧業中的使用日趨廣泛。動物源性食品因消費量大，受眾范圍廣，其獸藥殘留受到人們普遍的關注。為保證食品安全，我國發布了多項法規以規范獸藥使用[1]，及明確動物源性食品中獸藥殘留的檢出限量等[2-3]。但是畜牧業中目前有近百種獸藥在使用[4]，其理化性質各異，大量的動物源性食品需進行獸藥殘留分析。國家標準方法多以化學結構類似的同族化合物進行方法開發[5-6]，對同一樣本無法做到在短時間內快速篩查多類獸藥殘留。相關多殘留檢驗方法也有報道[7-10]，陳剛等[11]開發了35 種獸藥殘留的多殘留檢測方法，Dasenaki等[12]開發了牛奶、黃油、魚、雞蛋中115 種獸藥的多殘留方法，Zhang Yaqian等[13]利用飛行時間質譜法研究了蜂王漿中90 種獸藥的檢測方法。在已報道的分析方法中，由于目標物極性分布寬泛，前處理技術多采用QuEChERS法[14-17]或吸附-洗脫模式的固相萃取法[18-21]，但這些方法依然有前處理步驟多、速度較慢，涵蓋基質范圍不寬等局限性。

本研究采用固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法對豬肉、魚、蝦等動物源性食品中10大類72 種獸藥進行測定，方法快速、穩定、定量限低，能夠滿足動物源性食品中多種類獸藥風險篩查及監測工作的需要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純） 美國Fisher公司；72 種獸藥標準品，其中包括16 種喹諾酮類、14 種磺胺類、9 種糖皮質激素類、7 種大環內酯類、7 種β-受體激動劑類、6 種類固醇激素類、4 種四環素類、4 種青霉素類、3 種氯霉素類、2 種頭孢菌素類（純度均大于95%），購自德國Dr.Erenstofer公司、加拿大Toronto Research Chemicals公司或美國Sigma Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

Xevo TQ-S三重四極桿質譜儀（配有Acquity UPLC超高效液相色譜儀及電噴霧離子源）、Oasis Prime HLB 200 mg/6 mL固相萃取柱 美國Waters公司；Thermo X1R高速冷凍離心機 美國Thermo Fisher公司；Milli Q超純水系統 美國Millipore公司；GM200刀式研磨儀德國Retsch公司；ENVI氮吹儀 美國OA公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

稱取適量標準品，分別用甲醇配制成1 000 μg/mL的標準儲備液，存放在－20 ℃環境中，在后續實驗中，根據實驗需要分別取適當量的儲備液，用甲醇稀釋成混合標準工作液。

1.3.2 樣品前處理

稱取2.5 g均質后的樣品于聚四氟乙烯離心管中，加入10 mL 80%的乙腈溶液，充分渦旋混勻后，超聲提取30 min，在10 000 r/min離心10 min，取5 mL上清液，以通過的形式經過不經活化的Prime HLB固相萃取柱，接收過柱后的樣液，取4 mL在45 ℃條件下用微弱N2氣流吹干，用1 mL 0.1%甲酸溶液-甲醇（90∶10，V/V）復溶殘渣，經0.22 μm濾膜過濾后，上機測定。

1.3.3 超高效液相色譜-串聯質譜條件

色譜柱：W a t e r s A c q u i t y B E H C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；流動相：A相為甲醇，B相為0.1%甲酸溶液；梯度洗脫程序：0～0.25 min，2% A，0.25～12.25 min，2%～99% A，12.25～13.00 min，99% A，13.00～13.01 min，99%～2% A，13.01～17.0 min，2% A；流速：0.45 mL/min；進樣量：10 μL。

質譜條件：采用電噴霧離子源；正負離子切換掃描；多反應監測掃描模式分段檢測（每個質譜掃描窗口為該化合物保留時間±0.5 min）；毛細管電壓0.80 kV，錐孔氣流量150 L/h；脫溶劑氣溫度450 ℃；脫溶劑氣流量800 L/h；霧化氣壓力7.0 bar。

2 結果與分析

2.1 超高效液相色譜-串聯質譜條件的選擇

用甲醇分別配制50 ng/mL的標準品，通過蠕動泵注入持續進樣，與適當流速的流動相共同進入質譜儀中。化合物進入電噴霧離子源后，均能夠形成穩定的加合離子，在一級質譜模式下，調節錐孔電壓使得母離子的豐度最大。開啟二級質譜后，逐漸增大碰撞能量，觀察記錄離子碎片，選擇相對豐度較高，出峰穩定的碎片，微調碰撞能量，使得碎片離子的豐度最大。

圖1 72 種獸藥的提取離子流疊加圖（a）及3 種磺胺類同分異構體化合物的色譜分離圖（b）bFig.1 Overlapping extracted ion chromatograms (XICs) of 72 veterinary drugs (a) and chromatograms of three sulfonamide isomers (b)

在已報道的文獻中[22-25]，對獸藥多殘留檢測中色譜柱的選擇有很好的優化，故在本研究中參考其結論，選用Waters BEH C18色譜柱對目標化合物進行分離，考察了甲醇、乙腈、0.1%甲酸溶液、甲醇（含1%1 mol/L pH 5.0乙酸銨），水（含1%1 mol/L pH 5.0乙酸銨）等不同流動相組成對分離效果的影響。結果表明，使用甲醇-0.1%甲酸溶液作為流動相可有效分離72 種目標化合物。其中，磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶等同分異構體也能達到良好的分離，如圖1所示。72 種獸藥的保留時間、定量、定性離子對、錐孔電壓和碰撞能量見表1。

表1 72 種獸藥保留時間及質譜參數Table1 Retention times and mass spectrometric parameters of 72 veterinary drugs

續表1

續表1

2.2 提取溶劑的選擇

甲醇和乙腈作為獸藥多殘留檢測最常用的提取溶劑[26-28]，本實驗考察了不同提取溶劑對目標化合物提取效率的影響，包括乙腈、0.1%甲酸-乙腈、80%乙腈溶液、甲醇。如圖2所示，首先使用酸化提取溶劑會對氯霉素、糖皮質激素等化合物的回收率造成較大影響。另外多組分獸藥的極性范圍較廣，結果表明使用純甲醇提取效率低于使用乙腈的提取液，但是采用純乙腈溶液提取，無法兼顧極性較大的獸藥（如西馬特羅、磺胺醋酰），加入水相調整提取液極性可以兼顧不同極性的目標物質，80%乙腈溶液具有較好的提取效率。另一方面由于后續步驟選用了直接通過凈化的固相萃取處理，如水相比例過高，則有可能導致目標化合物在固相萃取中吸附，且后續濃縮過程也可能收到影響。綜合以上因素考慮，使用80%乙腈溶液作為提取溶劑。

圖2 比較分析不同提取條件對目標化合物的影響Fig.2 Comparative effect of different extraction methods on recovery of target compounds

2.3 凈化策略的選擇

圖3 比較分析4種固相萃取柱對10 類化合物回收率的影響Fig.3 Comparison of average recovery of10 veterinary drugs using4 different SPE columns

72 種目標化合物極性不同，且適用于不同的固相萃取柱，為兼顧所有化合物，采用了極性吸附原理的固相萃取柱，使用通過策略進行固相萃取凈化，可以在去除磷脂，蛋白等雜質的同時，把凈化步驟對目標化合物的損失降至最小。prime HLB固相萃取柱是在HLB親水親脂平衡柱的基礎上，增加了對磷脂、蛋白等干擾物的凈化效果，同時改進了篩板使得不易造成堵塞[29]。選取了Waters Oasis HLB（200 mg/6 mL）、Waters Oasis prime HLB（200 mg/6 mL）和Dikma ProElut PLS（200 mg/6 mL）3 種常見的親水親脂平衡柱及Dikma ProElut C18（500 mg/6 mL）柱進行對比。圖3為使用不同固相萃取柱情況下，10大類化合物的平均回收情況。結果表明，使用prime HLB柱可有效降低雜質干擾，在相對比的情況下，可在喹諾酮類、青霉素類等化合物上達到更高回收率。

表2 豬肉、魚、蝦中72 種獸藥的線性范圍、曲線相關系數、定量限、基質效應、回收率及精密度數據Table2 Linear range, correlation coefficient, LOQ, matrix effect, recovery and precision data of 72 veterinary drugs in pork, fish and shrimp

續表2

2.4 方法學驗證

2.4.1 基質效應

選取豬肉、魚、蝦等常見動物源性食品基質進行了方法驗證。基質效應根據基質空白配制標樣響應值與同質量濃度溶劑標樣響應值的比值進行評價。基質效應大于1時為基質增強效應，小于1為基質抑制。對于基質效應過強的樣品，應采取相應的處理手段以減小其對測定的干擾。從實驗結果可以看出，基質對倍他米松、倍氯米松、泰樂菌素等化合物具有較強的基質抑制效應，而頭孢匹林、磺胺甲氧噠嗪、睪酮等化合物表現出基質增強效應，為消除基質效應帶來的影響，本方法采用基質加標標準曲線定量法。

2.4.2 標準曲線和定量限

在空白樣品中添加混合標準溶液，制備成分別為0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100 μg/kg的系列加標樣品不同系列水平的混合標準溶液，按前處理步驟處理后上機測定，按信噪比10∶1得到目標化合物的定量限。以質譜響應值為縱坐標，添加質量濃度為橫坐標，繪制基質加標工作曲線，得到本方法的線性范圍，回歸曲線方程及相關系數（表2）。

2.4.3 回收率和精密度

分別取豬肉、淡水魚、蝦空白樣品，根據定量限1、2、10 倍的質量濃度，添加低、中、高3 個不同水平的72 種獸藥混合標準溶液，進行前處理，測定目標化合物。每個水平進行6 次實驗，結果見表3，72 種化合物在豬肉中的平均回收率為77.9%～122.3%，相

對標準偏差為0.6%～10.4%；在淡水魚中平均回收率為76.5%～112.5%，相對標準偏差為0.9%～10.7%；在蝦中平均回收率為75.6%～117.8%，相對標準偏差為0.6%～10.2%。參考GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》的相關要求[30]，其精密度滿足殘留檢測的要求。

2.5 實際樣品測定結果

圖4 淡水魚樣品中檢出頭孢噻肟、恩諾沙星提取離子流圖Fig.4 XICs of fish samples containing enrofloxacin and ciprofloxacin

隨機選取市售淡水魚、蝦共計64 個。應用建立的方法對樣品進行72 種獸藥殘留的快速篩查，結果如圖4所示，在淡水魚樣品中檢出恩諾沙星（7.8 μg/kg）、頭孢噻肟（10.2 μg/kg）等藥物。

3 結 論

本研究采用通過固相萃取前處理，超高效液相色譜-串聯質譜技術，建立了豬肉、淡水魚、蝦中72 種獸藥多殘留快速檢測方法。本方法使用通過固相萃取法這一快速、簡便的前處理步驟，與標準方法及已有報道相比，可以省去了活化、淋洗、洗脫等傳統固相萃取法中較為耗時的步驟，極大地節約了樣品處理時間。經方法學驗證，該方法測定低限、回收率、精密度均滿足殘留檢測的要求，適用于豬肉、淡水魚、蝦等動物源性食品中十大類獸藥的快速篩查測定。

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Simultaneous Determination of Multi-Veterinary Drug Residues in Animal-Origin Food by Solid Phase Extraction Coupled with Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

HAO Jie1, JIANG Jie1,*, YU Jianlong2, LU Yong1, MAO Ting1, SUN Xiaodong1, YANG Limei1
(1. Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring, Beijing 100041, China; 2. Waters Technology Co. Ltd., Beijing 100026, China)

An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) with solid phase microextraction method was established for the simultaneous determination of 72 veterinary drugs including sulfanilamide, quinolone, glucocorticoid, macrolides, beta-agonist, steroid hormone, tetracycline, penicillin, chloramphenicol and beta-lactam in pork, fish and shrimp samples. Samples were extracted by 80% (V/V) acetonitrile in water, followed by cleanup of the extracts through a Prime HLB solid phase extraction column directly without activation. Separation was performed on a C18column and the eluates were detected by multiple reaction monitoring scanning with electronic spray ionization. An external standard method was applied for quantification. The limits of quantitation (LOQ) for 72 veterinary drugs were in the range of 0.5 to5 μg/kg. Recoveries from different food matrices were from 75.6% to 122.3% with relative standard deviations between 0.6% and 10.7%. This method was significantly efficient in the determination of multiple veterinary drugs and suitable for rapid multiresidual analysis of veterinary drugs in handling of food safety emergencies.

solid phase extraction; ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS); veterinary drug multiresidues; animal-derived food

10.7506/spkx1002-6630-201712041

TS207.3

A

1002-6630（2017）12-0266-07

郝杰, 姜潔, 余建龍, 等. 固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定動物源性食品中多種獸藥殘留[J]. 食品科學, 2017, 38(12)： 266-272.

10.7506/spkx1002-6630-201712041. http：//www.spkx.net.cn

HAO Jie, JIANG Jie, YU Jianlong, et al. Simultaneous determination of multi-veterinary drug residues in animal-origin food by solid phase extraction coupled with ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 266-272. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712041. http：//www. spkx.net.cn

2016-07-22

北京市科技計劃項目（Z161100000616007）

郝杰（1984—），男，工程師，碩士，研究方向為食品安全。E-mail：haojiecrab@126.com

*通信作者：姜潔（1972—），女，教授級高級工程師，博士，研究方向為食品安全。E-mail：jybjj2004@126.com