中草藥川貝母繁育技術(shù)研究進(jìn)展

胡章薇+熊芹+肖小君

摘 要：該文對名貴中草藥川貝母的人工有性繁育和無性繁育兩方面的研究進(jìn)行了總結(jié)，同時對目前川貝母繁育技術(shù)中存在的問題進(jìn)行了分析和探討，以期為川貝母的資源保護(hù)及開發(fā)利用提供一些參考。

關(guān)鍵詞：川貝母；繁育；研究進(jìn)展

中圖分類號 S567.231 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）11-0133-04

Research Progress on the Breeding Technology of Fritillaria cirrhosa D. Don

Hu Zhangwei et al.

（Neijiang Normal University，Neijiang 641100，China）

Abstract：The researches on artificial sexual reproduction and asexual breeding of Fritillaria cirrhosa D.Don were concluded. And the shortages in present raising technology were analyzed and discussed，offering references for resources protection and development of Fritillaria cirrhosa D.Don.

Key words：Fritillaria cirrhosa D.Don；Breeding；Research progress

川貝母（Fritillaria cirrhosa D.Don）是百合科貝母屬的多年生草本植物，其入藥成分為鱗莖，具有“止咳圣藥”之稱[1-2]。因其藥用價值高，中藥處方量巨大，近年來被無計劃盲目地采挖。又因貝母的生理因素及地理環(huán)境等條件的限制，其野生資源供不應(yīng)求，瀕臨枯竭，己被列入國家三級保護(hù)植物名單[3]。近幾年有關(guān)川貝母的資源可持續(xù)利用成為研究熱點(diǎn)，現(xiàn)就川貝母的人工有性繁殖以及組織培養(yǎng)等方面作一綜述，為其野生資源的保護(hù)和合理開發(fā)利用提供參考，也可為川貝母的人工栽培提供技術(shù)支持。

1 川貝母的有性繁殖技術(shù)

川貝母人工種植采用種子繁殖，川貝母種子扁平，呈倒三角狀卵形，棕黃色至淡棕黃色[4]。野生貝母地處高原，不易采集種子，在自然環(huán)境中川貝母種子的出苗率不高且整齊度也不理想[5]。其中種子休眠期長成為人工繁殖的主要阻礙，原因是貝母種子屬于混合休眠，萌發(fā)需要經(jīng)形態(tài)后熟和生理后熟[6]。

1.1 解除種子休眠 于婧等[6]人對川貝母種子休眠機(jī)制及層積作用效果進(jìn)行了研究，指出川貝母種皮無吸水障礙，川貝母種子存在形態(tài)后熟及發(fā)芽抑制物是種子休眠的主要原因，而通過層積作用可有效打破種子休眠機(jī)制。前人研究表明[6-7]通過18～7℃漸變溫層積處理180d后能使川貝母種子由原胚分化形成線形完全胚，進(jìn)而解除貝母種子的形態(tài)休眠。金蘭等[8]用低溫對川貝母種子進(jìn)行不同時間的處理，發(fā)現(xiàn)在3～5℃條件下，低溫處理3～5個月后種子內(nèi)的激素和酶發(fā)生變化，種子代謝體系開始活躍，從而解除休眠。溫度對已破除休眠機(jī)制的貝母種子發(fā)芽也有影響，胚發(fā)育的最適溫度在5～15℃，解除生理休眠的適宜溫度在20℃左右[9-10]。

馬永貴等[5]用不同濃度的生長素和赤霉素處理貝母種子，結(jié)果表明：生長素對貝母種子的形態(tài)后熟有較好的促進(jìn)作用，赤霉素對生理后熟有較好的促進(jìn)作用，運(yùn)用生長素、赤霉素綜合處理更有利于貝母種子休眠機(jī)制的解除。生長素對川貝母的胚發(fā)育有明顯的促進(jìn)作用，200mg/kg生長素處理，15℃下沙埋層積為最適條件，赤霉素解除川貝母生理休眠，濃度以250mg/kg效果最好。宋廷杰等[10]的研究表明使用40mg/kg的赤霉素對川貝母種子處理32h也可解除其生理休眠。

1.2 播種 生產(chǎn)上川貝母種子播種通常分為秋播和春播2種方式，且任何一種播種方式，種子都需完成后熟成胚[11]。種子在發(fā)芽的過程中呼吸活躍，宜播種于陰涼濕潤、水分充足穩(wěn)定、排水良好、富含腐殖質(zhì)、疏松的砂質(zhì)土壤。川貝母種子經(jīng)破除休眠機(jī)制后即可播種。劉潮等[12]人對秋播和春播分別進(jìn)行了研究，秋播應(yīng)先將川貝母種子層積處理6～8周，待種子胚形態(tài)基本發(fā)育完全即可播種，蓋土厚度應(yīng)2～3cm為宜，并覆以保溫、保濕材料；春播宜在4月中下旬，將當(dāng)年脫粒種子埋進(jìn)種子處理床，第二年解凍后，取出種子播種于大田。對于凍土前未成熟的種子，應(yīng)混以細(xì)土做防霉處理，積層于20cm深的處理床，種子積層厚度為10cm，種子層上蓋土10cm。劉翔等[13]對川貝母播種時的覆蓋物及其覆蓋厚度進(jìn)行研究，結(jié)果表明覆蓋物以牛糞腐殖土為基質(zhì)效果最好，牛糞腐殖土+草木灰次之，原土覆蓋最差。原因是原土經(jīng)澆水或大雨后土表自然形成一層殼，使貝母種子無法破土和正常生長。牛糞腐殖土疏松透氣，蓋度以1cm左右最為合適，而大棚生產(chǎn)中蓋土厚度最好不要超過1cm。

1.3 植株生長 馬靖等[14]以川貝母“樹兒子”期和“燈籠花”期植株為材料，設(shè)置蔭蔽度、棚高、遮陰網(wǎng)顏色3個因素，以不遮陰作為對照，研究了光照度對川貝母生長特性的影響。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大田栽培中川貝母“樹兒子”和“燈籠花”期不宜采取遮陰措施。伍燕華等[15]以4年生川貝母植株為實(shí)驗(yàn)材料，設(shè)置大旺肥、磷鉀肥、葉綠肥共3個不同的葉面肥水平，以清水為對照，研究了葉面肥對川貝母的保花、保果效應(yīng)。結(jié)果指出，在川貝母花期、果期噴施以磷、鉀無機(jī)元素為主，生長調(diào)節(jié)劑為輔的復(fù)合葉面肥無機(jī)元素和生長調(diào)節(jié)劑的復(fù)合型葉面肥，有利于提高川貝母的掛果率。鄧小紅等[16]研究表明利用黑色地膜對貝母播種床面進(jìn)行覆蓋，對川貝母種子發(fā)芽后種苗的長勢促進(jìn)作用明顯，黑色地膜起到調(diào)節(jié)土壤溫度、保濕、除去雜草的作用。

2 川貝母無性繁殖技術(shù)

2.1 鱗莖繁殖 川貝母的無性繁殖而言，通常有鱗莖繁殖和組織培養(yǎng)這2種方式。鱗莖分切成塊按100kg加0.5kg多菌靈處理，每25kg切塊盛于塑料編織袋中埋于沙質(zhì)壤土封存，常溫催芽數(shù)日，待芽長至1～2mm時，即可播種[17]。避免爛根和減少病蟲害，對上年種植過貝母的熟地，應(yīng)撒生石灰粉消毒[18]。將川貝母鱗莖按廂栽培，按株距約5cm，行距約8cm的標(biāo)準(zhǔn)種植，覆土約10cm[16]，種好后直接在床面覆黑膜并在黑膜兩側(cè)覆土固定。李龍秀[19]認(rèn)為在每年7—9月進(jìn)行川貝母鱗莖栽培較為合適。鄭軍等[20]研究表明川貝母種子在播種后第2年、3年繼續(xù)萌發(fā)，導(dǎo)致個體數(shù)量增加，作為種源，1a鱗莖可直接作為繁殖材料，而2a和3a的鱗莖作為繁殖材料，則應(yīng)在采收時進(jìn)行分級處理。川貝母鱗莖本身入藥且繁殖系數(shù)較低，且播種后種植2—3a才能采收，采摘年限長。為了快速獲得川貝母鱗莖藥材，越來越多的學(xué)者探索了組織培養(yǎng)的繁殖方式。

2.2 組織培養(yǎng) 利用組織培養(yǎng)的方法繁殖川貝母，相較于傳統(tǒng)的繁殖方法更能節(jié)省育苗用地、提高繁殖系數(shù)、縮短育苗周期、維持母種的優(yōu)良性狀。耿茂林等[21]認(rèn)為貝母鱗莖再生途徑中外植體表面直接生長出小芽或鱗莖，繁殖周期相對較短，適用于川貝母培育。朱丹妮等[22]研究表明，組培川貝母和商品藥用川貝母一樣具有相同的化學(xué)成分和生物堿種類，且降低了對人體有害元素的含量。陳敏等[23]研究結(jié)果表明，組織培養(yǎng)物的總生物堿含量是原種及市售川貝母的2～4倍，組培鱗莖與原種鱗莖的游離全蛋白圖譜完全一致。因此用組培川貝母代替野生川貝母供藥用是可行的，利用組培擴(kuò)大川貝母藥用資源將成為有效途徑。

2.2.1 外植體的選擇 前人研究表明，鱗片、莖段、葉片、針形幼苗等不同部位均可作為外植體[24-25]。王躍華等[24]研究發(fā)現(xiàn)：分化程度高、纖維化嚴(yán)重的莖段誘導(dǎo)率最低，葉的誘導(dǎo)率次之，針形幼苗的誘導(dǎo)率再次之，鱗片葉的誘導(dǎo)率最高。通過選擇出苗期（即第1齡期）、開花期（即第4齡期中期）和果實(shí)期（即第4齡期后期）3個不同時期的川貝母鱗片葉進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)：開花期和果實(shí)期鱗片葉較成熟且分化程度較高，在培養(yǎng)過程中完成脫分化的時間較長，外植體的啟動時間較長，但因鱗片葉中貯存的營養(yǎng)物質(zhì)較多，產(chǎn)生的再生鱗莖數(shù)目多、體積較大；出苗期鱗片葉外植體在培養(yǎng)過程中雖然完成脫分化的時間較短，外植體的啟動時間早，但再生鱗莖數(shù)目少，生長速度也較慢。李隆云等[26]研究表明鱗莖基部的愈傷組織誘導(dǎo)率最高。這可能與暗紫貝母鱗片葉基部靠近植株根部，細(xì)胞分化程度較鱗片葉其它部位細(xì)胞弱而使暗紫貝母鱗片葉基部的分生能力較強(qiáng)有關(guān)。

2.2.2 外植體的滅菌 川貝母消毒最終目的都是為了獲得無菌且具活力的外植體，張波等[27]先用自來水將鱗莖沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗干凈，濾紙吸干，然后無菌條件下用70%的乙醇浸泡1min，滅菌濾紙吸干，最后用0.1%的升汞浸泡消毒10min，無菌水沖洗5次。張振霞等[28]設(shè)置5組消毒處理，結(jié)果表明，以暗紫貝母鱗莖為外植體，先用流水沖洗2h，經(jīng)75%乙醇表面消毒后，用0.1%升汞處理8min，最后用無菌水清洗5次的效果最佳，污染率僅為7.5%。俞超等[29]認(rèn)為0.1%升汞處理后的污染率低于5%次氯酸鈉、10%雙氧水2種方法，且隨處理時間的延長而污染率呈下降趨勢，其中處理30min污染率最低。由于選取的外植體細(xì)胞較幼嫩，對消毒劑的抵御力較低，用升汞長時間除菌后的外植體在培養(yǎng)過程中易出現(xiàn)褐化、死亡的現(xiàn)象。王躍華等[30]認(rèn)為在川貝母除菌時加入300～500mol·L-1頭孢噻肟鈉能加強(qiáng)除菌效果，隨著頭孢噻肟鈉濃度的逐漸增高，川貝母的除菌率也隨之增高，其中以每次15d連續(xù)2次用濃度為500mol·L-1的頭孢噻肟鈉除菌效果最好。

2.2.3 培養(yǎng)基 蘇新[31]和馬吉義[32]在貝母組織培養(yǎng)過程中研究了9種培養(yǎng)基對貝母離體生長的影響，其中包括 MS、改良MS、white、Nitsch、Blaydes、ER、LS、N、和H培養(yǎng)基，其中以MS培養(yǎng)基的使用最廣泛，效果最佳，為貝母鱗莖組織培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基[21、33-34]，由此可知貝母的誘導(dǎo)以及增殖需要較大的離子濃度。蔡朝暉等[35]通過對暗紫貝母組織培養(yǎng)條件的研究后認(rèn)為使用液體培養(yǎng)基配合搖床，培養(yǎng)材料生長最快且生物堿含量最高。

2.2.4 激素 川貝母組織培養(yǎng)中的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)主要是細(xì)胞分裂素（6-BA、KT等）和生長素（2，4-D、NAA、IBA等）。細(xì)胞分裂素類物質(zhì)主要是促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大，誘導(dǎo)芽的分化。生長素類物質(zhì)主要是促進(jìn)細(xì)胞伸長、誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生，以及試管苗的生根。

2.2.4.1 愈傷組織的誘導(dǎo) 王躍華等[36]選擇生長健康長勢良好的組培再生川貝母鱗莖接種于濃度配比不同的6-BA和2，4-D的培養(yǎng)基中，45d后對愈傷組織誘導(dǎo)率和愈傷組織生長情況進(jìn)行統(tǒng)計。結(jié)果顯示：未添加任何激素的培養(yǎng)基中，愈傷組織誘導(dǎo)率為0，這可能是因?yàn)榇ㄘ惸竿庵搀w本身的內(nèi)源激素含量較低。在添加了外源激素的培養(yǎng)基中，愈傷組織誘導(dǎo)率均有不同程度增加，以MS+6-BA 1.0mol·L-1+2，4-D 0.5mol·L-1的培養(yǎng)基中愈傷組織誘導(dǎo)率最高且愈傷組織質(zhì)地致密。同時，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度的2，4-D能促進(jìn)愈傷組織的生長，高濃度的2，4-D抑制愈傷組織的生長，而過量的2，4-D對愈傷組織會產(chǎn)生毒害作用。張波等[27]結(jié)果表明NAA 1.2mol·L-1+6-BA 1.8mol·L-1的MS培養(yǎng)基中外植體愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)53.3%。王凱萍等[37]研究表明2，4-D 1.0mol·L-1+ NAA0.5mol·L-1+6-BA0.9mol·L-1的MS培養(yǎng)基為最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

2.2.4.2 不定芽的誘導(dǎo) 張波等[27]人以暗紫貝母新鮮鱗莖為外植體，在附加不同濃度配比6-BA和NAA的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行離體培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)NAA 1.2mol·L-1+6-BA 1.6mol·L-1的MS培養(yǎng)基中外植體不定芽誘導(dǎo)率最高，達(dá)73.3%，這與熊增芳[38]的研究結(jié)果6-BA 1.0mol·L-1+NAA 0.5mol·L-1組合最有利于鱗莖的分化，分化出的不定芽多且健壯有差異。馬吉義[32]同樣以暗紫貝母鱗莖作為外植體，結(jié)果表明，不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基配方為MS+NAA 2.0mol·L-1+6-BA 0.5mol·L-1。究其原因可能與外植體的產(chǎn)地或生長期有關(guān)系。

2.2.4.3 鱗莖的再生 一般來說貝母鱗莖再生途徑主要有3條：（1）誘導(dǎo)外植體形成愈傷組織，再由愈傷組織分化為不定芽，最后由不定芽形成新的小鱗莖；（2）誘導(dǎo)愈傷組織后愈傷組織內(nèi)特化的胚形細(xì)胞經(jīng)多次分裂發(fā)育成胚狀體，進(jìn)而由胚狀體形成小鱗莖；（3）外植體表面直接生長出小芽或鱗莖[21]。陳敏等[23]報道川貝母在一定激素配比的培養(yǎng)基上，再生鱗莖可不經(jīng)過低溫直接產(chǎn)生愈傷組織并進(jìn)一步分化成小植株。王躍華等[36]將長勢良好的川貝母愈傷組織，接入含外源激素6-BA、NAA和KT組合的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)45d后統(tǒng)計小鱗莖的誘導(dǎo)率，結(jié)果表明，當(dāng)NAA濃度一定時，KT對鱗莖的誘導(dǎo)效果優(yōu)于6-BA，誘導(dǎo)產(chǎn)生小鱗莖最佳培養(yǎng)基為MS+KT 3.0mol·L-1+NAA 0.3mol·L-1，誘導(dǎo)率為82.77%。

2.2.4.4 生根 王躍華等[36]以分化出的無根苗接入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，結(jié)果表明，NAA誘導(dǎo)植株生根的效果優(yōu)于IBA和IAA，0.5mol·L-1的KT不利于誘導(dǎo)植株生根，誘導(dǎo)無根苗生根的最佳培養(yǎng)基為MS+NAA0.3mol·L-1，生根率為83.20%。江明殊等[39]認(rèn)為川貝母最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.2mol·L-1+IBA0.2mol·L-1，培養(yǎng)30d后生根率為89.17%。陳敏等[23]的研究表明MS+NAA 2.0mol·L-1+KT 1.0mol·L-1+VB 4.0mol·L-1+海柯吉寧12.0mol·L-1這種多種激素協(xié)調(diào)的培養(yǎng)基可使鱗莖不經(jīng)低溫而產(chǎn)生根，并僅在此培養(yǎng)基上，才能由根誘導(dǎo)產(chǎn)生出愈傷組織，再由愈傷組織分化出鱗莖、芽和根，從而形成完整的植株。張振霞等[28]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在1/2MS培養(yǎng)基中添加NAA和IBA對暗紫貝母的生根均有促進(jìn)作用，其中1/2MS+NAA 0.5mol·L-1的培養(yǎng)基上生根率最高，根生長健壯且生根速率快。

2.2.5 培養(yǎng)條件 光照條件對川貝母鱗莖分化影響較大，在8h/d光照時間，2000Lx光照強(qiáng)度下，對川貝母鱗莖分化的效果最好；完全黑暗條件下，分化效果最差，不定芽個數(shù)少，且芽畸形[38]。在貝母組織培養(yǎng)過程中，經(jīng)低溫處理的休眠芽易萌發(fā)為胚狀體，研究發(fā)現(xiàn)低溫處理40d的胚狀體成苗率最高，這與細(xì)胞內(nèi)過氧化物同功酶的含量與表達(dá)有關(guān)[40]。同時外植體接種后先經(jīng)低溫處理48h后再進(jìn)行培養(yǎng)，可有效地抑制外植體內(nèi)多酚氧化酶（PPO）引起的褐變[41]。

3 展望

目前關(guān)于川貝母組織培養(yǎng)的研究大多是針對單一因素進(jìn)行試驗(yàn)，多因素及復(fù)因子共同影響的研究和探討極少。因此，可以通過對培養(yǎng)基的外源激素、光照強(qiáng)度、培養(yǎng)的溫濕度等方面綜合研究，來提高川貝母人工繁育速度、縮短生產(chǎn)周期、提高有效活性成分含量，以期早日實(shí)現(xiàn)工廠規(guī)模化生產(chǎn)。

川貝母的主要活性物是生物堿。國內(nèi)外對貝母生物堿的研究主要集中在提取分離方法，生理活性的評價，有效成分含量的測定上，對生物堿合成途徑的基本框架還不明確，缺乏中間體的證實(shí)[42]。未來研究方向應(yīng)該是進(jìn)一步補(bǔ)充和完善生物堿生物合成途徑及其網(wǎng)絡(luò)，將其與植物組織培養(yǎng)相結(jié)合，在培養(yǎng)基中添加有效前體，進(jìn)一步研究如何建立川貝母生物堿積累體系，實(shí)現(xiàn)目的產(chǎn)物大量積累，以期直接利用組培鱗莖代替部分用藥，緩解處方用藥供不應(yīng)求的現(xiàn)狀。

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（責(zé)編：徐煥斗）