七氟烷與高濃度氧對老年小鼠海馬caspase-3的表達及認知功能的影響

陳 玢 劉 偉 史志國 劉 濤 鄭 暉

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院麻醉科，北京 101149；2.國家癌癥中心/中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 腫瘤醫(yī)院麻醉科，北京 100021)

· 麻醉學與神經(jīng)科學 ·

七氟烷與高濃度氧對老年小鼠海馬caspase-3的表達及認知功能的影響

陳 玢1劉 偉1史志國1劉 濤1鄭 暉2*

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院麻醉科，北京 101149；2.國家癌癥中心/中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 腫瘤醫(yī)院麻醉科，北京 100021)

目的 探討七氟烷與高濃度氧對老年小鼠海馬半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的表達及認知功能的影響。方法 健康雄性C57/BL6老年小鼠(14月齡)33只，采用數(shù)字表法將其隨機分為3組：高濃度氧組(HO組，n=11)：吸100%(體積分數(shù))氧4 h；高濃度氧+七氟烷組(HS組，n=11)：吸100%(體積分數(shù))氧+2.5%(體積分數(shù))七氟烷4 h；對照組(Con組，n=11)：吸空氣4 h。24 h后采用Morris水迷宮法研究3組小鼠麻醉后連續(xù) 5 d找到平臺所用的時間(逃避潛伏期)和第5天去除平臺后，90 s內(nèi)穿過原平臺的次數(shù)。利用蛋白質(zhì)印記(Western blotting)法檢測小鼠海馬caspase-3的表達。結(jié)果 與Con組相比，HO組的caspase-3表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；HS組的穿越平臺次數(shù)降低(P=0.023)，caspase-3表達顯著增加(P=0.036)。結(jié)論 吸入100%(體積分數(shù))氧對老年小鼠認知功能無影響，2.5%(體積分數(shù))七氟烷與100%(體積分數(shù))氧同時吸入增加老年小鼠海馬caspase-3的表達，與老年小鼠產(chǎn)生認知功能障礙有關。

老年小鼠；認知功能障礙；七氟烷；氧氣；半胱氨酸蛋白酶-3

術后認知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction, POCD)是術后一種常見的合并癥。有研究[1]表明，七氟烷可以引起短暫的術后認知功能障礙。近期研究[2]表明，七氟烷可以誘導β淀粉樣蛋白(amyloid β,Aβ)形成，繼而激活半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)。Aβ在突觸前的積聚影響突觸前蛋白突觸素和突觸后蛋白(postsynaptic density protein -95,PSD-95)的表達，從而產(chǎn)生認知功能缺陷[3]。Ulue等[4]的研究表明吸入高濃度氧可以導致發(fā)育期腦細胞死亡，從而產(chǎn)生認知功能障礙，而吸入高濃度氧對成年腦細胞的作用還有待研究。本研究通過探討七氟烷和高濃度氧同時吸入對老年小鼠認知功能的影響，為防止術后認知功能障礙的發(fā)生提供思路。

1 材料與方法

1.1 動物選擇與分組

健康雄性C57/BL6老年小鼠33只，14月齡，體質(zhì)量200～300 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK(京)2011-0011。老年小鼠飼養(yǎng)在溫度控制在22 ℃～23 ℃且晝夜平分的屋子里，可隨意攝取標準鼠糧和水。采用數(shù)字表法將其隨機分為3組，高濃度氧組(HO組，n=11)：吸100%(體積分數(shù))氧4 h；高濃度氧+七氟烷組(HS組，n=11)：吸100%(體積分數(shù))氧+2.5%(體積分數(shù))七氟烷4 h；對照組(Con組，n=11)：吸空氣4 h。

1.2 麻醉方法

3組老年小鼠置于特制的麻醉箱內(nèi)，保持自主呼吸，用Datex-Ohmeda麻醉機進行吸入麻醉和吸氧，麻醉過程中用Datex-Ohmeda監(jiān)護儀連續(xù)監(jiān)測麻醉藥和氧濃度，用加熱墊將麻醉箱內(nèi)的溫度保持在(37.0±0.5) ℃。麻醉過程中3組的氣體流量保持一致且為4 L/min，七氟烷濃度達到2.5%時開始計時4 h。

1.3 行為學測試

采用Morris水迷宮進行測試。Morris水迷宮實驗裝置為一圓形水池，直徑100 cm，高50 cm，水深30 cm；池壁上以4個等距離點即東、南、西、北將水池平均分為4個象限，在西南象限中央離池壁25 cm處放置平臺(平臺與池壁、圓心距離相等)，平臺直徑9 cm，高29 cm，沒于水面下1 cm。每個象限池壁的中點為動物入水點，水池周圍設有參照物且保持不變。池壁為黑色，池水中加入鈦白粉至看不到平臺。水溫保持21 ℃～23 ℃，房間內(nèi)光照恒定。定位航行實驗歷時5 d，每天訓練4次，將小鼠分別從4個不同起始點面向池壁放入水中，限時90 s，記錄逃避潛伏期(小鼠找到平臺所用的時間)和游泳速度，取平均值為當天的測試結(jié)果。最后一次定位航行實驗結(jié)束后行空間探索實驗，去除平臺，然后取距離平臺最遠的那個點將小鼠放入水池中，記錄小鼠90 s內(nèi)穿越原平臺次數(shù)。

1.4 Western blotting檢測海馬caspase-3的表達

取海馬組織勻漿，離心后取上清液，經(jīng)BCA蛋白定量后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩悠分屑尤肷蠘泳彌_液，于沸水中煮10 min使蛋白變性；8%/10%(質(zhì)量分數(shù))十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白；電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；5%(質(zhì)量分數(shù))脫脂奶粉室溫封閉1 h,加入1：5 000稀釋的兔源的caspase-3抗體，4 ℃孵育過夜；次日1‰TBST洗滌3次×5 min/次，羊抗兔HRP標記的抗體室溫孵育1 h，1‰TBST洗滌3次×5 min/次，增強化學發(fā)光法(enhanced chemiluminescence,ECL)顯色，曝光。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

Morris水迷宮法記錄Con組、HO組和HS組小鼠的逃避潛伏期和第5天90 s內(nèi)穿越原平臺次數(shù)，見表1、圖1～3。與Con組相比，HO組和HS組的逃避潛伏期差異無統(tǒng)計學意義(P=0.875)，而HS組的穿越平臺次數(shù)顯著減少，3組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.041)。

表1 3組小鼠Morris水迷宮測試指標的比較

GroupDayEscapelatency/sPlatformcrossingnumbersConD158.24±20.19D244.17±28.70D337.08±30.82D432.80±24.81D534.15±22.303.64±3.01HOD169.15±21.55D253.26±26.29D344.71±29.99D437.76±25.11D542.14±25.103.08±2.07HSD166.48±11.86D259.11±8.26D364.21±27.97D451.30±8.36D549.33±9.561.2±0.79

Con:control; HO:high concentration of oxygen; HS:high concentration of oxygen+sevoflurane.

Western blotting法檢測caspase-3在小鼠海馬區(qū)域的表達。與Con組相比，HS組caspase-3的表達顯著增加。

圖1 3組小鼠逃避潛伏期的比較Fig.1 Comparison of escaping time among three groups

Con:control; HO:high concentration of oxygen; HS:high concentration of oxygen+sevoflurane.

圖2 3組小鼠穿越平臺次數(shù)的比較Fig.2 Comparison of amounts of crossing the platform among three groups

*P<0.05vsCon group,#P<0.05vsHO group，P<0.05 compared among three groups.Con:control; HO:high concentration of oxygen; HS:high concentration of oxygen+sevoflurane.

圖3 3組小鼠caspase-3表達Fig.3 Comparison of caspase-3 expression among three groups

*P<0.05vsCon group,#P<0.05vsHO group,P<0.05 compared among three groups. Con:control; HO:high concentration of oxygen; HS:high concentration of oxygen+sevoflurane.

3 討論

1955年，Bedford[5]首次報道了POCD,他對5年內(nèi)1 193例全身麻醉后老年病人進行回顧性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，接近10%的老年病人術后存在認知功能障礙。1982年，Savageau等[6]首次發(fā)現(xiàn)了POCD、手術和麻醉之間的聯(lián)系。POCD的發(fā)生率取決于手術類型、年齡、術前并存疾病和術前認知功能的情況。目前，POCD的國際研究組織對實施非心臟手術的1 218位老年病人進行了國際上最大的關于POCD的多中心研究。研究[7]表明，術后1周的發(fā)生率為26%，術后3個月為10%，術后兩年為1%。相反，利用體外循環(huán)實施心臟手術的病人術后1周的發(fā)病率為53%，之后5年的發(fā)病率仍然為42%。POCD的發(fā)病率如此之高，引起學術界的廣泛關注。有研究[8]表明老齡是POCD發(fā)生的獨立危險因素，本研究正是使用老年小鼠，從動物行為學、海馬區(qū)域蛋白質(zhì)表達水平兩方面，分別運用Morris水迷宮法和Western blotting法探討七氟烷和高濃度氧相互作用對老年小鼠認知功能的影響。

現(xiàn)在普遍認為細胞凋亡是一系列高度調(diào)控的半胱氨酸蛋白酶(caspase)級聯(lián)反應事件的結(jié)果, caspase- 3被證實處于該級聯(lián)反應的下游, 它通過降解細胞內(nèi)相應底物使細胞死亡,其他下游的caspase 成員可能是凋亡事件的真正執(zhí)行者。β位淀粉樣前蛋白(amyloid precursor protein，APP)是一種廣泛存在于各類細胞的單鏈跨膜糖蛋白, 它可以被caspase-3 剪切, 其蛋白水解產(chǎn)物聚合形成Aβ, Aβ不但出現(xiàn)在老年斑內(nèi), 而且還可誘導caspase-3 激活, 促使細胞發(fā)生凋亡, 因此推測caspase-3 可能與POCD 的發(fā)生有關。有研究[2，9]表明，異氟烷、七氟烷都可以誘導Aβ形成，繼而激活caspase-3。本研究正是采用caspase-3來反應POCD的發(fā)生。

七氟烷是目前臨床中最常用的吸入麻醉藥，而且與異氟烷相比，七氟烷有較小的毒性，并且有研究[10]已經(jīng)顯示七氟烷可以激活特定的酶繼而引起tau蛋白的磷酸化產(chǎn)生認知功能障礙，也有研究[11]顯示七氟烷使C/EBP同源蛋白和caspase-12的表達增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應從而引起老年鼠神經(jīng)元細胞凋亡、神經(jīng)退行性變和認知功能缺陷。本研究表明七氟烷與高濃度氧同時吸入時，老年小鼠海馬caspase-3的表達水平顯著增多，認知功能降低。這表明七氟烷引起的認知功能缺陷與細胞凋亡有關。但也有研究[12]表明實施4 h的七氟烷麻醉不會影響成年鼠和老年鼠的獲得性學習記憶力，這有可能是由于使用的七氟烷濃度不同而導致的。之前有研究[13]表明七氟烷引起的短暫認知功能損傷是呈劑量依賴性的，與正常0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液組相比，1.5%(體積分數(shù))七氟烷麻醉后認知功能無改變，而3%(體積分數(shù))七氟烷麻醉后認知功能顯著降低。

七氟烷可以引起細胞凋亡及認知功能缺陷，同時高濃度氧引起機體的氧化應激、影響腦內(nèi)平衡、導致腦細胞壞死，兩者同時吸入時，筆者推測也許產(chǎn)生協(xié)同作用。本研究結(jié)果表明，七氟烷與高濃度氧同時吸入時，增加海馬caspase-3的表達水平，且產(chǎn)生認知功能損傷。Chen等[11]的研究比較了單純吸入21%(體積分數(shù))氧和七氟烷與高濃度氧同時吸入的成年與老年大鼠的認知功能，結(jié)果表明七氟烷與高濃度氧同時吸入時產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應，C/EBP同源蛋白和caspase-12的表達增加，神經(jīng)元細胞凋亡、神經(jīng)退行性變和認知功能缺陷。還有研究[13-15]表明3%(體積分數(shù))七氟烷與氧同時吸入時，通過抑制海馬M1型乙酰膽堿受體mRNA的表達，從而引起短暫的認知功能障礙。以上研究得到的認知功能缺陷的結(jié)果與本研究是一致的，但所測因子不同，說明七氟烷與氧同時吸入所導致的認知功能缺陷機制是復雜的，還需要更全面的實驗才能完全闡明。

本研究發(fā)現(xiàn)七氟烷和高濃度氧同時吸入可以使老年小鼠認知功能降低，但本研究仍存在一些局限性。首先，僅研究了七氟烷與高濃度氧同時吸入對認知功能的影響，在未來的研究中還需要考慮七氟烷與不同濃度氧，不同濃度七氟烷與相同濃度氧同時吸入對認知功能的影響。其次，由于時間原因，僅研究了七氟烷和高濃度氧同時吸入對老年小鼠短期認知功能的影響，未來還需要進一步的實驗決定對長時程認知功能的影響。

[1] Peng S H, Zhang Y, Li G J, et al. The effect of sevoflurane on the expression of M1 acetylcholine receptor in the hippocampus and cognitive function of aged rats[J]. Mol Cell Biochem, 2012, 361(1-2):229-233.

[2] Dong Y, Zhang G, Zhang B, et al. The commoninhalationalanestheticsevofluraneinducesapoptosis and increasesbeta-amyloid protein levels[J]. Arch Neurol, 2009, 66(5):620-631.

[3] Ripoli C, Piacentini R, Riccardi E, et al.Effects of different amyloid β-protein analogues on synaptic function[J].Neurobiol Aging,2013,34(4):1032-1044.

[4] Uluc Y, Semra H K, Abdullah K, et al. Hyperoxic exposure leads to cell death in the developing brain[J]. Brain Dev,2008,30:556-562.

[5] Bedford P D. Adverse cerebral effects of anaesthesia on old people[J].Lancet,1955, 269(6884):259-263.

[6] Savageau J A, Stanton B A, Jenkins C D，et al. Neuropsychological dysfunction following elective cardiac operation. II. A six-month reassessment[J].J Thorac Cardiovasc Surg,1982, 84(4): 595-600.

[7] Jungwirth B, Zieglg?nsberger W, Kochs E, et al. Anesthesia and postoperativecognitivedysfunction (POCD)[J].Mini Rev Med Chem,2009, 9(14): 568-579.

[8] Monk T G,Price C C. Postoperative cognitive disorders[J].Current Opinion Critical Care,2011, 17:376-381.

[9] Pan C, Xu Z, Dong Y, et al. The potential dual effects of anesthetic isoflurane on hypoxia-induced caspase-3 activation and increases in β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme levels[J].Anesth Analg, 2011, 113(1):145-152.

[10]Le Freche H, Brouillette J, Fernandez-Gomez F, et al. Tau phosphorylation and sevoflurane anesthesia: An association to postoperative cognitive impairment[J].Anesthesiology,2012, 116 (4):779-787.

[11]Chen G, Gong M, Yan M, et al. Sevoflurane induces endoplasmic reticulum stress mediated apoptosis in hippocampal neurons of aging rats[J].PLoS One,2013, 8(2):e57870.

[12]Callaway J K, Jones N C, Royse A G, et al. Sevoflurane anesthesia does not impair acquisition learning or memory in the morris water maze in young adult and aged rats[J].Anesthesiology, 2012, 117 (5): 1091-1101.

[13]Peng S H, Zhang Y, Sun D P. The effect of sevoflurane anesthesia on cognitive function and the expression of Insulin-like Growth Factor-1 in CA1 region of hippocampusin old rats[J].Mol Biol Rep,2011,38(2): 1195-1199.

[14]邱爽, 董有靜,段麗芳,等.七氟烷與異丙酚對老年肺癌患者局部腦氧飽和度及術后早期認知功能的影響[J].中國醫(yī)科大學學報，2016，45(9):797-800，817.

[15]王宇恒， 成永霞,焦晶華,等.大鼠妊娠前后吸入異氟烷或七氟烷對子代腦發(fā)育的影響[J].中國醫(yī)科大學學報，2015,44(2):143-147.

編輯 慕 萌

Impact of sevoflurane and high concentration of oxygen on expression of caspase-3 and cognition of aged mice

Chen Bin1, Liu Wei1, Shi Zhiguo1, Liu Tao1, Zheng Hui2*

(DepartmentofAnesthesiology,BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101149,China; 2.DepartmentofAnesthesiology,NationalCancerCenter/CancerHospital,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100021,China)

Objective To investigate the impact of sevoflurane and high concentration of oxygen on expression of caspase-3 and cognitive function of aged mice. Methods Thirty three healthy male C57/BL6 elderly mice (14 months) were randomly divided into three groups: group of high concentration of oxygen (HO group,n=11): inhaling 100% oxygen for 4 h; high concentration of oxygen + sevoflurane group (HS group,n=11): taking in 100% oxygen with 2.5% sevoflurane for 4 h; control group (Con group,n=11): taking in air for 4 h. Cognitive function in the elderly mice was tested in the Morris water maze. Western blotting is used to test the expression of caspase-3 in hippocampus. Results Compared with Group Con, Group HO saw no difference in numbers of crossing the platform and Caspase-3 expression. Group HS crossed the platform less (P=0.023)，and the caspase-3 expression of the group increased significantly(P=0.036).Conclusion Inhaling 100% oxygen had no impact on cognitive function in the elderly mice;Inhaling 2.5% Sevoflurane with 100% oxygen could increase expression of caspase-3, and it had close relations with the cognitive dysfunction of the aged mice.

elderly mice; cognitive dysfunction; sevoflurane; oxygen; caspase-3

國家自然科學基金(81371202)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China(81371202).

時間：2017-06-09 17∶07 網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20170609.1707.002.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.03.004]

R614

2017-03-20)

*Corresponding author， E-mail：zhenghui0715@hotmail.com