水溫及密度對皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai）幼蟲運輸存活率和變態率的影響

胡冰，米成志，閆喜武，吳富村，張國范

（1.大連海洋大學農業部北方海水增養殖重點實驗室，遼寧大連116023；2.獐子島集團股份有限公司，遼寧大連116001；3.中國科學院海洋研究所中國科學院實驗海洋生物學重點實驗室，山東青島266071；4.中國科學院海洋研究所海洋生態養殖技術國家地方聯合工程實驗室，山東青島266071）

水溫及密度對皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai）幼蟲運輸存活率和變態率的影響

胡冰1，米成志2，閆喜武1，吳富村3，4，張國范3，4

（1.大連海洋大學農業部北方海水增養殖重點實驗室，遼寧大連116023；2.獐子島集團股份有限公司，遼寧大連116001；3.中國科學院海洋研究所中國科學院實驗海洋生物學重點實驗室，山東青島266071；4.中國科學院海洋研究所海洋生態養殖技術國家地方聯合工程實驗室，山東青島266071）

本研究以皺紋盤鮑3日齡幼蟲為實驗材料，開展不同運輸水體溫度和幼蟲密度對運輸后幼蟲存活率和變態率影響的研究。實驗采用雙因子實驗設計，設置3個溫度梯度（分別13、16和20℃），每一溫度梯度下設置4個幼蟲運輸密度梯度（分別為50、100、150和200個幼蟲/ml），共12個實驗處理，每個處理均設置3個重復組；同時研究了高密度幼蟲運輸條件下水體溶氧的變化。實驗結果表明溫度因子、密度因子以及兩者的交互作用均對皺紋盤鮑幼蟲的存活率和附著率有極顯著影響（P＜0.001），且多重比較表明在條件為水溫為16℃，密度為150幼蟲/ml下，是最適宜皺紋盤鮑幼蟲的運輸。本實驗同時揭示12 h運輸時間內皺紋盤鮑3日齡幼蟲具備能耐受低氧水體環境能力（溶解氧DO＜2 mg/L）。本研究為皺紋盤鮑異地采苗、人工養殖提供參考，也在皺紋盤鮑幼蟲增殖放流等領域具有應用價值。

皺紋盤鮑；水體溫度；幼蟲密度；幼蟲運輸

皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai Ino），是一種經濟價值和營養價值非常高的海產經濟貝類，自然分布于我國的遼東和山東半島以及朝鮮半島和日本東北部海區（呂端華，1978），在我國是主養貝類之一。近年來隨著雜交技術的應用推廣以及淺海養殖模式的興起（Zhang et al，2004），我國皺紋盤鮑年產量增加迅速，據統計2013年我國鮑的年產量已近11萬噸（中國漁業年鑒，2014），其中除養殖產量較小的雜色鮑（Haliotis diversicolor）等外，鮑養殖品種以皺紋盤鮑為主。皺紋盤鮑不同地理種群間雜交技術尤其是中國大連-日本巖手這一強雜優組合的發現與應用推廣使得傳統的遼魯養殖海區擴展到南方海區的閩粵海區，鮑養殖產業已成為覆蓋全國的全局性產業（Wu et al，2013）。

隨著鮑養殖產業的擴展，不同養殖產業鏈的細化分工也逐漸在產業中得以發展。不同于其他養殖貝類，皺紋盤鮑的人工繁育需要大約100天的人工促熟以及復雜、規范的催產設施包括嚴格的控溫裝置、紫外線照射海水裝置以及催產孵化缸等，生產單位一般在這一生產環節投入較大。近年來，隨著對牡蠣、鮑等幼蟲生物學的研究，幼蟲遠距離運輸以及異地附著、采苗技術也見諸報導。如Davekia等（2000）報導了運輸時間以及水溫對運輸牡蠣Crassostrea iredalei幼蟲存活率和附著率的影響，發現運輸時間、水溫及兩者的交互作用均顯著影響牡蠣幼蟲的存活率和附著率（P＜0.05）。在鮑科動物中也有報導幼蟲運輸的研究，如Tong等（1987）和Schiel（1991）報導了新西蘭虹彩鮑Haliotis iris不同運輸方式以及運輸密度對幼蟲存活率和變態率的影響；Preece等（1997）報導了應用干露方法運輸澳洲黑唇鮑H.rubra和綠唇鮑H.laevigata的實驗研究；Pereira等（2007）報導了美國紅鮑H. rufescens在3種運輸方法下即自然海水方法、充純氧海水方法以及干露充純氧方法下紅鮑幼蟲存活及附著變態率，發現3種方法均可得到較高的幼蟲存活及附著變態率，因此該項具有產業應用價值。在皺紋盤鮑中也有幼蟲運輸的報導，如Kurita等（1978）究了皺紋盤鮑幼蟲在干露充純氧方法下運輸4 h后存活率達85%；Kawamura等（1998）報導皺紋盤鮑幼蟲運輸5 h后存活率可達100%（表1）。然而上述報導對于皺紋盤鮑幼蟲長距離運輸來說，一是在高強度運輸方法比如長時間、高密度等運輸參數優化方面上缺乏報導，相關研究在運輸密度方面應用的參數較弱，無法滿足當前我國鮑魚養殖產業的發展需求；二是缺乏運輸水溫及幾個因子互作對皺紋盤鮑幼蟲存活率的影響的報導，三是現有報導僅針對相關參數對幼蟲運輸后存活率影響，而缺乏對后期面盤幼蟲附著變態率的相關數據。

本研究在我國皺紋盤鮑養殖背景下，針對高密度運輸方法，開展不同運輸水體溫度和幼蟲密度對皺紋盤鮑幼蟲存活率和附著率的研究，考慮到現階段遠距離運輸方式的便利，無論南北方皺紋盤鮑苗種培育廠家均可通過水車、空運等方式在12 h內運至，因此本研究運輸時間界定為12 h。本研究以期對我國的鮑魚人工養殖產業尤其是人工繁育后異地幼蟲附著技術有所指導。

表1 在鮑科動物中有關幼蟲遠距離運輸后存活率、變態率的研究報導

1 試驗材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用皺紋盤鮑幼蟲來自中國科學院海洋研究所位于青島嶗山的實驗基地。2014年4月份，在青島嶗山基地，利用人工促熟后的青島嶗山海區圍堰外野生皺紋盤鮑作為種鮑進行人工催產，父母親本數目分別為15、45。種鮑經陰干、紫外線照射海水和升溫水刺激后分別排放精子和卵子，將收集后的精卵進行人工授精后于20℃海水中進行孵化，人工授精后約14 h后膜內擔輪幼蟲破膜孵化，將孵化后的幼蟲轉移至20 L幼蟲培育缸中，培育水溫保持在20℃、密度為20個幼蟲/ml，每6～8 h用100 μm換水器換水1次直至授精后第3天為止。

人工授精后第3天，皺紋盤鮑幼蟲發育至后期面盤幼蟲，此時利用這些幼蟲作為實驗材料進行不同溫度和密度下運輸的模擬實驗。

1.2 實驗設計

本實驗采用雙因子實驗設計，分別設置3個運輸水溫梯度，分別為13、16和20℃；每一溫度下分別設置4個幼蟲運輸密度，分別為50、100、150和200個幼蟲/ml。每1溫度、每1幼蟲運輸密度均設置3個重復組。

每1個重復采用容量為50 L雙層塑料袋運輸皺紋盤鮑幼蟲，采用常規的移液管方法進行幼蟲定量，分別用2 ml移液管取5個樣品以上進行幼蟲定量，如50 ml密度組的幼蟲數量應為50× 1 000ml×50個/ml=250萬。根據實驗設計本研究共使用50L雙層塑料袋共計36個。

實驗中對運輸溫度的維持采用將裝有不同密度幼蟲的雙層塑料袋置于循環流水水浴槽中，以保持實驗過程中溫度的恒定。實驗中特別注意每個雙層塑料袋需裝滿幼蟲海水后將所有空氣趕出，然后扎緊袋口以保持相同狀態，以防留有不同數量的空氣對實驗結果產生影響，按上述本研究運輸時間定為12 h。

為進一步分析高密度運輸條件下水體溶解氧（DO）的變化，分析幼蟲高密度運輸條件下存活率與水體溶氧耐受關系，本實驗又采用YSI 556 plus水質綜合測定儀（美國YSI公司，西雅圖）測定了0、4、8和12 h時16℃水溫條件下幼蟲密度為100、150和200個的在溶解氧（DO）。為防止溶氧常規測定運輸袋開啟對水體溶氧的影響，本研究在實驗開始時（0 h）將YSI 556 plus探頭放置于運輸袋中，每4 h讀數，因實驗條件有限，該項研究設置重復1次。同時同法監測16℃下以常規培育方法下（幼蟲培育密度為10幼蟲/ml、微充氣培育方式）水體溶解氧（DO）水平作為對照組。

1.3 實驗數據采集及分析

實驗結束后分別將不同處理組幼蟲轉移至開口充氧的60 L塑料桶內，然后將所有塑料桶置于18℃水浴槽中培育1 h后，每組重復處理5 ml取樣3次，然后將稀釋后的含有幼蟲樣本放置于解剖鏡下進行人工觀測，以分辨出死亡（包含畸形）和存活個體，將3次樣品抽樣后計算的平均存活率作為該重復處理組運輸后幼蟲存活率，因此每組重復組僅1個觀測值。

對于附著變態率的測定如下：采用Ebert等（1984）方法，取置于60 L塑料桶浮游狀態下的每組幼蟲定量后隨機抽取約6 400個幼蟲分別放置于20 L透明塑料水族箱中，該水族箱規格為長方體，底面積約3 200 cm2，因此在測定幼蟲附著變態率實驗中保持幼蟲密度為2個/cm2。同樣，每個溫度、密度組含3組重復，每個水族箱在實驗前一周進行底棲硅藻的接種于培養，以便在實驗期間誘導幼蟲的附著變態，每個水族箱均隨機選取、保持相同狀態。實驗期間海水溫度維持19～20℃。人工授精后第6天，采用抽樣的方法每個水族箱選取10 cm2樣方共計3個，觀測變態完成具有次生殼的稚鮑數目，將3次樣方計算的平均數量與起始放置幼蟲數量（6 400個）的比率作為該重復處理組幼蟲變態率，同樣每組重復組僅1個觀測值。

將獲得的存活率及變態率百分比數值進行平方根的反正弦轉換，以增加數據的正態和方差齊性。采用具有重復資料的雙因素交互方差分析，采用Duncan檢驗以分析不同交互組合的多重比較。顯著性設置為P＜0.05。統計分析過程采用R軟件。

2 結果

2.1 幼蟲運輸后存活率表現

不同溫度、密度下幼蟲的存活率表現見表2。從表2可見，皺紋盤鮑幼蟲在低溫度組如13、16度下具有較高存活率（94%～99%），而在高溫度下20度表現較差；在不同密度組中低密度下具有較高存活率，如50、100、150幼蟲/ml的密度下具有較高存活率（82.00%～99.12%），而在密度為200幼蟲/ml下表現相對較差（54.18%～87.91%）。

表2 不同溫度、密度下皺紋盤鮑幼蟲的存活率表現

經雙因素方差分析結果（表3）表明，無論是溫度因子、密度因子還是兩者的交互作用均對皺紋盤鮑幼蟲的存活率有極顯著影響（P＜0.001）。

表3 不同溫度、密度下皺紋盤鮑幼蟲的存活率的方差分析

采用R的程序包HH分析溫度、密度因子對幼蟲存活率影響的主效應和交互作用，以及通過Duncan檢驗不同因子組合的多重比較。從表2中可以看出16℃下50～150幼蟲/ml密度下存活率表現最優，且16℃下3個密度梯度下存活率間差異不顯著（P＞0.05）。

2.216 ℃條件不同幼蟲密度運輸過程水體溶解氧（DO）的變化

圖1所示YSI 556plus監測16℃條件、100、150和200幼蟲/ml密度下水體溶解氧（DO）的變化，與常規培育方法下培育水體溶解氧對照組相比，各密度梯度（100～200幼蟲/ml）在初始運輸4h內溶氧均發生顯著下降，自6.5 mg/L迅速下降至2～3 mg/L水平，而后溶氧水平仍發生緩慢下降至1～2 mg/L；高密度組水體溶氧水平在運輸過程各監測時間點均低于低密度組，因樣品數少原因，本研究未進行差異顯著性檢驗。

2.3 幼蟲運輸后第3天附著變態率表現

圖1 皺紋盤鮑幼蟲在16℃下、100、150和200幼蟲/ml密度下水體溶解氧（DO）的變化（Control為常規密度10幼蟲/ml下水體溶氧）

不同溫度、密度下幼蟲運輸后第3天的附著變態率表現見表4。從表4可見，皺紋盤鮑幼蟲在低溫度組如13、16℃下具有較高附著變態率（45.84%～63.88%），而水溫在20℃的情況下，密度為50、100幼蟲/ml的變態率較高，而密度為150、200幼蟲/ml的時候附著變態率較低；在不同密度組中低密度下具有較高的變態率，而高密度組變態率較低。

表4 不同溫度、密度下皺紋盤鮑幼蟲運輸后第3天附著變態率的表現

經雙因素方差分析結果（表5）表明，無論是溫度因子、密度因子還是兩者的交互作用均對皺紋盤鮑幼蟲運輸后第3天附著變態率有極顯著影響（P＜0.001）。

表5 不同溫度、密度下皺紋盤鮑幼蟲運輸第3天后變態率的方差分析

經R的程序包HH分析溫度、密度因子對幼蟲附著變態率影響的主效應和交互作，以及通過Duncan檢驗不同因子組合的多重比較。從表4中可以看出16℃下密度為150、200幼蟲/ml和20℃下密度為100幼蟲/ml的情況下，皺紋盤鮑運輸第3天后附著變態率變現最優，且三者間差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

3.1 溫度的影響及對皺紋盤鮑幼蟲運輸的應用意義

皺紋盤鮑幼苗在低溫度組如13、16℃下具有較高存活率，因此降低運輸溫度是提高皺紋盤鮑幼苗的重要措施之一，這可能是由于鮑魚是變溫海洋動物，低溫條件下生理代謝水平降低，可減少鮑魚幼苗對氧氣的消耗和代謝產物對水質的污染。根據本實驗研究過程的觀察，發現在高水溫（20℃）組運輸下的鮑魚幼蟲相較于低水溫組其行為如下差別：幼蟲更多的沉集于運輸袋的底部，在運輸后充氣后更加困難的分散開；水體中有更多的懸浮的肉眼可見的雜質。對于這種現象，有報導表明在高強度（如高密度梯度下）運輸貝類幼體向海水中不斷釋放有機物，同時也有可能有弧菌（Vibrio spp.）的增殖提供了條件，因此在低溫情況下鮑魚幼蟲機體代謝速度變慢，水體有機物質含量低，弧菌水平也相對較大，增加了幼蟲的存活率（Roberts，2001）。本實驗發現，水溫在13～16℃時，皺紋盤鮑幼苗的存活率最高，因此可以認為，13～16℃是皺紋盤鮑幼苗運輸的較佳溫度范圍。

3.2 密度的影響及對皺紋盤鮑幼蟲運輸的應用意義

皺紋盤鮑幼苗在50、100、150幼蟲/ml的密度下運輸具有較高存活率，而在200幼蟲/ml的密度下運輸，存活率顯著減少（表2），從實驗結果中可以認為密度在50～150幼蟲/ml是皺紋盤鮑幼苗適宜的運輸密度范圍。本實驗所設置的運輸幼蟲密度梯度與已發表文獻比較，其強度均顯著高于已開展研究（表1），如在虹彩鮑H.iris中運輸密度僅為12.5～20/ml，在美國紅鮑H.rufescens中幼蟲運輸密度為50/ml，即使是在與本研究相同物種皺紋盤鮑H.discus hannai中幼蟲運輸密度也仍然很低，為10幼蟲/ml。本研究采用50～200幼蟲/ml運輸密度條件，除在200幼蟲/ml條件參數下幼蟲運輸后存活率及6日齡變態率較差外其余參數均取得較好結果（表2、表5）。究其原因，從本研究在實驗過程中運輸水體溶解氧變化水平看，皺紋盤鮑幼蟲在水體低氧耐受方面具備較強能力，這可能是其能夠在高密度運輸條件下仍然保持較高存活率和6日齡附著變態率較高的原因。事實上，在皺紋盤鮑幼蟲運輸過程中其自身仍然在不斷發育和完成早期器官的變態中，有研究報導不同于其他貝類鮑科動物能夠在早期變態發育過程中有獨特的生化機制以耐受低氧（hypoxia）甚至缺氧（anoxia）（Hindrum et al，2001）。由于本研究條件所限，對皺紋盤鮑幼蟲高密度運輸存活機理仍需進一步研究。

3.4 溫度計密度交互影響及應用意義

水溫和密度是影響皺紋盤鮑幼蟲運輸存活率和附著率的重要因素。因此研究溫度和密度雙因子各主效應及其交互作用，對保障幼苗在運輸后具有較高的存活率和附著變態率具有重要指導意義。本實驗表明水溫在16℃，密度為50～150幼蟲/ml的情況下存活率最優；在水溫為16℃，密度為150、200幼蟲/ml和水溫為20℃，密度為100幼蟲/ml的情況下，皺紋盤鮑運輸后第3天附著變態率變現最優。由此可以認為，水溫為16℃，密度為150幼蟲/ml是最適合皺紋盤鮑幼苗的運輸。

研究各個主效應和交互作用對人工繁育后異地幼蟲附著技術有重要的指導作用。除了密度和溫度因子外，其他因素，如含氧量、鹽度、pH、細菌數量等都會對皺紋盤鮑幼苗運輸的存活率和變態率產生影響，還需進一步的實驗證實。

4 結論

以皺紋盤鮑為實驗材料開展不同運輸水體溫度和幼蟲密度及其交互作用對皺紋盤鮑幼蟲存活率和附著率的研究。實驗結果表明：（1）溫度因子和密度因子均對對皺紋盤鮑幼蟲的存活率有極顯著影響（P＜0.001）。溫度為16℃，密度為50、100和150幼蟲/ml時存活率表現最優；（2）溫度度因子和密度因子均對對皺紋盤鮑幼蟲運輸第3天后附著變態率有極顯著影響（P＜0.001）。16℃下密度為150、200幼蟲/ml和20℃下密度為100幼蟲/ml的情況下，皺紋盤鮑運輸第3天后附著變態率變現最優。本實驗初步揭示12 h運輸時間內皺紋盤鮑3日齡幼蟲具備能耐受低氧水體環境能力（溶解氧DO＜2 mg/L）。

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農業部漁業局，2014.中國漁業統計年鑒.北京：中國農業出版社.

（本文編輯：袁澤軼）

Effects of water temperature and stocking density on the survival rate and metamorphosis of Pacific abalone（Haliotis discus hannai）larvae in remote transport

HU Bing1,MI Cheng-zhi2,YAN Xi-wu1,WU Fu-cun3,4,ZHANG Guo-fan3,4
(1.Key Laboratory of Mariculture＆Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;2.Zhangzi Island Group Company Limited,Dalian 116023,China;3.Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology,Chinese Academy of Sciences,Qingdao 266071,China 4;4.National&Local Joint Engineering Laboratory of Ecological Mariculture,Institute of Oceanology,Chinese Academy of Sciences,Qingdao 266071,China)

This study investigated the effects of water temperature and stocking density on the survival and metamorphosis rates of Pacific abalone Haliotis discus hannai larvae in remote transport.Three levels of water temperature(13℃,20℃) and four levels of stock density(50,100,150,200 larvae/ml)were set up using two-factor experimental design.Results showed that both 3-day-old larvae survival and 6-day-old larvae metamorphosis rates were significantly affected by the factors of water temperature,stocking density and their interaction.Duncan's post hoc comparisons showed that the optimal parameters for larvae remote transport were temperature of 16℃and stocking density of 150 larvae/ml.The monitor of dissolved oxygen during the experiment preliminarily demonstrated the larvae of Pacific abalone could be capable of enduring hypoxia under the present experimental conditions.The study is of great significance in Pacific abalone larvae transport and even in Pacific abalone stock enhancement by larval seeding.

Pacific abalone;Haliotis discus hannai;water temperature;larvae density;larvae remote transport

Q175

A

1001－6932（2017）03－0320－06

10.11840/j.issn.1001-6392.2017.03.010

2016-03-18；

2016-05-20

國家自然科學基金（31302184）；國家貝類產業技術體系（CARS-48）。

胡冰（1990-），碩士研究生，主要從事海產動物遺傳育種與養殖技術研究。電子郵箱：hubing9031@126.com。

吳富村，副研究員。電子郵箱：wufucun@qdio.ac.cn。