薏仁酒糟水解工藝的研究

梅朝陽(yáng)，胡 康，張 玉，朱正軍，陳茂彬

（湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430068）

薏仁酒糟水解工藝的研究

梅朝陽(yáng)，胡 康，張 玉，朱正軍，陳茂彬

（湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430068）

為確定蛋白酶水解薏仁酒糟的最佳工藝條件，以多肽得率及水解度為指標(biāo)對(duì)4種蛋白酶進(jìn)行篩選，確定最佳蛋白酶為堿性蛋白酶，并通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)確定其最佳的水解條件底物濃度為6%（m/V），蛋白酶用量為1200 U/g，溫度為55℃，pH值為8.5，反應(yīng)時(shí)間為6 h。在此條件下多肽得率68.12%，溶解氮指數(shù)為94.02%，水解度為22.05%。

薏仁酒糟； 堿性蛋白酶； 水解條件

薏仁作為我國(guó)首批公布的藥食同源的食物之一，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高。薏仁是一種營(yíng)養(yǎng)平衡的谷物，具有鎮(zhèn)痛消炎、清熱排濕、消腫利尿、健脾潤(rùn)肺等多種功效[1-4]。薏仁提取物薏仁油具有抗癌活性，其抗癌活性取決于其含有的棕櫚酸、月桂酸、硬脂酸以及亞油酸等不飽和脂肪酸[5-9]。有研究表明，植物蛋白的水解產(chǎn)物多肽具有抑菌[10]、抗氧化[11-12]的特性。薏仁中，蛋白含量豐富，且比例與人體協(xié)調(diào)。田曉等[13]用響應(yīng)面法考察了料液比、溫度和pH值對(duì)薏仁蛋白提取的影響，發(fā)現(xiàn)料液比對(duì)浸提率影響最大。肽作為薏仁蛋白經(jīng)蛋白酶部分水解的產(chǎn)物，也是人體的重要功能性成分。董紅艷等[15]以氮溶解指數(shù)(NSI)和水解度(DH)為指標(biāo)對(duì)中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶進(jìn)行篩選，確定堿性蛋白酶為最佳水解用酶,并確定最佳工藝條件為堿性蛋白酶在底物質(zhì)量濃度39.95 g/L，酶用量1201.75 U/g，溫度54.61℃，pH值7.99,反應(yīng)時(shí)間4 h。在此條件下，水解后的氮溶解指數(shù)可達(dá)95.79%。岳文明等[16]將薏仁蛋白進(jìn)行酶解后，用不同樹(shù)脂吸附，其中DA201-C大孔樹(shù)脂吸附率最高，為46.06%，純化后的肽相對(duì)分子質(zhì)量為278.61～943.32。薏仁發(fā)酵酒具有其特有的香氣及較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，但蛋白質(zhì)利用極低。酒糟作為薏仁發(fā)酵酒的副產(chǎn)物，蛋白含量在37%左右，具有一定的利用價(jià)值。通過(guò)對(duì)蛋白酶進(jìn)行初步篩選，得到堿性蛋白酶為最佳蛋白酶，并通過(guò)單因素及正交實(shí)驗(yàn)分析了各因素對(duì)水解多肽得率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

脫脂薏仁酒糟：本實(shí)驗(yàn)室自制；蛋白酶：堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶及復(fù)合蛋白酶（諾維信）；其他試劑為分析純。

儀器設(shè)備：數(shù)顯恒溫水浴鍋，精宏；FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，梅特勒-托利多；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)，湘儀；AP-01P無(wú)油真空泵，奧特賽恩斯；K110OF凱氏定氮儀，海能；L-8900氨基酸分析儀，安捷倫；SOX500脂肪測(cè)定儀，海能；TB-204分析天平，賽多利斯；ZXFD-B5250鼓風(fēng)干燥箱，智誠(chéng)；移液槍?zhuān)簖垺?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白酶的初步篩選

稱(chēng)取一定量的脫脂薏仁酒糟，加入適量去離子水進(jìn)行調(diào)漿，分別按照蛋白酶的消解條件（表1）進(jìn)行水解。在水解過(guò)程中不斷加入NaOH（HCl）溶液，保持反應(yīng)過(guò)程中的pH值不變（±0.1）。反應(yīng)6 h后，85℃水浴10 min使蛋白酶失去活性。

表1 蛋白酶的水解條件

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 底物濃度對(duì)水解效果的影響

酶添加量為1000 U/g，pH值為8.5，時(shí)間為5 h，溫度為55℃，底物濃度控制為3%、4%、5%、6%、7%、8%，待水解完成后，以多肽得率為指標(biāo)，確定最佳的底物濃度。

1.2.2.2 酶添加量對(duì)水解效果的影響

底物濃度為5%，pH值為8.5，時(shí)間為5 h，溫度為55℃，酶添加量控制為600 U/g、800 U/g、1000 U/g、1200 U/g、1400 U/g、1600 U/g，待水解完成后，以多肽得率為指標(biāo)，確定最佳的酶添加量。

1.2.2.3 溫度對(duì)水解效果的影響

底物濃度為5%，酶添加量為1000 U/g，pH值為8.5，時(shí)間為5 h，溫度控制為40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃，待水解完成后，以多肽得率為指標(biāo)，確定最佳的水解溫度。

1.2.2.4 pH值對(duì)水解效果的影響

底物濃度為5%，酶添加量為1000 U/g，溫度為55℃，pH值為8.5，時(shí)間控制為3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h，待水解完成后，以多肽得率為指標(biāo)，確定最佳的水解pH值。

1.2.2.5 時(shí)間對(duì)水解效果的影響

底物濃度為5%，酶添加量為1000 U/g，溫度為55℃，時(shí)間為5 h，pH值控制為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，待水解完成后，以多肽得率為指標(biāo)，確定最佳的水解時(shí)間。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn)

由于水解過(guò)程受底物濃度、酶添加量、水解溫度、水解時(shí)間及水解pH值5個(gè)因素的影響，為了全面考慮5個(gè)因素對(duì)水解工藝的影響，利用水解工藝單因素實(shí)驗(yàn)為依據(jù)，設(shè)計(jì)L16(45)正交實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)表2。

表2 薏仁酒糟酶解工藝正交實(shí)驗(yàn)因素與水平

1.2.4 理化指標(biāo)的檢測(cè)

水分含量按GB 5497—1985測(cè)定；脂肪的測(cè)定按GB/T 14772—2008；蛋白質(zhì)含量按GB 5009.5—2010測(cè)定；水解液中多肽的測(cè)定按GB/T 22492—2008。

1.2.5 多肽得率的測(cè)定

1.2.6 水解度的測(cè)定

式中：C——水解過(guò)程中，所加NaOH的濃度（mol/L）；

V——水解過(guò)程中，所加NaOH的體積（mL）；

Mp——底物蛋白質(zhì)的總質(zhì)量（g）；

α——氨基酸的平均解離度；

htot——底物蛋白質(zhì)的肽鍵總數(shù)（mmol/g蛋白質(zhì)，薏仁酒糟蛋白為8.15 mmol/g）。

1.2.7 溶解氮指數(shù)的測(cè)定

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白酶的初步篩選（圖1）

圖1 蛋白酶種類(lèi)對(duì)水解效果的影響

有研究表明，多肽相對(duì)于蛋白質(zhì)及氨基酸，更容易為人體所吸收。為了提高蛋白質(zhì)的利用率，在水解過(guò)程中，一般多肽的得率越高越好。由圖1可知，堿性蛋白酶的水解效果較佳。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 底物濃度對(duì)水解效果的影響（圖2）

圖2 底物濃度對(duì)水解效果的影響

薏仁蛋白的水解在不同底物濃度下存在一定的差異，根據(jù)酶的特性，在一定底物濃度范圍內(nèi)，底物濃度越高，酶與底物接觸越充分，水解效果好；超過(guò)一定的范圍，底物濃度越高，酶與底物越無(wú)法充分接觸，水解效果差。由圖2可知，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%時(shí)，多肽得率最高，底物濃度高于6%，多肽得率急劇下降，因此，較優(yōu)的底物濃度為6%。

2.2.2 酶添加量對(duì)水解效果的影響（圖3）

圖3 酶添加量對(duì)水解效果的影響

蛋白酶的水解在不同的酶添加量下存在一定的差異，根據(jù)酶的特性，在一定的添加范圍內(nèi)，添加量越高，酶與底物接觸越充分，水解效果越好，超過(guò)一定的范圍，過(guò)量酶無(wú)法與底物充分接觸，造成酶的浪費(fèi)，甚至抑制水解。由圖3可知，當(dāng)酶的添加量為1000 U/g時(shí)，多肽得率最高；高于1000 U/g時(shí)，多肽得率趨于穩(wěn)定，有細(xì)微的下降趨勢(shì)。因此，較優(yōu)的酶添加量為1000 U/g。

2.2.3 溫度對(duì)水解效果的影響（圖4）

圖4 溫度對(duì)水解效果的影響

根據(jù)酶的特性，一方面，隨著溫度的升高，反應(yīng)速度越快，另一方面，酶的化學(xué)本質(zhì)為蛋白質(zhì)，溫度過(guò)高會(huì)使蛋白質(zhì)變性。由圖4可知，當(dāng)溫度小于55℃時(shí)，隨著溫度的升高，多肽得率不斷增大；當(dāng)溫度大于55℃，多肽得率不斷減小。因此，較優(yōu)的水解溫度為55℃。

2.2.4 pH值對(duì)水解效果的影響（圖5）

圖5 pH值對(duì)水解效果的影響

根據(jù)酶的特性，酶受pH值的影響極為顯著，低于或者高于最適pH值，酶的活性迅速降低。由圖5可知，當(dāng)pH值小于8.5時(shí)，隨著pH值的減小，蛋白酶的活性急劇下降，多肽得率不斷減小，當(dāng)pH值大于8.5時(shí)，隨著pH值的增大，蛋白酶的活性急劇下降，多肽得率不斷減小。因此，較優(yōu)的水解pH值為8.5。

2.2.5 時(shí)間對(duì)水解效果的影響（圖6）

圖6 時(shí)間對(duì)水解效果的影響

蛋白質(zhì)的水解分為兩個(gè)階段，第一個(gè)階段，蛋白質(zhì)被分解為小分子的多肽，第二個(gè)階段，小分子的多肽被分解為氨基酸。開(kāi)始時(shí)，隨著水解的進(jìn)行，多肽得率不斷增加，當(dāng)時(shí)間達(dá)到6 h時(shí)，多肽得率達(dá)到最大值，繼續(xù)延長(zhǎng)水解時(shí)間，多肽的得率有下降的趨勢(shì)。因此，較優(yōu)的水解時(shí)間為6 h。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表3、表4）

由表3極差分析可知，影響薏仁酒糟多肽得率的主次因素為C＞B＞E＞D＞A，即pH值對(duì)多肽得率影響最大，其次為酶添加量、時(shí)間、溫度，對(duì)多肽得率影響最小的是底物濃度，得出最佳水解條件組合為A3B3C3D3E3，即底物濃度為6%，酶添加量為1200 U/g，水解pH值為8.5，水解溫度為55℃，水解時(shí)間為6 h。在該最佳條件下進(jìn)行水解的驗(yàn)證試驗(yàn)，多肽得率為68.12%。

表3 堿性蛋白酶酶解薏仁酒糟工藝優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析

由表4可知，在α=0.05的水平上，水解pH值的F值＞F臨界值，所以水解pH值對(duì)水解影響顯著。

3 結(jié)論

通過(guò)蛋白酶的初步篩選，確定最佳蛋白酶為堿性蛋白酶，通過(guò)單因素及正交實(shí)驗(yàn)，確定堿性蛋白酶的最佳水解條件：底物濃度6%，酶添加量為1200 U/g，水解pH值為8.5，水解溫度為55℃，水解時(shí)間為6 h。在此水解條件下，多肽得率為68.12%，溶解氮指數(shù)為94.02%，水解度為22.05%。

一般來(lái)說(shuō)，內(nèi)切蛋白酶容易產(chǎn)生苦味，外切蛋白酶可以降低苦味。為了降低苦味，可以考慮堿性?xún)?nèi)切蛋白酶和風(fēng)味外切蛋白酶結(jié)合使用，這樣可以得到低苦味值的生物活性肽。再根據(jù)生物活性肽的相應(yīng)性質(zhì)，將其添加到食品中，制成具有一定功效的功能食品，這樣既可以為酒廠酒糟的利用提供新的途徑，為企業(yè)帶來(lái)附加值，又可以開(kāi)發(fā)新的產(chǎn)業(yè)鏈。

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Hydrolysis of Spent Grains of Coixseed Wine

MEI Zhaoyang,HU Kang,ZHANG Yu,ZHU Zhengjun and CHEN Maobin
(Hubei Collaborative Innovation Center for Industrial Fermentation,School of Biological Engineering, Hubei University of Technology,Wuhan,Hubei 430068,China)

In order to determine the best hydrolysis conditions of spent grains of coixseed wine lees by protease,four kinds of protease were screened with peptide yield and hydrolysis degree as the evaluating indicators.As a result,alcalase was the best protease. The best hydrolysis conditions of alcalase were determined by single factors test and orthogonal test as follows:substrate concentration was 6%(m/V),the use level of alcalase was 1200 U/g,temperature was at 55℃,pH was 8.5,and hydrolysis time was 6 h.Under above conditions,the yield of peptide and nitrogen solubility index were 68.12%and 94.02%,and the degree of hydrolysis reached up to 22.05%.

spent grains of coixseed wine;alcalase;hydrolysis conditions

TS262.3；TS261.4；X797

A

1001-9286（2017）06-0103-05

10.13746/j.njkj.2017025

香溢城活性肽酒新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)與生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)(2016YFD0400500)。

2017-02-14

梅朝陽(yáng)（1990-），男，在讀碩士研究生，主要從事食品發(fā)酵研究工作，E-mail：592277301@qq.com。

陳茂彬（1965-），男，教授，博士，主要從事食品發(fā)酵研究工作，E-mail：hgchenmaobin@163.com。

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2017-05-26；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170526.1356.002.html。