華東地區兩種植被帶內天女花的遺傳結構

徐延年,邵劍文,2,*

1 安徽師范大學生命科學學院,蕪湖 241000 2 安徽省重要生物資源保護與利用研究重點實驗室,蕪湖 241000

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華東地區兩種植被帶內天女花的遺傳結構

徐延年1,邵劍文1,2,*

1 安徽師范大學生命科學學院,蕪湖 241000 2 安徽省重要生物資源保護與利用研究重點實驗室,蕪湖 241000

天女花是一種名貴的珍稀觀賞樹種,現已被列為國家Ⅲ級保護植物,其自然分布區的植被類型可大致分為溫帶落葉闊葉林帶(長江以北)和暖溫帶常綠闊葉林帶(長江以南)。華東地區是天女花分布比較集中的區域之一,也是兩種植被帶的分界區。論文采用微衛星標記對華東地區兩種植被帶內的8個天女花自然種群的遺傳多樣性和遺傳結構進行了分析。結果表明：華東地區天女花種群遺傳多樣性與近緣種相比較低(NA=3.83、HO=0.25、HE=0.40)；大別山(落葉闊葉林帶)種群的遺傳多樣性(均值為HO=0.18和HE=0.28)明顯低于皖南種群(常綠闊葉林帶)的(均值為HO=0.33和HE=0.51),并且兩者已發生了明顯的遺傳分化；兩種植被帶內的種群特征(如種群大小、胸徑或叢枝數)差異不顯著,種群內年幼亞群體的遺傳多樣與年老亞群體相比沒有發生顯著的變化。因此,推測大別山天女花種群經歷的種群歷史較短(較皖南種群)是導致其遺傳多樣性較低的主要原因,建議兩種植被帶內的天女花種群應視為不同的進化單元進行保護,當前仍應以就地保護為主。

天女花；遺傳多樣性；遺傳結構；植被帶；保護建議

木蘭科植物由于具有較高材用、食用、藥用及觀賞和科研價值(古老的木本植物),且超過半數的類群已處于瀕臨滅絕的狀態,現已引起了植物學研究者的廣泛關注[1- 5]。天女花(Oyamasieboldii(K.Koch)N.H. Xia & C.Y.Wu)又名小花木蘭、天女木蘭,屬落葉小喬木,該植物零星分布于我國東北和華東地區(日本和朝鮮也有少量分布),是典型的第三紀孑遺植物。其葉肥厚,花大,色白香濃,提取物可作為化妝品、香料以及藥品的原料,具有較高經濟利用價值,也是東亞特有的名貴珍稀觀賞樹種[6]。但近年來由于氣候變化,人為砍伐和過渡采挖,再加上其自身的原因,天女花分布區正逐步縮小,種群及個體數量銳減,現已被列為國家Ⅲ級保護植物(國務院環境保護委員會,中國珍稀瀕危植物名錄(第一批),1984)。現有關天女花的研究工作主要是針對其種群群落結構、種子萌發特性、生殖對策以及快繁技術等開展的[7- 17],有關其種群的遺傳多樣性和遺傳結構研究至今未見報道。

植被是指某一地區內全部植物群落的總稱,是棲息地景觀中最重要的特征之一,它為該地區的植物、動物和微生物的生存提供了必要的物質基礎和環境[18],對區域內的動植物遺傳特征有著重要的影響[19- 21]。天女花現有野生種群分布區的植被大致可以分為兩類,即長江以北的溫帶落葉闊葉林帶和長江以南的暖溫帶常綠闊葉林帶[22]。兩種植被帶內的天女花種群遺傳多樣性及遺傳結構是否有差異？如果有差異,導致差異形成可能的因素是什么？弄清這些問題對該珍稀瀕危植物遺傳管理和有效保護措施的制訂具有指導意義[23-24]。

因此,本文擬對兩種植被帶分界線兩側,即大別山區(溫帶落葉闊葉林的代表)和皖南山區(包括江西三清山種群,暖溫帶常綠闊葉林帶的代表)各4個種群的種群特征(種群大小、平均胸徑及叢枝數)進行調查研究,并通過8對高多態性的微衛星引物分析它們的遺傳多樣性及遺傳結構特征,以期為天女花科學保護措施的制訂提供指導。

1 材料和方法

1.1 樣品采集及種群特征的調查

圖1 天女花8個采樣種群的地理分布圖 Fig.1 The locations of the 8 sampled populations of O. sieboldii

在查閱館藏標本的基礎上,于2013年6月對華東地區天女花可能的分布地點進行了調查和樣品采集,共采集到8個自然種群(圖1和表1),其中大別山山區4個和皖南山區4個(包括江西三清山種群),共223個植株,取幼嫩葉片硅膠干燥備用。對采樣植株的地上叢枝數和最粗枝的胸徑進行統計測量,并估測和統計種群大小(植株數)。

1.2 總DNA提取和PCR反應

總DNA提取參照改良的CTAB法[25]進行,提取的產物在1%的瓊脂糖中電泳檢測DNA的質量。從近緣種中[4, 26]篩選出8對高多態性且擴增穩定的微衛星引物用于本實驗,并對上游引物5′末端進行熒光修飾(FAM、HEX或TAMRA,表2)。PCR擴增反應在Bio-Rad iCycler PCR儀上進行,反應總體積為15μL,包括: 5 ng DNA模板,1.5μL Buffer,2 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTP,0.4 U Taq聚合酶,0.4μmol/L引物。PCR擴增程序為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s,50—58℃退火30 s(表2),72℃延伸30 s,25個循環；95℃變性30 s,53℃退火30 s,72℃延伸30 s,10個循環；72℃延伸15 min。PCR產物使用fluorescence-based基因電泳系統(ABI3730XL)進行數據自動化分析,用GeneScan 3.7分析軟件(Applied Biosystems,USA)對微衛星基因型進行判讀。

表1 取樣的天女花種群信息

表2 微衛星位點及引物特征

1.3 數據分析

使用Genepop 4.0[27]軟件檢驗引物是否存在連鎖不平衡以及是否偏離Hardy-Weinberg平衡；使用Micro-Checker 2.2.3[28]軟件檢驗各微衛星位點是否存在無效等位基因；使用GenAlEx 6[29]軟件計算種群的等位基因數(NA)、觀測雜合度(HO)、期望雜合度(HE)和近交系數(FIS)等遺傳參數；使用Bottleneck軟件檢測各種群在近期是否經歷了瓶頸效應；使用GENETIX[30]軟件計算種群間的遺傳分化系數(GST和FST)和基因流(Nm)；利用TFPGA[31]軟件進行Mantel統計學檢驗種群間的地理距離與遺傳分化程度的相關性。由于胸徑和叢枝數與天女花生長的年限可能存在正相關性,為了檢測各種群遺傳特征的變化趨勢,取胸徑與叢枝數的中位數為界,把種群內的個體分為年幼和年老亞群體,再通過上述軟件分別計算兩亞群體的遺傳參數。統計分析在SPSS11.0軟件中進行,用單因素方差分析檢驗種群特征(胸徑、叢枝數和種群大小)差異是否顯著；分別用Mann-Whitney U test檢驗不同植被帶內的遺傳多樣性參數差異顯著性,用Wilcoxon signed-rank test檢驗年老和年幼亞群體的遺傳多樣性參數差異顯著性。

在遺傳結構上,用Arlequin 3.5[32]軟件進行種群間和種群內的分子變異分析。使用Structure 2.2[33]中貝葉斯聚類法對所有個體進行聚類,K值設為9,10個重復,使用混合模型,burn-in設為100000和run-length設為1000000,參照Evanno等[34]計算ΔK值,分析可能的遺傳結構；同時采用不基于遺傳平衡原理的GenAlEx軟件進行基于個體的主成分分析(PCoA)。采用2MOD 0.2[35]軟件檢測和計算各種群基因流和隔離漂變的相對強弱。

2 結果

經廣泛查閱館藏標本信息和調查,在溫帶落葉闊葉林植被帶與暖溫帶常綠闊葉林植被帶分界的長江兩側僅發現8個天女花自然種群(圖1和表1),其中4個位于長江以北的大別山區,屬溫帶落葉闊葉林植被帶(以下簡稱大別山種群)；另4個位于長江以南,屬暖溫帶常綠闊葉林植被帶(以下簡稱皖南種群)。天女花自然種群植株數目差別較大,最小的為白馬尖種群(BMJ,僅23個植株)；最大的為黃山(HS)和鷂落坪(YLP)種群,植株數約500株,它們的胸徑也比較粗,平均值分別為4.37cm和4.89cm,明顯大于其它種群(F7，212=9.652,P<0.001)；各種群的叢枝數平均值從3.73—6.36不等,但種群間差異不顯著(F7，212=1.993,P=0.057)。兩種植被帶內的種群大小、胸徑及叢枝數差異均不顯(P0.05)。

從日本厚樸(Houpo?aobovata(Thunberg) N. H. Xia & C. Y. Wu)和星花玉蘭(Yulaniastellata(Maximowicz) N. H. Xia)篩選出在天女花中能穩定擴增并具有多態性的引物共8對。它們對223個個體擴增共檢測到105個等位基因,每個位點平均約13個基因(表2),其中M6D4引物等位基因數最多(達20個),M6D1引物最少(僅8個)。Micro-Checker和Genpop軟件在這些微衛星位點中僅檢測出少量位點在個別種群中可能存在無效等位基因和連鎖現象,未見任何位點在3個以上的種群中出現無效等位基因或與其他位點連鎖。因此這8對微衛星引物可以用于天女花種群的遺傳多樣性和遺傳結構的分析研究。

表3 8個天女花種群的遺傳多樣性參數、瓶頸效應及2MOD的分析結果

NA: 等位基因數(Number of different alleles)；HO: 觀測雜合度(Observed heterozygosity)；HE: 期望雜合度(Expected heterozygosity)；FIS: 近交系數(Inbreeding coefficient)； MD: 胸徑均值(The mean diameter at breast height)；MB: 平均叢枝數(The mean branches)；TPM: 兩相突變模型(Two-phase mutation model)；SMM: 逐步突變模型(Stepwise mutation model);L-shaped: 種群沒有出現瓶頸效應(L-shaped distribution of alleles is expected in the absence of a bottleneck);種群編號見表1

8個天女花自然種群的平均等位基因數(NA)為3.83,觀測雜合度(HO)為0.25,期望雜合度(HE)為0.40,YLP和HS種群的遺傳多樣性較高(HE分別為0.43和0.62,HO為0.23和0.38),BMJ和TZS種群的遺傳多樣性較低(HE分別為0.19和0.20,HO為0.18和0.14)。大別山區(即落葉闊葉林帶)種群的遺傳多樣性參數(NA,HO和HE)均顯著低于皖南山區(見表4)。8個種群作為總體和兩種植被帶分別檢驗種群的遺傳多樣性與種群特征(如大小、胸徑及叢枝數)的相關性,僅發現皖南種群的期望雜合度(HE)與種群大小有明顯的正相關性(r=0.982,P=0.018),其它相關性均不顯著(P0.05)；種群內部根據胸徑或叢枝數分為年老和年幼亞群體的遺傳多樣性參數(NA,HO和HE)及近交系數(FIS)也不存在顯著的差異(圖2)。種群近交系數(FIS)從0.06—0.50不等,均明顯偏離哈-溫平衡(95%的置信區間已明顯大于0)。各種群均未檢測到明顯的瓶頸效應(表4),總體而言天女花采樣種群的基因流模型和漂變模型大致相當(2MOD值平均為0.52,表4),但大別山種群更傾向于基因流模型(0.66),而皖南種群漂變模型更明顯(0.38)。

表4 大別山種群與皖南種群的遺傳多樣性參數均值及其統計分析結果

圖2 天女花種群的年幼和年老亞群體遺傳多樣性差異比較Fig.2 The comparation of the genetic diversity between young and old sub-populations within populations of O. sieboldii

華東地區天女花種群間的遺傳分化系數GST均值為0.315(表5),其中最大值出現在TZS和GNJ種群間(GST=0.546),最小值出現在TZS和YLP種群間(GST=0.108)。大別山和皖南種群的平均遺傳分化系數分別為0.198和0.269,兩者間差異不顯著性(T1，11=1.882,P=0.089)。總體上種群間的遺傳分化程度與地理距離有正相關性(Mantel test:r=0.436,P=0.020),但兩種植被帶內這種正相關性并不明顯(P0.05)。種群間的總體平均基因流Nm=0.340,大別山種群的平均基因流為Nm=0.632,高于皖南種群的Nm=0.352。

表5 8個天女花種群間的遺傳分化系數(GST,對角線下)和地理距離(D,對角線上)/km

Table 5 Pairwise GSTvalues (below the diagonal) and geographical distances (above the diagonal) among the 8 sampled populations ofO.sieboldii

天堂寨鷂落坪白馬尖天柱山牯牛降黃山清涼峰三清山TTZ323777201254315331YLP0．1761545168220283300BMJ0．3140．14648170218281304TZS0．2850．1080．157123176240255GNJ0．4850．4120．5410．54670134140HS0．3230．2710．3780．3830．29867137QLF0．3200．2540．3340．3100．2850．219151SQS0．3480．2840．4220．4080．3290．2330．249

AMOVA方差分析表明取樣種群的主要遺傳變異存在于種群間(占總變異的54.16%),而且不同植被帶內天女花的遺傳特征已發生了明顯分化,它們之間的差異占總遺傳差異的24.91%(P<0.001,表6)。主成分分析(圖3)和STRUCTURE分析的結果(圖4)也一致支持上述結果,不同植被帶內的天女花種群均優先各自聚為一組。

表6 天女花分子變異的AMOVA分析結果

圖3 天女花8個種群遺傳結構的主成分分析結果Fig.3 Principal coordinates analysis (PCoA) for 8 sampled populations of O. sieboldii

圖4 天女花8個種群的遺傳結構STRUCTURE分析結果Fig 4 STRUCTURE analyses results of 8 sampled populations in O. sieboldiia:不同K值運算的lnP(D)平均值; b:依據Evanno等(2005)計算的ΔK值; C: K=2時的個體分配柱形圖;種群編號同表1

3 討論

木蘭科植物是現存被子植物原始類群的重要代表[36],據化石記錄起源于白堊紀亞爾必期[37]。它們大多數為高大喬木,是重要的森林和用材樹種,而且多數具有較高的藥用和觀賞價值。由于氣候變化、自身生物學特性及人為干擾和過渡采伐等原因,現全球超過半數的物種已處于瀕臨滅絕的狀態[3, 5]。木蘭科植物野生種質資源的保護與可持續利用是當前刻不容緩的重要課題[3]。由于是古老的木本植物且具異交的繁育系統,木蘭科植物的種群遺傳多樣性相對較高,種群間分化較小[38],如日本厚樸(HO=0.88,HE=0.87)[39]、星花玉蘭(HO=0.666,HE=0.719)[40]、MagnoliatomentosaThunb.(HO=0.650,HE=0.675)[41]等。然而本文研究的天女花華東地區的8個自然種群遺傳多樣性卻較低(HO=0.25,HE=0.40),明顯低于這些近緣種,也略低于天女花的日本亞種(O.sieboldiissp.japonicaK. Ueda,HO=0.360,HE=0.427)。但其種群間的遺傳分化程度卻較高(GST均值為0.315),主要的遺傳變異存在于種群間(占總變異54.16%),明顯高于它的近緣種厚樸(Houpo?aofficinalis(Rehder & E. H. Wilson) N. H. Xia & C. Y. Wu)、長蕊木蘭(Alcimandracathcartii(J. D. Hooker & Thomson) Dandy)、星花玉蘭等,也明顯高于多年生植物的均值(0.19)和具異交繁育系統植物的均值(0.22)[42]。

物種的遺傳多樣性和遺傳結構是其種群歷史、繁育系統、基因突變、遺傳漂變、基因流、自然選擇等綜合作用的結果[38]。對天女花而言,片斷化島嶼狀的生境、自交親和的繁育系統及傳粉昆蟲缺乏可能是導致其遺傳結構不同于近緣種(即種群內遺傳多樣性較低,種群間分化明顯)的主要原因。天女花雖然分布較廣,但間斷分布明顯,對生境要求比較高,喜涼爽、濕潤的環境,多生于陰坡山谷。華東地區的天女花都局限分布于海拔1000米以上的陰坡山林,這些生境通常面積較小,呈典型的片斷化島嶼狀分布。而且這些生境內濕度大,氣溫較低,傳粉昆蟲通常缺乏,如于小麗等[43]和王立龍等[16]均研究發現天女花在自然狀態下的結籽率很低(僅13%左右),人工補授花粉可以顯著提高其結籽率。再加上天女花雖然雌蕊較雄蕊先熟,但人工控制授粉實驗表明其自花授粉也能座果并產生飽滿種子,說明它仍然保留著自交親和的繁育系統,以適應傳粉昆蟲不足,保障生殖成功。這些因素綜合導致了天女花種群間基因流小(Nm=0.340),不足以克服遺傳漂變所帶來的遺傳負面效應,從而促使了種群的遺傳多樣性較低,種群間分化加劇[44]。

已有很多研究表明不同的生境或植被類型會對其區域內的動植物遺傳多樣性產生顯著的影響[19, 45-46]。本文研究結果也表明天女花在兩種植被帶內種群的遺傳多樣性也存在顯著差異,大別山區落葉闊葉林內的種群遺傳多樣性明顯低于皖南常綠闊葉林內的種群(表4)。一般來說,種群較大和較強的基因流有利于保存較高的遺傳多樣性[20, 47-48],但華東地區不同植被帶內的天女花種群大小、胸徑及叢枝數并沒有顯著差異,基因流反而是大別山區種群間較強(可能是由于地理距離較近的原因),種群內年幼亞群體的遺傳多樣性也并不顯著低于年老亞群體,因此種群大小、基因流及人為活動應該不是導致大別山天女花種群遺傳多樣性較低的主要原因。野外調查發現,雖然天女花種群在長江以南的常綠闊葉林植被帶有分布,但其種群均在海拔1000m以上,小生境仍然是落葉闊葉林,因此天女花應是典型的落葉闊葉林樹種,它的分布區與落葉闊葉林密切關聯。然而,在第四紀盛冰期時,落葉闊葉林向南退縮到了北緯22°—30°附近,而北緯30°以北是針葉林或非森林植被[22, 49]。因此在末次盛冰期時,天女花種群可能全部退縮到了北緯30°以南,現北緯30°以北的種群應是由北緯30°以南的殘存種群隨著冰期后的氣溫回升向北逐步回遷而形成的。所以緯度越高,種群建立的歷史相對越短,奠基者效應就越明顯,種群遺傳多樣性也就越低,這可能是導致大別山區種群遺傳多樣性較低的主要原因,也可進一步推測華北地區的天女花種群遺傳多樣性可能更低(尚需進一步驗證)。

物種保護的主要內容是保護其遺傳多樣性及進化潛力,種內遺傳多樣性越豐富,物種對環境變化的適應能力越強,其進化潛力也越大[50]。因此,物種遺傳多樣性及其遺傳結構分析可以為珍稀瀕危物種保護價值的評估以及保護策略的制訂提供非常重要的信息[51]。對華東地區天女花遺傳結構的研究分析表明,兩種植被帶內天女花的遺傳多樣性已發生了明顯的分化,各自聚為一組(圖3和圖4)。雖然大別山種群的遺傳多樣性顯著低于皖南種群,而且它極有可能是冰期后氣溫回暖過程中低緯度種群向北回遷而形成的,但由于生境選擇或遺傳漂變等原因,它現與皖南種群在遺傳上已發生了明顯分化,遺傳特征并不包含在皖南種群內(圖3和圖4),因此建議大別山種群和皖南種群應視為獨立的進化單元進行保護。與近緣種相比,雖然天女花種群的遺傳多樣性較低,種群間基因流較小,但考慮到它在兩種植被帶內的年幼亞群體與年老亞群體相比,遺傳多樣性均沒有發生顯著降低,預示著自然種群現處于基因流-隔離漂變平衡中[35]。再加上野外觀察還發現天女花自然種群年齡結構比較穩定,并存在一定數量的幼苗,種群自然更新能力尚可。因此建議當今仍應以就地保護為主,尤其注意對其適宜生境的保護,在條件允許的情況下,可以適當輔以相同植被帶內種群間的人工授粉,以增加其自然結籽率,來增強其自然更新的能力。

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The genetic structure ofOyamasieboldii(K.Koch)N.H. Xia & C.Y.Wu within two vegetation zones in Eastern China

XU Yannian1,SHAO Jianwen1,2,*

1CollegeofLifeScience,AnhuiNormalUniversity,Wuhu241000,China2TheKeyLaboratoryofConservationandEmploymentofBiologicalResourcesofAnhui,Wuhu241000,China

Oyamasieboldii(K.Koch)N.H. Xia & C.Y.Wu is a rare species and has been listed as the national Ⅲ grade protection plants in China. The species is naturaly distributed in two different zones of forest vegetation, i.e., temperate deciduous broad-leaved forest (North of the Yangtze River) and warm temperate evergreen broad-leaved forest (South of the Yangtze River). The east region of China is one of the concentrated distribution areas ofO.sieboldii, and also is the boundary zone of these two different vegetations. The genetic diversity and structure of eight wild populations ofO.sieboldii, within two different vegetations from Eastern China, were analyzed by microsatellite markers. The results indicated that the genetic diversity ofO.sieboldiiin this region was relatively low (meanNA=3.83,HO=0.25 andHE=0.40) and lower than its closely related species. The mean population size, diameter at breast height (DBH) and number of branch were not significantly different between populations from different vegetations. However, the genetic diversity of Dabieshan populations (meanHO=0.18 andHE=0.28), within the temperate deciduous broad-leaved forest, was significantly lower than that of the Southern Anhui populations (meanHO=0.33 andHE=0.51), within the temperate evergreen broad-leaved forest, and their genetic characters obviously differentiated from each other. The distinct population history might mainly explain the difference of genetic diversity between these two zones. The genetic diversity of young individuals was not significantly lower than that of the old individuals within each population. Therefore, we proposed that the populations in Dabieshan area and Southern Anhui area should be considered as two different evolutionary significant units for conservation, and aninsituconservation strategy should be taken as the main protecting measures at present, given that the regeneration ability of wild populations was normal and the genetic diversity of young individuals did not significantly decreased.

Oyamasieboldii；genetic diversity；genetic structure；vegetation zone；conservation strategy

10.5846/stxb201601030009

國家自然科學基金面上項目(31170317);生物環境與生態安全安徽省高校重點實驗室資助項目

2016- 01- 03; 網絡出版日期:2016- 08- 30

徐延年,邵劍文.華東地區兩種植被帶內天女花的遺傳結構.生態學報,2017,37(7):2253- 2262.

Xu Y N,Shao J W.The genetic structure ofOyamasieboldii(K.Koch)N.H. Xia & C.Y.Wu within two vegetation zones in Eastern China.Acta Ecologica Sinica,2017,37(7):2253- 2262.

*通訊作者Corresponding author.E-mail: shaojw@mail.ahnu.edu.cn