響應面法優化羰基還原酶產生菌Bacillusanthracis CGMCC No.12337的培養條件

歐志敏，徐佳慧，王 瑩

(浙江工業大學 藥學院，浙江 杭州 310014)

響應面法優化羰基還原酶產生菌BacillusanthracisCGMCC No.12337的培養條件

歐志敏，徐佳慧，王 瑩

(浙江工業大學 藥學院，浙江 杭州 310014)

炭疽芽孢桿菌BacillusanthracisCGMCC No.12337作為生物催化劑可不對稱還原奧卡西平制備抗癲癇藥物醋酸艾司利卡西平的關鍵中間體S-利卡西平.采用響應面優化法對B.anthracisCGMCC No.12337發酵培養基成分和培養條件進行優化，確定最優發酵條件為葡萄糖42 g/L，蛋白胨20 g/L，初始pH 4.8，磷酸氫二鉀0.5 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，轉速120 r/min，溫度33 ℃，接種量10%，培養時間36 h.采用該優化培養方法，該炭疽芽孢桿菌產生的羰基還原酶活力達到了775.62 U/L，較優化前提高了35.12%.

炭疽芽孢桿菌；生物轉化；響應面；培養條件

S-利卡西平是醋酸艾司利卡西平的關鍵手性中間體，同時也是奧卡西平的主要活性代謝產物[1-3].醋酸艾司利卡西平(S-(-)-10-乙酰氧基10,11-二氫-5H-二苯并[b,f]氮雜-5-甲酰胺)作為鈉離子通道抑制劑可用來治療局限性及全身性的癲癇發作[4-5]，同時作為第二代抗癲癇藥物，醋酸艾司利卡西平與奧卡西平相比能較好地防止毒性環氧代謝物的形成，因此醋酸艾司利卡西平擁有更好的穩定性和療效[6].

采用立體選擇性羰基還原酶產生菌炭疽芽孢桿菌BacillusanthracisCGMCC No.12337作為催化劑轉化奧卡西平制備S-利卡西平具有立體選擇性高、污染小和成本低等特點，符合環保，綠色的宗旨[7-8].為醋酸艾司利卡西平的合成提供了新的途徑[9-10].本研究采用響應面分析方法對炭疽芽孢桿菌B.anthracisCGMCC No.12337的產酶條件進行優化.在單因素實驗的基礎上選用PB實驗設計，以該菌株產生的羰基還原酶活力為響應值，對各因素的影響效應進行分析.采用最陡爬坡實驗確定最大響應區域，采用響應面分析法確定最佳培養基成分和最優培養條件，優化該炭疽芽孢桿菌的產酶條件，為菌體的擴大培養和工業化應用奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 供試菌株

炭疽芽孢桿菌B.anthracisCGMCC No.12337由本實驗室從浙江工業大學校園土壤中篩選得到，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心.

1.2 培養基

斜面培養基：葡萄糖20 g/L，酵母浸出粉5 g/L，硫酸銨5 g/L，硫酸鎂0.25 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，瓊脂20 g/L.

種子培養基：葡萄糖30 g/L，酵母浸出粉3 g/L，硫酸銨5 g/L，硫酸鎂0.25 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L.

液體發酵培養基: 葡萄糖30 g/L，酵母浸出粉10 g/L，硫酸鎂0.25 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L.

1.3 培養方法

斜面培養：將接有B.anthracisCGMCC No.12337的斜面試管放置于30 ℃的恒溫培養箱中培養2～3 d，待菌落長出豐滿的孢子.

種子培養：從斜面培養基中挑取一環接種到50 mL種子培養基中，30 ℃，120 r/min恒溫搖床中培養24 h.

發酵培養：以10%的接種量將種子培養液接種到400 mL的發酵培養基中，30 ℃，120 r/min恒溫搖床中培養24 h.

1.4 酶活力測定

取10 mL的發酵液于離心管中，8 000 r/min離心10 min，將離心所得菌體均勻分散在10 mL和pH=7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，加入10 μmol 的奧卡西平，置于30 ℃，120 r/min恒溫搖床中反應1 h.反應完成后將反應液置于離心管中，8 000 r/min離心10 min，取上清液.

用高效液相色譜法檢測奧卡西平和S-利卡西平的含量，進一步計算B.anthracisCGMCC No.12337的酶活力.以C-18(4 mm×250 mm×5 μm)作為色譜分析柱，檢測波長215 nm，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，流動相為V(乙腈)∶V(0.1%乙醇水)=40∶60.

B.anthracisCGMCC No.12337的酶活力定義為在一定條件下，1 min內能將1 μmol的奧卡西平還原為S-利卡西平所需酶量為一個酶活力單位(U).

1.5 實驗設計

1.5.1 單因素實驗

在發酵培養基中，分別用30 g/L蔗糖、淀粉、乙醇等代替葡萄糖，其他成分不變.以10%的接種量接種于發酵培養基中，于30 ℃，120 r/min的搖床中恒溫培養24 h，選擇最佳碳源.在發酵培養基中分別用10 g/L蛋白胨、硫酸銨、尿素等代替酵母浸出粉，其他條件不變，以10%接種量接種于發酵培養基中，于30 ℃，120 r/min的搖床中恒溫培養24 h，選擇最佳氮源.

1.5.2 Placket-Burman 實驗設計

Placket-Burman實驗是一種兩水平的實驗設計方法，以期在眾多的影響因素中找到少數幾個重要的影響因子[11].本實驗在單因素實驗的基礎上，初步確定葡萄糖質量濃度(A)、蛋白胨質量濃度(B)、初始pH(D)、轉速(E)、溫度(F)、接種量(H)、培養時間(J)和磷酸鹽質量濃度(L)8個因素以及它們的取值范圍，利用Placket-Burman實驗設計，以期找到對酶活影響最大的3個因素.

1.5.3 最陡爬坡實驗

為確保響應面擬合的準確性，需要找到最佳區域值[12-13]，顯著因素根據一階模型的回歸系數的大小和符號確定爬坡梯度和方向[14].不顯著因素則依據正效應因素取最高值，負效應因素取最低值的原則設計最陡爬坡實驗.

1.5.4 Box-Benhnken實驗設計

根據單因素和Placket-Burman篩選的3個重要因素以及最陡爬坡實驗確定的中心范圍，采用Box-Benhnken實驗設計對B.anthracisCGMCC No.12337的產酶條件進行3因素3水平的響應面分析，確定B.anthracisCGMCC No.12337的最佳產酶條件.

1.5.5 驗證實驗

響應面優化得到的最優發酵培養基配方被用于配制炭疽芽孢桿菌B.anthracisCGMCC No.12337培養基并按優化后的發酵條件進行實驗.檢驗發酵液中該炭疽芽孢桿菌的酶活性，并與理論值相比較，驗證模型的有效性.

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 碳源對B.anthracisCGMCC No.12337產羰基還原酶的影響

分別以30 g/L蔗糖、淀粉、乙醇、葡萄糖、β-環糊精為碳源，在其他培養基成分不變的情況下研究碳源的種類對B.anthracisCGMCC No.12337所產羰基還原酶活力的影響.實驗結果如圖1所示，當采用葡萄糖為碳源時，羰基還原酶的活力最高，因此選擇葡萄糖為最佳碳源[15-16].

圖1 不同碳源對菌株產酶活力影響Fig.1 Influence of different carbon sources on enzyme activity

2.1.2 氮源對B.anthracisCGMCC No.12337產羰基還原酶的影響

分別以10 g/L酵母浸出粉、牛肉膏、尿素、蛋白胨、硫酸銨為氮源，在其他培養基成分不變的情況下研究氮源的種類對B.anthracisCGMCC No.12337生產羰基還原酶酶活力的影響，實驗結果如圖2所示.當采用蛋白胨為氮源時，羰基還原酶的活力最高，因此選擇蛋白胨為最佳氮源[17].

圖2 不同氮源對菌株產酶活力影響Fig.2 Influence of different nitrogen sources on enzyme activity

2.2 Placket-Burman實驗結果

根據單因素試驗結果，選用試驗次數N=12的實驗設計,對葡萄糖質量濃度、蛋白胨質量濃度、初始pH、轉速、溫度、培養時間、接種量和磷酸鹽質量濃度等8個因素進行考察，每個因素選取2個水平，實驗結果見表1.

運用DX8.0對表1中的實驗結果進行影響因子的顯著性分析，分析結果如表2所示.結果表明：對B.anthracisCGMCC No.12337生產羰基還原酶影響最大的三個因素分別為葡萄糖質量濃度(A)，初始pH(D)和磷酸鹽質量濃度(L)，得到一次線性回歸方程式.

表1 Placket-Burman實驗設計及結果

表2 各因素顯著性分析結果

以B.anthracisCGMCC No.12337所產羰基還原酶活力為響應值的線性回歸方程為

酶活力=850.333+6.907A-65.042D-10.017L

(1)

其中：A為葡萄糖質量濃度；D為初始pH；L為磷酸鹽質量濃度.

由表3可看出：方差分析模型的Prob(P)>F的值小于0.000 1，表示該模型在回歸區域有較好的擬合性.PB實驗的復相關系數R2=0.926 5，表明實驗數據的關聯性較好；變化系數CV為9.57%，表明數據的可信度較高.校正決定系數R2=0.899，表示此回歸模型可用來解釋89.9%數據的變異性；精密度(Adeq precision)是有效信號和噪聲的比值，超過4.0即為合理，實驗精密度為16.762.

表3 回歸方程的方差分析

2.3 最陡爬坡實驗結果及分析

由Placket-Burman實驗結果可知，葡萄糖質量濃度(A)，初始pH(D)，磷酸鹽質量濃度(L)這三個因素對B.anthracisCGMCC No.12337生產羰基還原酶的影響顯著.其中初始pH和磷酸鹽質量濃度存在負顯著效應，該結果表明B.anthracisCGMCC No.12337是一種嗜酸性的菌株，酸性的培養基有利于其生長和繁殖.葡萄糖質量濃度存在正顯著效應，但需要考慮實際的生產成本.根據這3個因素的效應值大小和符號來設計最陡爬坡實驗.實驗設計及結果如表4所示，羰基還原酶活力在0+4x條件下達到最大值，之后開始降低，故最佳組合條件在0+4x附近，因此以0+4x的實驗條件可作為響應面實驗的中心點.

表4 最陡爬坡實驗及結果

2.4 Box-Benhnken實驗結果

根據Placket-Burman實驗確定的影響B.anthracisCGMCC No.12337發酵的3個重要因素以及最陡爬坡實驗確定的最優水平，以B.anthracisCGMCC No.12337的酶活力為響應值進行3因素3水平的Box-Benhnken響應面分析實驗，實驗結果見表5.

表5 Box-Benhnken實驗設計及結果

采用DX8.0軟件對響應值以及各因素進行回歸擬合分析，得到回歸方程為

y=683.02+18.45A-57.36B-16.71C+51.22AB-18.22AC+6.01BC+42.60A2-29.90B2-4.58C2

(2)

其中：y為B.anthracisCGMCC No.12337的羰基還原酶活力；A，B，C分別為葡萄糖質量濃度、初始pH和磷酸鹽質量濃度.根據式(2)，得到最佳酶活力為776.98 U/L.

表6為響應面方差分析，R2=0.973 2表示該模型擬合性較好，自變量與響應值之間的線性關系達到顯著.該方差分析結果還表明初始pH的一次項，葡萄糖質量濃度的二次項均達到了極顯著水平(P<0.01).此外，葡萄糖質量濃度和初始pH的交互作用也很顯著.

表6 二次響應面回歸模型方差分析1)

注：1)*表示差異顯著，P<0.05；**表示差異極顯著，P<0.01.

根據響應面分析和回歸方程利用DX8.0軟件繪制出響應面分析圖，見圖3.

圖3 葡萄糖質量濃度、初始pH和磷酸鹽質量濃度對菌株酶活力影響的響應面圖Fig.3 Response surface of interactive effects of glucose, initial pH and phosphate concentration

由響應面圖3可知：葡萄糖質量濃度，初始pH和磷酸鹽質量濃度存在顯著相關性并且都存在極值.采用DX8.0軟件對B.anthracisCGMCC No.12337所產的羰基還原酶活力進行分析，當酶活力達到最大值776.98 U/L時，葡萄糖質量濃度為41.97 g/L，初始pH 4.83，磷酸鹽質量濃度為0.5 g/L.

2.5 培養基及其發酵條件的最優組合

通過單因素實驗，Placket-Burman實驗設計，響應面回歸分析和實際因素分析，確定最優培養基為：葡萄糖42 g/L，蛋白胨20 g/L，初始pH 4.8，磷酸氫二鉀0.5 g/L,磷酸二氫鉀0.5 g/L.最優發酵條件為轉速120 r/min，溫度33 ℃，接種量10%，培養時間36 h.

2.6 發酵條件驗證實驗結果

為了驗證回歸模型預測結果的準確性，在此優化條件下共進行3次發酵實驗，B.anthracisCGMCC No.12337發酵液的平均酶活力達到了775.62 U/L，與理論值相比，其相對誤差為1.75%，表明該模型能較好地模擬和預測實驗結果.因此，響應面優化得出的對B.anthracisCGMCC No.12337發酵培養條件的參數準確可靠，證實了模型的有效性[18].

3 結 論

利用單因素實驗和Placket-Burman實驗設計，得到葡萄糖質量濃度，初始pH和磷酸鹽質量濃度是影響B.anthracisCGMCC No.12337發酵產酶的三個顯著因素.通過最陡爬坡實驗確定這3個因素的最優值范圍.采用BBD設計和DX8.0軟件進行分析，得到B.anthracisCGMCC No.12337的最佳培養條件：葡萄糖42 g/L，蛋白胨20 g/L，初始pH4.8，磷酸氫二鉀0.5 g/L,磷酸二氫鉀0.5 g/L，轉速120 r/min，溫度33 ℃，接種量10%，培養時間36 h.在此優化條件下，B.anthracisCGMCC No.12337的羰基還原酶活性達到了775.62 U/L，較優化前提高了35.12%.表明采用響應面優化法是尋找菌株最佳產酶條件的有效途徑.本研究的實驗結果為B.anthracisCGMCC No.12337不對稱還原奧卡西平制備S-利卡西平奠定了基礎.

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(責任編輯：劉 巖)

Optimization of fermentation condition for stereoselectivity carbonyl reductase producing strainBacillusanthracisCGMCC No.12337 by response surface methodology

OU Zhimin, XU Jiahui, WANG Yin

(College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

S-licarbazepine was synthesized by asymmetric reduction of oxcarbazepine withBacillusanthracisCGMCC No.12337 as catalyst. S-licarbazepine is the key intermediate of antiepileptic drug eslicarbazepine acetate. Response surface analysis method was used to optimize fermentation medium and conditions forB.anthracisCGMCC No.12337. The optimum fermentation conditions were finally conformed as: 42 g/L glucose, 20 g/L peptone, pH 4.8, K2HPO40.5 g/L, KH2PO40.5 g/L, 120 r/min, 33 ℃, 10% inoculation and 36 h. Under the optimum conditions, the maximum enzyme activity ofB.anthracisCGMCC No.12337 reached 775.62 U/L, with an increase of 35.12% compared to the original fermentation condition.

BacillusanthracisCGMCC No.12337; biotransformation; response surface; fermentation conditions

2016-10-25

浙江省自然科學基金資助項目(LY15B060005)

歐志敏(1973—)，女，遼寧鐵嶺人，教授，博士，研究方向為生化制藥和酶工程，E-mail:oozzmm@zjut.edu.cn.

R971.6

A

1006-4303(2017)03-0279-06