副干酪乳桿菌水牛奶酸奶品質及其通便功能的評價

劉敏，潘紅梅，吳志霜，王松梅，馮月梅，殷建忠，吳少雄

（昆明醫科大學公共衛生學院營養與食品科學系，昆明650500）

副干酪乳桿菌水牛奶酸奶品質及其通便功能的評價

劉敏，潘紅梅，吳志霜，王松梅，馮月梅，殷建忠，吳少雄

（昆明醫科大學公共衛生學院營養與食品科學系，昆明650500）

研究了含副干酪乳桿菌LYO 50 DCU-S的水牛奶酸奶品質及其潤腸通便作用。實驗對副干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合發酵的水牛奶酸奶在1、7、14、21 d的發酵過程中的活菌數、pH值、酸度、黏度、持水力、感官指標等分別進行測定，將其與保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合發酵的水牛奶酸奶進行對比分析，探究了LYO 50 DCU-S是否可作為附屬發酵劑應用到水牛奶酸奶生產中。將昆明種雄性小鼠分為空白組、模型組、對照組和3個副干酪乳桿菌給藥組。使用復方地芬諾酯建立小鼠便秘模型，副干酪乳桿菌水牛奶酸奶給藥7 d后，便秘小鼠首次排便時間縮短;連續15 d灌胃副干酪乳桿菌水牛奶酸奶后,便秘小鼠墨汁推進率顯著增加。結果表明，將副干酪乳桿菌LYO 50 DCU-S作為附屬菌應用到水牛奶酸奶生產中具有可行性,副干酪乳桿菌LYO 50 DCU-S可顯著改善水牛奶酸奶的潤腸通便功能。

副干酪乳桿菌LYO 50 DCU-S；發酵劑；通便

0 引言

水牛奶是制作奶制品的良好來源，在水牛奶的產品加工中，以酸奶的加工最具價值。副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei,LP）是益生菌中干酪乳桿菌(Lac?tobacillus casei)的一個亞種，具有調節腸道微生態平衡等生理功能[1-3]。它在腸道中通過代謝產生的乳酸，能有效抑制有害細菌的生長和繁殖，維持腸道的生態平衡和正常機能[4]；并能增加腸道的蠕動，具有潤腸通便的作用[5]。由于其對宿主顯著的益生功效，成為人們研究、開發和生產的焦點[6]。我國對副干酪乳桿菌水牛奶酸奶的開發研究尚未見報導。本研究利用副干酪乳桿菌與保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌組合發酵制備成水牛奶酸奶，通過建立便秘小鼠模型評價其潤腸通便功能，為益生菌酸奶通便作用的研究評價提供參考依據。

1 實驗

1.1 材料

菌株與牛乳：副干酪乳桿菌LYO 50 DCU-S、嗜熱鏈球菌(S.thermophilus)和保加利亞乳桿菌(L.Bulgari?cus)，水牛奶。

實驗動物：昆明種雄性小鼠60只，7周齡，體質量18～22 g，SPF級。

培養基：MC（Modified Chalmers）培養基，MRS（Man Rogosa Sharpe）培養基，MRS（Man Rogosa Sharpe）甘露醇瓊脂培養基。

復方地芬諾酯片，活性碳粉，阿拉伯樹膠粉。

1.2 儀器設備

超凈工作臺，高壓蒸汽滅菌器，臺式冷凍高速離心機，EL20數顯pH計，NDJ-1旋轉粘度計，隔水式培養箱，電子天平。

1.3 方法

1.3.1 水牛奶酸奶的制備

發酵劑制備：稱取LYO 50 DCU-S，YO-MIX凍干發酵劑各1 g，分別投放于99 mL的滅菌脫脂乳中，搖勻，制成菌含量為1%的接種菌液[7]。

水牛奶全脂乳預熱至60～75℃，40 MPa下均質，95℃殺菌5 min，冷卻至42℃，接入發酵劑，分裝壓膜，于42℃下發酵至pH值達到4.5時停止發酵，轉移至4℃冰箱中冷藏[8]。各發酵劑添加量的百分比以水牛奶全脂乳為基礎計量，發酵劑接種情況如表1所示。

表1 發酵劑接種情況

1.3.2 水牛奶酸奶的微生物、理化及感官指標

分別在水牛奶酸奶樣品冷藏期的第1，7，14，21 d取樣，進行微生物和理化指標的測定；感官指標在水牛奶酸奶樣品冷藏1 d后進行評定。

（1）微生物指標。采用涂布平板計數法測定微生物指標[9]，此處的微生物指標測定主要測定酸奶中的乳酸菌活菌數。取25 g(mL)酸奶樣品，加入225 mL無菌生理鹽水，10倍系列稀釋，選擇2～3個適宜稀釋度，各以0.1 mL加入到MRS、MC、MRS甘露醇平板進行涂布。MRS平板厭氧培養總乳酸菌，MRS甘露醇平板和MC平板分別需氧培養副干酪乳桿菌和嗜熱鏈球菌，培養溫度36±1℃，培養時間48 h±2 h后，分別記各菌株的活菌數。乳酸菌總數減去嗜熱鏈球菌與副干酪乳桿菌計數之和，即為保加利亞乳桿菌計數。

（2）理化指標

①pH值與滴定酸度測定。采用GB5413.34—2010的方法測定滴定酸度。數顯pH計直接測定水牛奶酸奶樣品的pH值。

②持水力。菌株持水力采用KEOGH[10]等研究方法。取水牛奶酸奶樣品15 mL，離心（3 000 r/min，4℃，20 min）。收集上清液稱重。按下列公式計算：

持水能力=（上清液質量/樣品質量）×100%。

③自發乳清析出情況。水牛奶酸奶自4℃冰箱取出后，稱酸奶質量（W1），而后將酸奶杯傾斜45°（10 s）內吸出表面的乳清，再稱取酸奶的質量（W2）。酸奶杯與膜質量記為W0。自發乳清析出=（W1-W2）/（W1-W0）。

④黏度。將水牛奶酸奶樣品于室溫(25℃)下回復一段時間，用玻璃棒順時針、逆時針各攪拌20下，使酸奶樣品均勻，選用4號轉子，轉速100 r/min，測試時間20-30 s，待指針趨于穩定可進行讀數，讀數乘上系數表上的特定系數即為酸奶黏度。

（3）感官指標評定。由本實驗室成員15人組成感官評定小組，并對評定小組成員進行感官分析方法的培訓。評分標準采用百分制[11]。對酸奶樣品的氣味、口感、表觀、以及粘稠度進行打分。評定標準參照表2所示。

表2 酸奶感官評定標準

1.3.3 動物實驗

1.3.3.1 樣品及溶液的制備

發酵乳凍干粉的制備：采用1.3.1的方法制備發酵乳。用凍干機將其水分抽干，制成發酵乳凍干粉。

墨汁的制備：準確稱取阿拉伯樹膠100 g，加水800 mL，煮沸至溶液透明，稱取活性炭(粉狀)50 g加至上述溶液中煮沸3次，待溶液涼后加水至1 000 mL，于4℃冰箱中保存，用前搖勻。

復方地芬諾酯混懸液（0.05 g/100 mL及0.025 g/ 100 mL）的配制：復方地芬諾酯片，每片含復方地芬諾酯2.5 mg，分別取20片（0.05 g/100 mL）、10片（0.025 g/100 mL）用研缽研碎呈粉末后加水至50 mL，臨用前配制。

1.3.3.2 實驗動物分組及處理

所有小鼠按體重進行隨機分組。LYO 50 DCU-S發酵乳的給予劑量設定為3個組，每人（按60 kg體質量計）每日200 mL，相當于3.3 mL/（dkg），分別按人體推薦攝入量的5倍、10倍、30倍設計低、中、高三個劑量組，每天一次經口灌胃小鼠。另設空白對照組、模型對照組和普通發酵乳對照組。

實驗前所有組別小鼠自由攝食飲水，適應性飼養一周后，按以下方式喂養：①空白對照組和模型對照組，均經口灌胃生理鹽水；②普通發酵乳對照組，經口灌胃普通發酵乳；③低劑量組，經口灌胃低劑量含LYO 50 DCU-S發酵乳；④中劑量組，經口灌胃中劑量含LYO 50 DCU-S發酵乳；⑤高劑量組，經口灌胃高劑量含LYO 50 DCU-S發酵乳。小鼠每天上午喂食，動物體重每周記錄一次。

1.3.3.3 小鼠排便實驗[12]

給受試樣品7 d后，各組小鼠禁食不禁水16 h。模型對照組、普通發酵乳對照組和3個劑量組小鼠灌胃給予復方地芬諾酯（10 mg/kg），空白組給予生理鹽水。低、中、高劑量組及普通發酵乳對照組與墨汁等體積混合，給予復方地芬諾酯0.5 h后，空白組和模型對照組小鼠灌胃墨汁2 mL/kg,低、中、高劑量組及普通發酵乳對照組分別給予含受試樣品的墨汁2 mL/kg，動物均單籠飼養，正常飲水進食。從灌胃墨汁開始，記錄每只動物首次排黑便時間。

1.3.3.4 小腸推進實驗[12]

給受試樣品15 d后，各組小鼠禁食不禁水16 h。模型對照組、普通發酵乳對照組和3個劑量組小鼠給予復方地芬諾酯（5 mg/kg），空白組給予生理鹽水。給復方地芬諾酯0.5 h后，低、中、高劑量組及普通發酵乳對照組分別給予含受試樣品的墨汁2 mL/kg（樣品劑量同1.3.3.3節小鼠排便實驗），其他對照組灌胃2 mL/kg。25 min后用頸椎脫臼法處死小鼠。打開腹腔分離腸系膜，剪去上端自幽門，下端至回盲腸部的腸管，置于托盤上，輕輕將小腸拉成直線，測量腸管長度為“小腸總長度”，從幽門至墨汁前沿為“墨汁推進長度”。按下式計算墨汁推進率：

墨汁推進率=墨汁推進長度(cm)/小腸總長度(cm)×100%。

1.3.4 數據分析

采用SPSS 17.0軟件進行數據統計處理，墨汁推進率需進行數據變換[6]。x=sin-1x式中：x為墨汁推進率，結果用百分數表示。在進行方差分析時，需先進行方差齊性檢驗，方差齊后，計算F值，F值＜F0.05，則各實驗組均數間不存在顯著差異；若F值≥F0.05，P≤0.05，表明各組均數之間存在顯著性差異；組間差異比較采用t檢驗。

2 結果與討論

2.1 微生物指標

兩種酸奶樣品在1，7，14，21 d活菌數檢測，結果如表3所示。

由表3可以看出，經4℃冷藏21 d后，樣品1中嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的活菌數與樣品2相比差異不顯著(P＞0.05)，表明在酸奶中添加副干酪乳桿菌LYO 50 DCU-S對商業發酵劑中的菌株生長無影響。副干酪乳桿菌LYO 50 DCU-S的活菌數隨冷藏時間的延長而逐漸增加，在14 d時達到最大值7.65 mL-1（對數值），隨后出現降低，在21 d時為7.54。表明此菌株在酸乳冷藏期間存活能力較強。

表3 水牛奶酸奶在冷藏期間的活菌數(x±s,n=3)

2.2 理化指標

2.2.1 pH值和酸度

由圖1和圖2可以看出，4℃冷藏21 d期間，兩種水牛奶酸奶樣品的pH值隨儲存時間的延長而逐漸降低，而滴定酸度逐漸增高。添加了L.paracasei LYO 50 DCU-S的酸奶樣品中，其pH值和滴定酸度與商業發酵菌株酸乳相比在冷藏期間的差異不顯著(P＞0.05)，可能是由于酸奶樣品發酵時間較短(5 h)，L.paracasei LYO 50 DCU-S在乳中產酸能力較弱的原因，進而表明L.paracasei LYO 50 DCU-S對酸奶冷藏期間的pH值與滴定酸度沒有顯著影響。

圖1 水牛奶酸奶在冷藏期間pH值變化情況

圖2 水牛奶酸奶在冷藏期間酸度變化情況

2.2.2 持水力的變化

持水力是酸奶的重要理化指標之一，它的大小直接影響著酸奶的組織狀態。酸奶持水性越好，在不破乳的情況下更能保持產品的風味和氣味，使產品口感更佳。由圖3可以看出，兩組酸奶樣品都表現出了較好的持水力，含有LYO 50 DCU-S的酸奶樣品2和樣品1差異不顯著（P＞0.05）。

2.2.3 黏度和自發乳清析出率

由圖4和圖5可以看出，兩組樣品的黏度和自發乳清析出在1～14 d冷藏期間逐漸增加，14 d后趨于穩定。PATRICIA[13]等研究表明，一些產胞外多糖（EPS）的益生菌能提高酸奶的質地、增加黏度與凝膠強度、減少乳清析出；在本研究中，添加了LYO 50 DCU-S的酸奶樣品的黏度在冷藏期一直都高于商業發酵菌株樣品，可能是由于本研究所選用的LYO 50 DCU-S菌株在乳中產生了胞外多糖，進而提高了酸奶的黏度、減少乳清析出。

圖3 水牛奶酸奶在冷藏期間持水力變化情況

圖4 水牛奶酸奶在冷藏期間黏度變化

圖5 水牛奶酸奶在冷藏期間自發乳清析出率的變化

2.3 感官評定

由表4可以看出，樣品2感官綜合評分高于樣品1。添加了L.paracasei LYO 50 DCU-S酸奶樣品較商業發酵菌株酸乳樣品，其口感更加細膩、絲滑、黏稠、均勻，由于菌株的互相協同作用，添加了L.paracasei LYO 50 DCU-S酸奶樣品的香氣更加濃郁。

2.4 小鼠體體質量的變化

由表5可以看出，小鼠體重在實驗期間的變化，實驗在小鼠生理常態下進行，各劑量組與各對照組之間比較，不存在顯著性差異（P＞0.05）,表明副干酪乳桿菌LYO 50 DCU-S和商業發酵菌株酸乳在實驗過程中對雄性小鼠體質量沒有影響。

2.5 小鼠排便和小腸推進實驗結果

表4 兩組酸奶樣品感官評定綜合得分(x±s,n=15)

于模型組（P＜0.01）。副干酪乳桿菌LYO 50 DCU-S酸乳各劑量組顯著高于商業發酵菌株酸乳組（P＜0.05）。副干酪乳桿菌LYO 50 DCU-S、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合發酵的水牛奶酸奶可以顯著改善便秘小鼠的排便能力，能對抗復方地芬諾酯引起的腸抑制作用，恢復小鼠的腸推進能力，縮短小鼠首次排便時間，具有潤腸通便作用。同時不同劑量組間還表現出了劑量效應，即隨著灌胃劑量的增加，酸乳對便秘小鼠的通便作用也隨之顯著。

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表5 實驗小鼠體質量變化(x±s,n=10)g

實驗小鼠連續灌胃副干酪乳桿菌LYO 50 DCU-S和商業發酵菌株酸乳7 d后測定對便秘模型小鼠首次排黑便時間的影響，結果如表6所示。

表6 實驗菌株酸乳對便秘模型小鼠排便指標的影響（x±s,n=10）

由表6可以看出，與空白組相比，模型組小鼠首次排黑便時間與其存在極顯著差異（P＜0.01），表明便秘小鼠模型成立。副干酪乳桿菌LYO 50 DCU-S和商業發酵菌株酸乳灌胃7 d后，各劑量組首次排黑便時間與模型組存在顯著性差異（P＜0.05），且各劑量組間存在極顯著差異（P＜0.01）。模型組墨汁推進率極顯著低于空白組（P＜0.01），表明墨汁推進實驗小鼠便秘模型成立。副干酪乳桿菌LYO 50 DCU-S酸乳各劑量組和商業發酵菌株酸乳灌胃15 d后，其各自小鼠小腸墨汁推進率均極顯著高于模型組（P＜0.01）。副干酪乳桿菌LYO 50 DCU-S酸乳各劑量組顯著高于商業發酵菌株酸乳組（P＜0.05）。

3 結論

(1)副干酪乳桿菌LYO 50 DCU-S與商業酸奶發酵劑YO-MIX混合發酵制備水牛奶酸奶，在4℃冷藏21 d，LYO 50 DCU-S對酸奶樣品的商業菌種活菌數、pH值、滴定酸度、持水力等均無不良影響（P＞0.05），且在酸乳中存活力較強；可提高酸奶樣品的黏度，但差異不顯著（P＞0.05）；同時添加LYO 50 DCU-S作為發酵劑可以提高水牛奶酸奶的感官品質。所以LYO 50 DCU-S可作為一種較好附屬菌應用到酸奶生產中。

(2)副干酪乳桿菌LYO 50 DCU-S酸乳各劑量組和商業發酵菌株酸乳灌胃15 d后，其各自小鼠小腸墨汁推進率均極顯著高

Assessment of the quality and laxative effect ofLactobacillus Paracaseiin buffalo milk yogurt

LIU Min,PAN Hongmei,WU Zhishuang,WANG Songmei,FENG Yuemei, YIN Jianzhong,WU Shaoxiong
(Department of Nutrition and Food Science,School of Public Health,Kunming Medical University,Kunming 650500, China)

This study was conducted to evaluate the Laxative effect of lactobacillus paracasei in buffalo milk yogurt and its quality.Lactobacil?lus paracasei,lactobacillus bulgaricus and thermophilic Streptococcus thermophilus were used to ferment buffalo milk.Viable bacteria counts, pH values,acidities,viscosities,sensory indices were tested and recorded in 1 d,7 d,14 d,21 d.In order to explore the improvement of the LYO 50 DCU-S used as a subsidiary starter in the production of milk yogurt,the lactobacillus paracasei,lactobacillus bulgaricus,thermophil?ic Streptococcus thermophiles fermented buffalo milk yogurt was compared with that by YO-MIX(lactobacillus bulgaricus and thermophilic Streptococcus thermophilus).Male Kunming mice were randomly divided into blank group,model control group,control group and three does groups.Constipation model was induced by means of compound diphenoxylate.After 7 days of administration of lactobacillus paracasei in buffalo milk yogurt,the averaged first defecation time of mice was shortened.After another 7 days,the ink propelling rate was significantly increased.The results indicate that the application of Lactobacillus paracasei LYO 50 DCU-S as a subsidiary bacteria in the production of buffalo milk yogurt is feasible,and strain LYO 50 DCU-S can notably improve the laxative effect in constipated mice.

Lactobacillus paracaseiLYO 50 DCU-S;fermentation agent;defecation

TS252.54

A

1001-2230（2017）05-0019-04

2016-09-06

云南省科技計劃項目(2007C0047R)；云南公共衛生與疾病防控協同創新中心資助項目(2016YNPHXT07)。

劉敏（1989-），男，碩士，研究方向為食品營養與健康。

吳少雄