乳酸菌胞外多糖結構及其功能多樣性的研究進展

邸維，張蘭威,，易華西，韓雪

(1.哈爾濱工業大學化工與化學學院，哈爾濱150090；2.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003)

乳酸菌胞外多糖結構及其功能多樣性的研究進展

邸維1，張蘭威1,2，易華西2，韓雪1

(1.哈爾濱工業大學化工與化學學院，哈爾濱150090；2.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003)

從乳酸菌胞外多糖的結構組成與功能特性兩個角度系統地綜述了乳酸菌胞外多糖研究進展，對其主要功能性及其共識性的關鍵結構進行歸納總結，旨為乳酸菌胞外多糖的構效關系研究提供參考。

乳酸菌胞外多糖；結構；功能性；構效關系

0 引言

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）由于其公認安全無毒(generally recognized as safe，GRAS)的特性，在食品工業生產中被廣泛地應用[1]。胞外多糖（Exopoly?saccharides，EPS）作為LAB重要的次級代謝產物，具有獨特的物理化學特性，其功能性也同樣受到了廣泛關注[2-3]。大量的研究表明，將LAB-EPS添加到發酵乳制品中，可以改善或增強乳制品的口感和流變學特性[4]。同時，LAB-EPS在降血壓[5]、抗氧化[6]、抑制腫瘤[7]、增強人體免疫力[8]等方面出現了大量成果，呈現出功能的多樣性。除此之外，對于LAB-EPS的研究從其功能性檢測已經進一步關注到其理化結構特征方面，尤其是決定其功能性的構效關系的研究[9]。

本文從LAB-EPS的結構組成與功能特性兩個角度系統地梳理了當前文獻中提及的主要功能性LAB-EPS的研究成果，并對其構效關系進行歸納總結。

1 乳酸菌EPS的分類、組成和結構

1.1 乳酸菌EPS的分類

根據存在位置的不同，LAB-EPS可以分為兩種：與細胞壁相結合的稱為莢膜多糖（capsular polysaccha?rides，CPS），分泌到培養基中的稱為粘多糖（slime polysaccharide,SPS），但這兩種多糖通常結合在一起很難區分而統稱為胞外多糖[10]。從化學組成的角度，LAB-EPS可以進一步分為同型多糖(homopolysaccha?rides,HoPS)和雜多糖(heteropolysaccharides,HePS)兩種類型[4]。HoPS是由一種單糖組成的EPS，在過去的10年里，HoPS是研究最為廣泛的一類LAB-EPS，包括HoPS的結構特征，產生HoPS的菌株的分離和其生物合成酶的研究，以及HoPS在食品中的應用等[11]。HePS則是由兩個或更多的單糖所組成的3-8個重復單元所構成，而大多數LAB所產生的EPS都是HePS[12]。

1.2 乳酸菌EPS的化學組成和結構測定

通常情況下，碳水化合物和蛋白是EPS的主要組成成分，而一些EPS中還含有脂類、核酸或一些無機成分，這與EPS的分離純化方法和菌株來源密不可分[13]。HoPS的平均分子量通常在107u左右，葡聚糖和果聚糖是HoPS中最常見的兩種成分，通常由一個主鏈和不同分支度的支鏈構成[14]。根據碳元素結合位點的不同，HoPS可以分為α-D-葡聚糖、β-D-葡聚糖和β-D-果聚糖三種類型[15]，主要連接方式和支鏈以及代表菌株如表1所示。

HePS與HoPS相比，化學組成和結構則更為復雜，產量也低于HoPS，分子量在104～106u之間[25]。HePS是由線性或支鏈的重復單元組成，這些單元又由不同的單糖組合構成，例如D-葡聚糖、D-半乳糖或L-鼠李糖。少數HePS中還存在N-乙酰基葡糖胺、N-乙酰基半乳糖胺或葡糖醛酸。此外，一些非糖取代基，如磷酸、乙酰基或甘油同樣存在于HePS中[17]。已知有許多LAB菌種可以產生HePS，例如干酪乳桿菌、鏈球菌、鼠李糖乳桿菌、乳酸乳球菌亞種等[15]。這些菌株所產的EPS大多由等比例的葡萄糖和半乳糖組成[26]。

表1 HoPS的類型、主要連接方式和支鏈以及代表菌株

LAB-EPS的分子量較大且結構復雜，其結構研究多停留在一級結構層面，且由于目前的檢測方法主要涉及甲基化和核磁共振等，對樣品的得率、純度和實驗條件要求較為苛刻，關于其結構研究往往不能得到令人滿意的結果[27]。目前，關于EPS的結構測定涉及傳統化學方法檢測結合現代精密儀器檢測。傳統化學方法的檢測內容包括碳水化合物的含量、蛋白含量、糖醛酸含量、硫酸根含量等的測定。隨著現代精密儀器的快速發展，氣相色譜-質譜聯用、紅外光譜掃描、掃描電鏡、透射電鏡、X射線衍射、核磁共振等技術方法為快速精準化的揭示EPS結構特征提供支撐[28]。

目前的研究成果中已經達成共識的是，分子量、單糖組成、糖苷鍵連接類型、化學基團等因素是影響EPS是否具有功能性的決定因素[29]，但對于何種結構決定何種功能的研究則相對較少。目前，關于LAB-EPS構效關系的研究主要停留在對個別EPS的選擇性修飾的個例研究，選擇性修飾即通過硫酸化、乙酰化或磷酸化等衍生形式形成衍生糖，通過對EPS官能團的改造，如氧化、降解、硫酸酯化等提高或降低多糖的功能性[30]。

2 乳酸菌EPS的功能多樣性及構效關系

LAB-EPS的功能性分析通常通過物理學特性和生物學特性兩方面進行研究[31]。其中，物理學特性以流變學特性為主，包括測定LAB-EPS對乳制品及其他食品的酸度、黏度、硬度、保水性能及質構分析等指標的改善作用[32]。主要研究對象為傳統發酵食品中獲得的LAB菌株所產的EPS，如嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、德式乳桿菌等發酵乳中所產EPS[33]。除以上物理特性外，LAB-EPS還具有多種生物學特性，不僅可以作為益生素，在抗腫瘤、抗氧化、免疫調節等方面的生物活性也被相繼報道[34]。主要研究對象在傳統發酵菌株所產EPS的基礎上，逐步向干酪乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌等益生菌方面發展[15]。

近年來，有關EPS的研究重心則轉移到EPS的結構組成測定與功能性研究相結合方面[2,35]。但目前為止，有關LAB-EPS在這方面系統性的研究相對較少，大多數研究都停留在單一測定結構組成或功能性檢測方面[27]。但目前研究已經達成共識的是，分子量、單糖組成、糖苷鍵連接類型、化學基團等因素是影響EPS是否具有功能性的決定因素[24]，但對于何種結構決定何種功能的研究則相對較少。關于LAB-EPS構效關系的研究主要停留在對個別EPS的選擇性修飾的個例研究，選擇性修飾即通過硫酸化、乙酰化或磷酸化等衍生形式形成衍生糖，通過對EPS官能團的改造，如氧化、降解、硫酸酯化等提高或降低多糖的功能性[29]。

2.1 物理特性及構效關系

LAB具有公認安全無毒的特性，已被廣泛的應用于食品工業中以延長保藏期，賦予食品更高的營養價值并增強感官特性[27]。由于LAB所產的EPS具有較高的持水能力以及可以增強黏度等特性，可以被直接添加到發酵食品中，且研究表明LAB-EPS可以有效的改善酸奶、奶酪和面包等發酵食品的物理結構和感官特性[36]。而乳制品的流變性與EPS的結構，例如分子量、分支度和電荷等密不可分[14]。

Yang等人[37]提取了一株嗜熱鏈球菌S1的EPS，按不同比例添加到水牛酸乳中，結果顯示，當添加量為0.01%時酸乳的硬度和黏度均達到最大值；隨著EPS添加量的繼續增加，以上兩項指標均呈下降趨勢，但都大于未添加EPS的酸乳樣品，分析結果指出此現象可能與EPS的網狀結構有關。之前有研究表明，EPS與酪蛋白膠粒的聚合作用也是引起添加EPS的酸乳在質構上發生變化的原因之一[38]。Prasanna等人[39]從22株人源雙歧桿菌中篩選出4株高產EPS的菌株，發酵乳表觀黏度和pH值的相關性分析表明，牛奶酸化過程中這4株菌產生的EPS有助于增強乳制品的黏度。李全陽等人[40]分離得到了一株高產EPS的嗜熱鏈球菌株，并對其糖鏈結構進行了解析，研究結果表明，該LAB-EPS主鏈上的α-1,3糖苷鍵和α-1,6糖苷鍵以及部分支鏈上的α-1,3糖苷鍵等結構特點都可能賦予它良好的增稠性和穩定性。

此外，隨著現代精密儀器的開發和利用，EPS的表面形態學觀察是近年來研究的創新領域，通過掃描電鏡或透射電鏡拍攝EPS的表面拓撲圖有助于進一步揭示功能性EPS的表面結構表征等物理學特性[41]。通過掃描電鏡所獲得的EPS表面拓撲圖可用于觀察EPS的原始形態和分子結構[28]，而分子結構在一定程度上影響著EPS的功能性。因此表面形態學觀察有助于分析具有相似表面形態和分子結構的EPS是否具有相似的功能性。Ahmed等人[42]通過掃描電鏡觀察從開菲爾ZW3菌株中分離出的EPS的表面形態，結果顯示該EPS具有良好的物理穩定性。Saravanan等人[43]對明串珠菌KC117496的EPS進行結構穩定性研究，掃描電鏡結合X射線衍射等結果表明，該EPS具有良好的機械穩定性，從而能保證其可以良好的應用于食品工業生產中。

2.2 生物活性及構效關系

2.2.1 抗腫瘤活性

自1982年ShiomiM研究發現EPS具有抗腫瘤活性后[44]，國內外學者便對EPS的抗腫瘤研究產生了濃厚的興趣。例如，Patricia等人[17]報道，通過向荷肉瘤小鼠體內注射乳酸乳桿菌乳脂亞種KVS20產生的EPS，發現產生了抗癌作用，而注射僅含KVS20菌體的小鼠體內并未發現有此效果。Liu等人[45]比較研究了干酪乳桿菌01的熱處理細胞、細胞壁、細胞內容物和EPS四個組分對HT-29細胞的體外抑制作用，結果表明，EPS對結腸癌細胞的抑制作用高于其他三個組分。

在研究抗腫瘤活性的基礎上，Wang等人[2]分離純化了一種由植物乳桿菌YW32分泌的EPS，通過MTT法測定當EPS濃度為600 μg/mL，作用時間為72 h條件下，該EPS對HT-29人結腸癌細胞的體外抑制率為39.24%；結構檢測結果表明該EPS的分子量為1.03× 102ku，主要由甘露糖、葡聚糖和葡萄糖以8.2∶4.2∶4.1的比例構成。而另外一株植物乳桿菌所產的EPS在相同條件下對HT-29細胞的抑制率為88.34±1.97%，該活性EPS的分子量為1.69×102ku并主要由半乳糖組成，其主要連接方式包括51.4%的(1→4)-半乳糖主鏈以及10.7%的(1→)-半乳糖糖苷鍵連接的末端[9]。Di等人[35]報道了由干酪乳桿菌SB27所產的兩個均一EPS組分具有顯著的體外抗腫瘤活性，在作用時間72h，EPS濃度為600 μg/mL時，對HT-29人結腸癌細胞的抑制率分別為77.19±3.56%和70.87±0.12%，且兩個EPS組分的分子量分別為25.10、12.34 ku，具有相似的單糖組成和主要連接方式，都主要由半乳糖和葡萄糖構成，連接方式為(1→4)-半乳糖和(1→4)-葡萄糖。

分子量、單糖組成以及EPS的糖苷鍵構型都可能影響其抗腫瘤活性的強弱[35]。基于對近年來的研究成果的梳理，表明分子量相對較低，由半乳糖和葡聚糖構成，主鏈中含有(1→4)-半乳糖或(1→4)-葡萄糖的LAB-EPS可能具有更強的抗腫瘤活性。

2.2.2 抗氧化活性

Guo等人[46]從乳酸乳球菌乳酸亞種菌株中分離提取了EPS，對其抗氧化活性進行了系統性地研究，體外實驗結果表明該EPS可以清除超氧陰離子和羥自由基；同時，體內實驗結果表明該EPS可以降低小鼠肝臟和血清中丙二醛的含量，并增強過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性。

在研究抗氧化活性的基礎上，Kanmani等人[47]研究發現乳酸鏈球菌PI80代謝產生的EPS分子量為2.8×102ku，體外抗氧化活性研究表明，該EPS對羥自由基和超氧陰離子具有較強的清除能力。Zhang等人[48]對從植物乳桿菌C88中分離得到LCP-1-EPS組分的體外抗氧化活性進行研究，結果發現該EPS可以清除氧自由基，并具有提高抗氧化酶活性及降低脂質過氧化反應等功能；初步結構測定結果表明，該EPS分子量為1.15×103ku，由半乳糖和葡萄糖以1∶2的比例組成。Li等人[49]從瑞士乳桿菌MB2-1中分離得到粗EPS，并對該EPS進一步純化得到3個均一的EPS組分，比較4種EPS的體外抗氧化活性的結果表明，它們對亞鐵離子的自由基和螯合活性都有較強的清除作用，且3個均一的EPS組分都主要由半乳糖和葡萄糖按不同比例構成。

研究發現，過氧化與腫瘤細胞的生成和惡性轉移密切相關[50]。因此EPS的抗氧化活性與抗腫瘤活性也存在相互聯系，具有高水平抗氧化作用的EPS通常也具有一定的抗腫瘤活性，這可能是因為決定其相關功能性的特定結構相似[2]。

2.2.3 免疫調節活性

據報道，LAB-EPS具有免疫激活作用，可以提高T、B淋巴細胞的增殖能力、誘導細胞因子產生、并激活巨噬細胞的吞噬能力等[51]。此外，其活性基團（例如，磷酸基團、硫酸基團等）在激活巨噬細胞和淋巴細胞方面也發揮了重要的作用[25]。顧笑梅[7]從堅韌腸球菌Z222的發酵液中分離提取了EPS-1組分，并將該EPS用于治療荷肉瘤S180的小鼠，發現其能增強免疫力低下的荷肉瘤小鼠的免疫功能；體外細胞免疫試驗進一步表明EPS-1對小鼠免疫細胞具有調節作用。Guo等[46]分離了一株乳酸乳球菌所產的EPS并制備了硒化EPS，比較分析兩種EPS在免疫缺陷型小鼠體內的免疫活性，結果表明，兩者都可以提高小鼠巨噬細胞的吞噬功能，增強脾臟、胸腺指數和總補體溶血活性，并且硒化EPS表現出了更強的免疫活性。

Kitazawa等人[52]研究發現，保加利亞乳桿菌OLL1073R-1產生的中性和酸性EPS，其中酸性EPS對幼鼠B淋巴細胞的有絲分裂具有促進作用；隨后Makino[53]純化了該酸性EPS并進一步進行體內免疫活性實驗，結果表明，純化后的高分子量酸性EPS可以明顯增加干擾素γ的產生，并對小鼠脾細胞中NK細胞的活性具有增強作用；結構測定結果顯示，該活性高分子量酸性EPS主要由D-葡萄糖、D-半乳糖和磷酸基團組成。Kang等[54]發現一株副干酪乳桿菌KB28合成的EPS能夠誘導小鼠體內巨噬細胞中TNF-α、IL-6和IL-12等細胞因子的表達，該EPS主要由葡萄糖、半乳糖和甘露糖組成。Patten等人[55]從瑞士乳桿菌中分離純化出均一的EPS組分，體外免疫活性實驗結果表明該EPS可以顯著增加細胞因子IL-8的產生并可以差異調節Toll受體的mRNA表達量；單糖組成分析證明該EPS主要由D-葡萄糖、D-半乳糖和N-乙酰-D-甘露糖胺以2∶2∶1比例組成，1維和2維核磁共振分析表明該活性EPS主要由1,3, 4-α-D-半乳糖、1,4-β-D-葡萄糖和β-D-葡萄糖還原性末端等糖苷鍵連接構成。

EPS的免疫活性能力因LAB菌株屬性的差異而有所不同，這種差異對活性EPS的結構也有影響[56]。例如，酸性LAB-EPS的組成中具有磷酸根基團，因此大多能夠誘導免疫應答。相比之下，高分子量的HePS卻成為免疫反應的抑制因子，但有研究表明，與天然高分子量EPS相比，在合成基因中敲除突變體基因后的EPS卻更能有效的誘導TNF-α、IL-12、IL-10和IL-6等細胞因子的產生[4,57]。因此，LAB-EPS的免疫活性同樣與分子量、活性基團、單糖組成等結構因素有關，分子量較低、含有磷酸根或硫酸根等活性基團、單糖組成中主要由葡萄糖或半乳糖組成的EPS則更有可能具有免疫活性。

2.2.4 其他生物活性

Wu等人[58]研究發現長雙歧桿菌BCRC-14634產生的EPS不僅可以作為免疫調節劑，還可以用于抑制食品腐敗，當EPS的質量濃度達到80 μg/mL時，可顯著抑制7種導致食物腐敗的致病菌的活力。Vin?derola等人[59]發現一株從馬奶酒中分離得到的馬奶酒乳桿菌所產的EPS不僅可以誘導IL-4、IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α等細胞因子的產生，同時具有抗菌、促進傷口愈合以及抑制腫瘤生長等作用。Ai等人[5,9]系統性的報道了從干酪乳桿菌分離出的LCP1-EPS具有顯著的降血壓作用，單糖測定結果表明LCP1-EPS主要由葡萄糖（57.8%）、甘露糖（27.7%）和半乳糖（14.5%）組成，甲基化分析顯示該EPS的主要連接方式為16.3%的（1→4）-葡萄糖、15.7%的（1→3）-鼠李糖、11.9%的（1→2，6）-半乳糖和21.7%的（1→）-半乳糖還原性末端組成。

LAB-EPS的功能性并不是單一的，一種EPS可能具有多種不同的功能活性，而不同EPS的功能性作用機制可能是相同的，例如抗腫瘤、抗氧化、抗菌等生物活性都同EPS非特異的免疫增強有關[60]。

3 結束語

由于LAB和其所產的EPS具有潛在的健康益處和經濟效益，可以作為天然、安全的食品添加劑或功能性食品配料，因此在食品工業生產中具有重要的應用前景。目前，對于LAB-EPS的結構和功能方面的研究已經取得了一些進展,然而對其構效關系的研究仍然存在欠缺，需要在今后的研究中進行深入探討。目前該研究應主要聚焦在以下兩方面的內容:(1)具有良好物理特性和抗腫瘤、抗氧化等功能性EPS的詳細結構表征；(2)功能性EPS基因簇的研究。這一領域的研究將對LAB和LAB-EPS的開發應用具有重要的研究意義。

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Research advances on structure and diversity function of exopolysaccharides produced byLactic acid bacteria

DI Wei1,ZHANG Lanwei1,2,YI Huaxi2,HAN Xue1
(1.School of Chemistry and Chemical Engineering,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China;2.College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

This paper reviewed the research advances on exopolysaccharides(EPSs)produced by lactic acid bacteria(LAB)from two aspects of the structure and functional properties.The main function of LAB-EPSs and its key structure of consensus were summarized,in order to provide references for researching on the structures related with functions of LAB-EPSs.

Lactic acid bacteria;exopolysaccharides;functional;structures related with functions

Q935

B

1001-2230（2017）05-0032-06

2016-09-28

國家自然科學基金（31271906）。

邸維（1986-），女，博士研究生，研究方向為食品科學與工程。

張蘭威